KINETIKA ENZIM AMILASE PADA EKSTRAK UBI

Astiyani1 Artika El Sonia2 Muhamad Cartoyo3 Natasha Krisna Amalia4 Rafi

Ashari5 Shaila Rismayaningrum6
Kelompok 2
Prodi Pendidikan Teknologi Agroindustri, Fakultas Pendidikan Teknologi dan
Kejuruan, Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung
ABSTRACT
Amylase couldnt be acquired from many resources; animals,
microorganism and plants (Anam, 2010) one of the plants that contain amylase
was sweet potato. There were some enzymes which sweet potato has that wa amylase, -amylase and fosforilase which is distributed its tissue. The purpose of
this research was to know the value of Km and the Vmax of amylase from the
extract of sweet potato by using the maltose standard curve with DNS methods.
Then, this research used some variation of amylum substrate concentration which
are 0,5%, 1%, 1,5%, and 2%; also, some different incubation time that is 0, 10,
15, 20, 25 and 30 minutes. Moreover, this research also used absorbance
calibration with spectofotometer 540nm. The concentration of the substrate and
the incubation times would influneced the product. The value of Km and Vmax
was acquired by using the Linewaever-Bunk methods. Consequently, the value of
the Km was 2,64% and the Vmax was 0,00197mg/ml. The value of Km and Vmax
couldnt be compared completely because of the difference either on the isolation
process or the condition of the examination and the substrate of the enzyme.
Keyword: Amylase, Km and Vmax, Standard Curve
ABSTRAK
Enzim amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti binatang,
mikroorganisme dan tanaman (Anam, 2010). Salah satu tanaman yang
mengandung enzim amilase adalah ubi jalar. enzim yang terdapat dalam ubi jalar
yaitu -amilase, -amilase, dan fosforilase yang terdistribusi dalam jaringan umbi
ubi jalar. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui nilai Km dan Vmax
enzim amylase dari ekstrak ubi jalar dengan kurva standar maltose dengan metode
DNS. Pada penelitian ini menggunakan beberapa variasi substrat amilum 0,5%,
1%, 1,5% dan 2% serta berbagai waktu inkubasi yaitu pada 0, 10, 15, 20, 25 dan
30 menit serta peneraan absorbansi dengan spektrofotometer panjang gelombang
540 nm. Konsentrasi substrat dan waktu inkubasi enzim akan mempengaruhi

produk yang dihasilkan. Nilai Km dan Vmax diperoleh dengan menggunakan

metode Lineweaver- Burk, diperoleh nilai Km 2,64% dan nilai Vmax 0,0197mg/ml.
Nilai Vmax dan Km, tidak sepenuhnya dapat dikomparasikan karena berbeda dalam
proses isolasi maupun kondisi pengujian dan juga substrat enzimnya.
Kata Kunci : Amilase, Km dan Vmax, Kurva Standar
PENDAHULUAN
Enzim amilase merupakan biokatalisator yang mempercepat jalannya reaksi
tanpa ikut bereaksi. Amilase mengkatalisis reaksi hidrolisis pati menjadi gulagula sederhana. Contohnya enzim -amilase dan -amilase akan mengubah
karbohidrat polisakarida menjadi maltosa. Enzim amilase dapat diperoleh dari
berbagai sumber seperti binatang, mikroorganisme dan tanaman (Anam, 2010).
Salah satu tanaman yang mengandung enzim amilase adalah ubi jalar. Ubi jalar
(Ipomoea batatas L) merupakan salah satu hasil pertanian yang tinggi kandungan
karbohidratnya dan sebagai sumber kalori, sumber vitamin (A, C, B1, dan B2),
sumber mineral (Fe, P, dan Ca) serta mengandung serat kasar (Muchtadi dkk,
2010). Menurut Hagenimana et al (1992) beberapa enzim yang terdapat dalam ubi
jalar yaitu -amilase, -amilase, dan fosforilase yang terdistribusi dalam jaringan
umbi ubi jalar.
Nilai Km (konstanta Michaelis) dan Vmax (kecepatan maksimum reaksi)
merupakan dua parameter kinetika enzim. Nilai Km didefinisikan sebagai
konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah dari kecepatan
maksimumnya (Bahri dkk, 2012). Sedangkan menurut Risma (2012) nilai Km
menggambarkan konsentrasi substrat ketika setengah sisi aktif enzim terisi penuh.
Nilai Vmax merupakan kondisi dimana kecepatan reaksi enzimatis tidak dapat
bertambah lagi dengan bertambahnya konsentrasi substrat (Wiesman, 1989 dalam
Putra dkk, 2010).
Nilai Km dan Vmax yang diketahui, dapat dijadikan acuan untuk menghitung
kecepatan reaksi suatu enzim pada setiap konsentrasi substrat. Hampir semua
reaksi enzimatik, termasuk reaksi dengan dua atau lebih substrat dapat dianalisa
secara kuantitatif dengan teori Michaelis-Menten (Soeka, 2010). Nilai Km dan
Vmax dapat ditentukan dengan menggunakan grafik yang dirancang oleh

