I.

I.1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Populasi

mikroba

merupakan

populasi

campuran

dari

berbagai

mikroorganisme atau disebut juga biakan campuran. Teknik biakan murni

digunakan untuk memisahkan berbagai macam bakteri tersebut. Untuk dapat
memperoleh biakan murni digunakan beberapa teknik biakan yaitu metode agar
tuang dan metode penggoresan lempengan agar.
Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara,
suubstrat

yang

berupa

bahan

pangan,

tanaman

dan

hewan.

Jenis

mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi

dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam
mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh
koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak
untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang
dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau
untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon.
Mikroba yang ditemukan di suatu lingkungan ditemukan dalam populasi
campuran, sangat jarang sekali yang ditemukan sebagai satu spesies tunggal.
Penelitian mengenai mikroorganisme biasanya memerlukan teknik untuk
memisahkan populasi campuran pada permulaanya, atau biakan campuran,
menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni
terdiri dari suatu populasi sel yang berasal dari satu sel induk. Hal lain yang perlu
diperhatikan adalah pemeliharaan kemurnian isolat selama penyimpanan, agar
produk atau metabolisme suatu mikroba termasuk kapang tetap terjaga.
Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan akan membantu di dalam mengkultivasi,
mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba, karena mikroba memiliki karakteristik
dan ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan pertumbuhannya.
Suatu jenis koloni mikroba yang terpisah dari koloni campurannya akan
lebih mudah untuk diamati. Selain itu teknik untuk memisahkan dan mendapatkan
koloni tunggal serta pemeliharannya terdapat beberapa jenis. Teknik-teknik
tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan. Beberapa cara dapat dilakukan untuk

menentukan jumlah bakteri yang terdapat pada bahan pemeriksaan. Cara yang
paling sering digunakan adalah cara penghitungan koloni pada lempeng
pembiakan (plate count), atau juga dapat dilakukan penghitungan langsung secara
mikroskopis. Oleh karena itu, untuk mempelajari teknik isolasi, pemurnian
mikroba, serta keuntungan dan kelemahannya, maka praktikum Isolasi dan
Pemurnian Mikroba, Teknik Pemeliharaan Kultur Murni penting untuk dilakukan.
Mikroroganisme di alam terdapat dalam bentuk kumpulan sel yang disebut
koloni. Untuk mempelajari pembiakan organisme tersebut kita harus mempelajari
teknik isolasi. Isolasi adalah suatu teknik yang dipergunakan utnuk memisahkan
suatu koloni dari biakan campuran.
I.2

Teori Dasar
Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini sangatlah besar

dan cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita.
Terdapat dalam jumlah yang cukup besar, sebagai contoh sekali kita bersin dapat
menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme (Pelczar, 1988).
Teknik isolasi mikroba adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba
diluar dari lingkungan alamiahnya. Mikroorganisme dapat diperoleh dari
lingkungan air, tanah, udara, substrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan
hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, jamur, kapang dll.
Populasi mikroba di lingkungan sangat beranekaragam sehingga dalam
mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh
koloni tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk
suatu tujuan penelitian misalnya untuk mengisolasi DNA mikroba yang dapat
mendeteksi mikroba yang telah resistem terhadap suatu antibiotik.atau untuk
mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).
A.

Isolasi bakteri, kapang, dan khamir

Ada beberapa jenis cara Isolasi bakteri, kapang, dan khamir yang bisa

dilakukan yaitu dengan cara pengenceran, metode gores dan agar tuang.
1. Cara pengenceran (dilution method), tujuan dari teknik ini pada prinsipnya
adalah untuk melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam
air sehingga lebih mudah penanganannya. Sampel yang telah diambil

kemudian disuspensikan dalam aquades steril. Teknik pengenceran sangat

penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua metode
perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti TPC (Total
Plate Count) (Anonim, 2012).
Tujuan dari pengenceran yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba
yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
(Anonim, 2012 )
2. Metode gores atau disebut juga dengan teknik streak plate (lempeng gores)
adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media
agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar dengan jarum ose
yang telah diinokulasikan dengan kultur bakteri (Anonim, 2006). Prosedur
pembuatan metode ini yaitu sampel dibuat suspensi, lalu diambil dengan jarum
inokulasi dan digoreskan pada medium cawan petri dengan pola tertentu
sehingga koloni-koloni yang tumbuh terpisah satu dari yang lainnya dan dapat
diisolasi lebih lanjut. Terdapat beberapa jenis pola goresan yang biasa
digunakan dalam proses penginokulasian mikroorganisme, yaitu goresan
langsung, goresan kuadran dan goresan radian. Setelah isolasi bakteri selesai,
cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30-320C selama 2-3
hari. Selama inkubasi sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk
koloni yang dapat terlihat langsung dengan mata. Penginkubasian dalam posisi
terbalik ini bertujuan agar ketika pada cawan petri terbentuk uap air, air
tersebut tidak menetes pada koloni sehingga merusak koloni yang kemudian
akan tumbuh.
3. Metode Tuang (pour-plate method) terdiri atas penginokulasian biakan
campuran kedalam tabung uji yang mengandung agar mencair yang telah
didinginkan pada suhu 450C, isinya diaduk untuk memencarkan bakteri
keseluruh medium. Campuran itu kemudian ditungkan kedalam cawan petri
steril dan dibiarkan padat pertumbuhan koloni terjadi baik dalam medium
tujuan pada kedua proses ialah untuk memisahkan bakteri satu sama lain
sehingga sel-sel itu akan tumbuh menjadi koloni-koloni yang terpisah didalam
medium yang padat. Kemudian dapat diambil sel-sel dari satu koloni untuk
mendapatkan biakan murni.