Lineweaver-Burk (Risma, 2012). Oleh karena itu pada praktikum kali ini
dilakukan pengujian untuk mengetahui kinetika enzim amilase pada ekstrak ubi
jalar dengan melakukan perhitungan Km dan Vmax dengan variasi substrat dan
waktu inkubasi.
METODE PRAKTIKUM
Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum kinetika enzim amilase pada
ekstrak ubi ini adalah substrat amilum dengan variasi 0,5%, 1%, 1,5% dan 2%,
laruran buffer pH 5 (50Mm), aquades, reagen DNS, ekstrak enzim kasar dari ubi
jalar serta air es.
Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum kinetika enzim amilase pada ubi ini
adalah tabung reaksi ulir, rak tabung reaksi, mikropipet, pipet ukur, vortex, gelas
beker, kompor listrik, water bath, baskom, petunjuk waktu, label kecil, tissue,
kuvet, spektrofotometer dan laptop.
Prosedur Kerja
Dalam praktikum kali ini tentang kinetika enzim amilase pada ekstrak ubi
dengan penentuan Km dan Vmax. Pada praktikum kali ini menggunakan beberapa
variasi substrat amilum 0,5%, 1%, 1,5% dan 2% serta berbagai waktu inkubasi
yaitu pada 0, 10, 15, 20, 25 dan 30 menit. Penentuan nilai Km dan V max ini
dilakukan dalam beberapa tahapan prosedur kerja, sebagai berikut:
1. Pengukuran Jumlah Gula Reduksi
a. Pengukuran Jumlah Gula Reduksi pada Blanko
Untuk pengukuran gula reduksi pada blanko ini adalah memasukan
200 l substrat amilum, 500 l larutan buffer pH 5 (50 mM) dan 200 l
aquades ke dalam tabung reaksi lalu melakukan pre-inkubasi selama 10
menit pada suhu 60oC. Setelah itu, menambahkan larutan DNS sebanyak 1
ml dan 100 l larutan buffer, kemudian menghomogenkan larutan
menggunakan vortex. Selanjutnya memanaskan larutan pada air mendidih
selama 5 menit dan mendinginkanya dengan menggunakan air es selama 5
menit. Setelah itu larutan dihomogenkannya kembali dengan vortex sebelum

dilakukan peneraan. Terakhir adalah melakukan peneraan absorbansi pada

panjang gelombang 540 nm.
b. Pengukuran Jumlah Gula Reduksi menit ke-0
Untuk pengukuran gula reduksi menit ke-0 ini dilakukan secara duplo.
Prosedur kerjanya adalah dengan memasukan 200 l substrat amilum, 500
l larutan buffer pH 5 (50 mM) dan 200 l aquades ke dalam tabung reaksi
lalu melakukan pre-inkubasi selama 10 menit pada suhu 60oC. Setelah itu,
menambahkan larutan DNS sebanyak 1 ml dan 100 l ekstrak enzim kasar
dari ubi jalar, kemudian menghomogenkan larutan menggunakan vortex.
Selanjutnya memanaskan larutan pada air mendidih selama 5 menit dan
mendinginkanya dengan menggunakan air es selama 5 menit. Setelah itu
larutan dihomogenkannya kembali dengan vortex sebelum dilakukan
peneraan. Terakhir adalah melakukan peneraan absorbansi pada panjang
gelombang 540 nm.
c. Pengukuran Jumlah Gula Reduksi menit ke-10, 15, 20, 25 dan 30.
Untuk pengukuran gula reduksi menit ke-10, 15, 20, 25 dan 30 ini
dilakukan secara duplo, prosedur kerjanya adalah memasukan 200 l
substrat amilum, 500 l larutan buffer pH 5 (50 mM) dan 200 l aquades ke
dalam tabung reaksi lalu melakukan pre-inkubasi selama 10 menit pada
suhu 60oC. Setelah itu, menambahkan 100 l ekstrak enzim kasar dari ubi
jalar dan melakukan pre-inkubasi lagi sesuai waktu yang ditentukan (selama
10, 15, 20, 25 dan 30 menit). Kemudian menambahkan larutan DNS
sebanyak 1 ml dan menghomogenkan kembali larutan menggunakan vortex.
Selanjutnya memanaskan larutan pada air mendidih selama 5 menit dan
mendinginkanya dengan menggunakan air es selama 5 menit. Setelah itu
larutan dihomogenkannya kembali dengan vortex sebelum dilakukan
peneraan. Terakhir adalah melakukan peneraan absorbansi pada panjang
gelombang 540 nm.
2. Melakukan Perhitungan
a. Setelah mendapatkan nilai absorbansi pada setiap sampel yang diujikan,
selanjutnya adalah mencari nilai rata-rata absorbansi pada setiap sampel
b. Mencari kadar gula reduksi dari persamaan kurva standar maltosa, y=bx+a
(kurva standar maltosa didapatkan dari praktikum enzim yang pertama).
Perhitungan kadar gula reduksi ini dapat dilihat pada lampiran No. 4,

sehingga didapatkan jumlah maltosa tiap sampel pada berbagai konsentrasi

substrat amilum (nilai Gh)
c. Hasil dari jumlah maltosa yang didapatkan pada setiap konsentrasi substrat
diplotkan ke dalam grafik dengan sumbu Y = Produk Maltosa (mg/ml) dan
sumbu X = waktu inkubasi (menit) (dapat dilihat pada lampiran No. 5)
d. Dari grafik yang telah dibuat diketahui persamaan regresinya, maka dapat
dinyatakan bahwa y =bx+a, dimana b adalah slope dan slope tersebut dapat
dinyatakan sebagai kecepatan reaksi (v) dari masingmasing konsentrasi
substrat. Apabila s adalah substrat (s) dan b adalah kecepatan reaksi (v) dan
dengan pengalihan persamaan MichelisMenten, maka dapat diperoleh 1/s
dan 1/v (dapat dilihat pada lampiran No.6)
e. Hasil dari 1/s dan 1/v yang didapatkan pada setiap konsentrasi substrat
diplotkan ke dalam grafik dengan sumbu Y = 1/v dan sumbu X = 1/s, maka
akan didapatkan persamaan garis y= bx+a.
f. Membandingkan persamaan garis y= bx+a dengan persamaan LineweaverBurk : (1/v=[(Km/Vmax)(1/s)]+1/Vmax) maka dapat diketahui bahwa nilai
a = 1/Vmax dan nilai b = Km/Vmax. Sehingga dari persamaan tersebut
dapat diperoleh nilai Km dan V max (dapat dilihat pada lampiran No. 7).
HASIL DAN PEMBAHSAN
Hasil
Tabel 1. Nilai Km dan Vmax
Vmax
Km

0,0197mg/ml
2,64%

Pembahasan
Pada praktikum enzim yang ketiga yaitu tentang kinetika enzim amilase
pada ekstrak ubi dengan parameternya nilai Km dan V max. Risma (2012) nilai Km
menggambarkan konsentrasi substrat ketika setengah sisi aktif enzim terisi penuh.
Sedangkan nilai Vmax merupakan kondisi dimana kecepatan reaksi enzimatis tidak
dapat bertambah lagi dengan bertambahnya konsentrasi substrat (Wiesman, 1989
dalam Putra dkk, 2010). Nilai Km dan Vmax yang diketahui, dapat dijadikan acuan
untuk menghitung kecepatan reaksi suatu enzim pada setiap konsentrasi substrat.
Untuk mengetahui nilai Km dan Vmax pada saat pengujian dilakukan variasi
substrat amilum dan waktu inkubasi. Variasi substrat amilum yang digunakan

adalah 0,5%, 1%, 1,5% dan 2%. Dan variasi waktu yang digunakan adalah pada
menit ke-10, 15, 20, 25 dan 30.
Konsentrasi substrat yang rendah akan mengakibatkan kecepatan reaksi dari
enzimpun menjadi rendah, sehingga produk yang dihasilkan enzim menjadi
sedikit, tetapi kecepatan ini akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi
substrat, sehingga produk yang dihasilkanpun akan semakin banyak. Laju
aktivitas enzim akan meningkat dengan meningkatnya kadar substrat sampai suatu
titik mencapai batas maksimumnya. Pada batas maksimum enzim jenuh dengan
substrat, penambahan kadar substrat tidak akan berpengaruh pada kecepatan
reaksi (Volk dan Wheeler, 1988). Waktu inkubasi juga berpengaruh terhadap
produk yang dihasilkan oleh enzim, dimana setiap reaksi katalitik enzim
memerlukan waktu tertentu untuk berlangsung secara sempurna. Waktu inkubasi
akan memberikan kesempatan untuk enzim dan substrat bertemu, sehingga waktu
inkubasi yang lama akan menghasilkan produk yang lebih banyak lagi. Akan
tetapi waktu inkubasi yang semakin lama memungkinkan pula aktivitas menjadi
menurun akibat sudah jenuhnya sisi aktif enzim oleh substrat (Putra dkk, 2010).
Nilai Km dan Vmax diperoleh dengan jumlah maltosa yang didapatkan pada
setiap konsentrasi substrat diplotkan ke dalam grafik dengan sumbu Y = Produk
Maltosa (mg/ml) dan sumbu X = waktu inkubasi (menit) (dapat dilihat pada
lampiran No. 5). Dari grafik tersebut persamaan regresinya, dapat dinyatakan
bahwa b dinyatakan sebagai kecepatan reaksi (v) dari masingmasing konsentrasi
substrat. Apabila s adalah substrat (s) dan b adalah kecepatan reaksi (v) dan
dengan pengalihan persamaan MichelisMenten (dapat dilihat pada lampiran
No.6).

dari

grafik

persamaan

MichelisMenten

didapatkan

persamaan

y=133,74x+50,734 dengan membandingkan persamaan garis tersebut dengan

persamaan Lineweaver- Burk, maka dapat diketahui bahwa nilai a = 1/Vmax dan
nilai b = Km/Vmax. Sehingga dari persamaan tersebut dapat diperoleh nilai Km
2,64% dan nilai Vmax 0,0197mg/ml.
Dari beberapa penelitian nilai Km dan Vmax enzim amilase didapatkan hasil
aktivitas a-amilase pada Nocardia no.7 masing-masing 71.10"2%(b/ v) dan 7,62
U/ml/menit sedangkan dari B.cereus didapat nilai untuk Km dan Vm masingmasing 36.102 % dan 89,36 U/ml/menit (kondisi pH 7,0; suhu 40C; inkubasi l0

menit). Nilai Vmax dan Km -amilase TII-12 masing-masing adalah 1,21

mol/menit dan 1,06 mg/ml dari Bacillus stearothermophilus TII-12 (Lestari dkk,
2011). Nilai Vmax dan Km -amilase dari ubi Cilembu masing-masing 51,14
g/mL dan 3,93 mg gula.menit-1 (Carolina dan Fida). Nilai V max dan Km, tidak
sepenuhnya dapat dikomparasikan karena berbeda dalam proses isolasi maupun
kondisi pengujian dan juga substrat enzimnya. Nilai V max dan Km suatu enzim
tergantung pada tingkat kemurnian enzim, jenis substrat, keadaan lingkungan
seperti suhu dan pH juga kekutan ion. Enzim yang murni memungkinkan sisi-sisi
aktifnya dapat bereaksi secara lebih baik, sehingga meningkatkan aktivitasnya
yang berdampak pada penurunan nilai Km. Selain itu enzim yang diisolasi dari
sumber berbeda akan memiliki sifat-sifat berbeda, terutama responnya terhadap
kondisi lingkungan, seperti: suhu, pH dan konsentrasi NaCl optimum untuk
aktivitasnya. Kekuatan ion-ion dari beberapa jenis molekul kecil juga sangat
penting diperhatikan karena akan mepengaruhi mekanisme penghambatan
aktivitas enzim (Putra dkk, 2010).
KESIMPULAN
Dari hasil praktikum enzim tentang kinetika enzim amilase pada ekstrak ubi
dengan parameternya nilai Km dan Vmax dapat disimpulkan bahwa konsentrasi
substrat dan waktu inkubasi enzim akan mempengaruhi produk yang dihasilkan.
Nilai Km dan Vmax diperoleh dengan menggunakan metode Lineweaver- Burk,
diperoleh nilai Km 2,64% dan nilai Vmax 0,0197mg/ml. Nilai Vmax dan Km, tidak
sepenuhnya dapat dikomparasikan karena berbeda dalam proses isolasi maupun
kondisi pengujian dan juga substrat enzimnya.
DAFTAR PUSTAKA
Anam, Khairul. 2010. Kinetika Reaksi Enzimatis. Bogor : Bioteknologi, Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Bahri, Syaiful., dkk. 2012. Karakterisasi Enzim Amilase Dari Kecambah Biji
Jagung Ketan (Zea mays ceratina L.). Jurnal Natural Science, Vol. 1.(1)
132-143

Hagenimana, V., et al. 1992. Distribution of Amylase Within Sweet Ptato

(Ipomeasbatatas) Root Tussue. Journal Agricultaral Food Chemistry Vol. 40.
Lestari, Puji., dkk. 2011. Purifikasi dan Karakterisasi -amilase Termostabil dari
Bacillus stearothermophilus TII-12. Jurnal AgroBiogen 7(1):56-62
Muchtadi, dkk. 2010. Ilmu Pengetahuan Bahan Pangan. Jakarta : Alfabeta.
Putra, G.P. Ganda., dkk. 2010. Karakterisasi Enzim Polifenol Oksidase Biji Kakao
(Theobroma Cacao Linn.). AGRITECH, Vol. 30, No. 3.
Risma, Destrimita. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Enzim -Glukosidase dari
Beras Lapuk (Oryza sativa). Skripsi. Universitas Indonesia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Program S1 Reguler Kimia.
Soeka, Yati Sudaryati. 2010. Optimasi Dan Karakterisasi A-Amilase Dariisolat
Aktinomisetes Yang Berasal Dari Kalimantan Timur. Bidang Mikrobiologi,
Pusat Penelitian Biologi-LIPI.
Volk WA and MF Wheeler. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jilid 1. Diterjemahkan oleh
S Adisoemarto dari Basic Microbiology 5*. Jakarta : Erlangga.

LAMPIRAN
1. Nilai Absorbansi tiap sampel
Nilai blanko = 0,588
Waktu
0
10
15
20
25
30

Ulangan
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2

0,5
0,005
0
0,212
0,146
0,326
0,263
0,294
0,323
0,379
0,4
0,444
0,423

Konsentrasi
1
1,5
0,065
0,068
0,042
0,04
0,332
0,438
0,295
0,481
0,541
0
0,538
0,854
0,701
0,675
0,598
0,644
0,804
1,03
0,52
0,864
0,883
0
0,892
0,948

2
0,098
0,071
0,455
0
0,728
0,729
0,862
0,93
1,219
1,125
1,186
1,35

2. Nilai Rata-rata Absorbansi tiap sampel

Waktu
0
10
15
20
25
30

0,5
0,005
0,179
0,2945
0,617
0,3895
0,4335

konsentrasi
1
1,5
0,0535
0,054
0,3135 0,4595
0,5395
0,854
0,6495 0,6595
0,662
0,947
0,8875
0,948

2
0,0845 Ak
0,455
0,7285
As
0,896
1,172
1,268

3. Persamaan Kurva standar

Persamaan kurva standar maltosa (didapatkan dari praktikum sebelumnya)
yaitu : y=3,9732X-0,0649
4. Kadar Gula Reduksi
Dari persamaan kurva standar maltosa, y=bx+a
Ak = absorbansi menit ke-0
As = absorbansi menit ke-10, 15, 20, 25 dan 30
Kadar gula reduksi awal/menit ke-0 (mg/ml), G k=

( A ka)
b

Kadar gula reduksi akhir/menit ke-10 (mg/ml), G s=

Nilai kadar gula Reduksi
konsentrasi

( A sa)
b

Waktu

0,5
1
1,5
0 0,0176 0,0298 0,0299
10 0,0614 0,0952 0,1320
15 0,0905 0,1521 0,2313
20 0,1716 0,1798 0,1823
25 0,1144 0,1830 0,2547
30 0,1254 0,2397 0,2549
Jadi, kadar gula reduksi akhir Gh = Gs-Gk

Waktu

2
Ket
0,0376 Gk
0,1309
0,1997
Gs
0,2418
0,3113
0,3355

Kadar Gula Reduksi Akhir (Gh)

konsentrasi
0,5
1
1,5
10
15
20
25
30

0,0438
0,0729
0,1540
0,0968
0,1078

0,0654
0,1223
0,1500
0,1532
0,2099

0,1021
0,2013
0,1524
0,2248
0,2250

2
0,0932
0,1621
0,2042
0,2737
0,2979

5. Persamaan Garis Lurus dari Setiap Konsentrasi Amilum

Kurva Hubungan Gh dengan Waktu

0.3500
0.3000
0.2500
0.2000
Nilai Gh
0.1500
(mg/ml)
0.1000
0.0500
0.0000

f(x) = 0.01x
-0
Konsentrasi
0,5
R = 0.98
f(x) = 0.01x + 0.07
Konsentrasi
f(x)
0.01x
+ 0.01 1
R ==0.64
R = 0.93 Konsentrasi 1,5
f(x) = 0x + 0.03
R = 0.34
Konsentrasi 2

Linear (Konsentrasi
0,5)
Linear (Konsentrasi 1)
Linear (Konsentrasi
1,5)
Linear (Konsentrasi 2)

20
0 40
Waktu (Menit)

6. Pengalihan dari Kurva Hubungan Gh dengan Waktu Persamaan

MichelisMenten
Substr
at (s)

(Kecepata
1/s

n) v

1/v
322,58

0,5
1

2,00
1,00

0,0031
0,0064

06
156,25
185,18

1,5

0,67

0,0054

52
96,153

0,50

0,0104

7. Kurva

Kurva Lineweaver-Burk
400
300
1/vo

f(x) = 133.74x + 50.73

R = 0.88

200

Linear ()

100
0
0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

1/so

Dari kurva Lineweaver-Burk didapatkan persamaan

y = 133,74x + 50,734.

Dengan persamaan Lineweaver-Burk (1/v=[(Km/Vmax)(1/s)]+1/Vmax) dapat

diketahui bahwa nilai a = 1/Vmax dan nilai b = Km/Vmax. Sehingga dari
persamaan tersebut diperoleh :
y=133,74x+50,734,
nilai :
Vmax
Km
8. Foto

a= 50,734
1/a=1/50,734
=0,0197
B*Vmax=133,74*0,0197
=2,6361

Larutan yang digunakan

b=133,74
jadi Vmax nya 0,0197mg/ml
jadi Km nya 2,64%

Pemasukan substrat amilum

Pemasukan buffer pH 5

Pemasukan aquades

Proses inkubasi

Pemasukan DNS

Penghomogenan dengan vortex

Pemanasan selam 5 menit

Pendinginan selama menit

Absorbansi

9.

LEMBAR KONTRIBUSI
Semua anggota kelompok berpartisipasi karena penyusunan laporan
praktikum ini dilakukan secara besama-sama dan tidak terpisah-pisah. Setiap
anggota kelompok diwajibkan untuk mencari jurnal yang berhubungan dengan
praktikum kali ini.

Gambar 4. Pemasukan
aquades

Gambar 6.