B.

Pemeliharaan Kultur Cair

Pemeliharaan kultur cair adalah penyimpanan dan pemeliharaan kultur cair

dengan menumbuhkan suatu kultur mikroorganisme dalam suatu medium cair

dengan suhu dan waktu inkubasi tertentu, tergantung pada jenis mikroorganisme.
Kultur cair biasanya tidak tahan lama, maksimal 2 minggu karena kultur cair
rentan terhadap kontaminasi. Pemeliharaan kultur cair ini yang diamati adalah
karakteristik kekeruhannya. Tiap mikroorganisme memiliki karakteristik turbiditas
(kekeruhan) yang berbeda-beda. Ada diantara mikroorganisme yang membentuk
partikel melayang (flocculent) di dalam media broth, ada yang tersedimentasi,
melayang di permukaan saja (pellicle) dan ada pula yang melayang di permukaan
berbentuk seperti cincing (ring) (Anonim, 2006).
C.

Pemeliharaan Kultur Padat

Pemeliharaan kultur padat adalah menumbuhkan suatu kultur
mikroorganisme dalam suatu media padat (dengan menggunakan agar), baik
dengan metode agar cawan, agar miring maupun agar tegak.
1. Metode agar miring adalah kultivasi biakan mikroba ke dalam medium agar
yang dibekukan dalam posisi miring di dalam tabung reaksi untuk melihat
karakteristik koloni bakteri yang tumbuh (Anonim, 2006). Pada saat
mengoleskan sampel pada agar, jangan sampai merusak agarnya.
Pengolesan hanya dilakukan pada permukaannya saja, agar tegak biasanya
hanya bisa dipakai maksimal selama 1 bulan.
2. Agar tegak digunakan untuk membiakkan mikroorganisme yang bersifat
aerobik. Agar tegak biasanya dapat dipakai maksimal selama 1,5 bulan, cara
pembuatan agar tegak ini sama seperti pada pembuatan agar miring.
Perbedaannya adalah agar tidak dibekukan dalam posisi miring, tetapi
posisinya tegak dalam tabung reaksi.

II.

ALAT DAN BAHAN

II.1

Alat

II.2

Autoklaf
Cawan petri
Erlenmeyer
Gelas objek
Gelas ukur
Inkubator
Pipet
Spritus (Bunsen)
Timbangan
Bahan

Air mineral
Alkohol
Cendol
Jahe bubuk
Kunyit bubuk
Kapas
Kertas sampul
Larutan pengencer
Roti
Tepung beras

III. PROSEDUR KERJA

3.1 Isolasi Bakteri Kapang dan Khamir
a. Persiapan suspensi sampel
1. Sampel dipersiapkan (air mineral, kunyit bubuk, roti, tepung beras, cendol
dan jahe bubuk)
2. Ditimbang 5 gram sampel padat
3. Dimasukkan sampel kedalam tabung yang berisi air destilat atau larutan
pengencer steril
4. Kemudian dihomogenkan
b. Pengenceran
1. Diambil 1 ml suspensi dan dimasukkan dalam 9 ml larutan pengencer
2. Diambil 1 ml dari larutan pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam
larutan pengenceran 10-2
3. Diulangi dengan perlakuan yang sama hingga 10-5
c. Metode tuang
1. Dimasukkan 1 ml sampel hasil pengenceran 10-4 dan 10-5 ke dalam cawan
petri
2. Ditambahkan medium yang berupa PDA dan NA sampai dasar cawan
tertutup
3. Digerakkan cawan petri membentuk angka 8 di atas meja dan tunggu
hingga membeku
4. Cawan petri dibungkus dalam keadaan terbalik
5. Diinkubasi
6. sampel selama 2 hari dalam suhu 30-32C
d. Metode gores
1. Dituangkan medium PCA ke dalam cawan petri sampai dasar cawan
2.
3.
4.
5.
6.
7.

petri tertutup
Ditunggu hingga medium membeku
Ose difiksasi
Diambil sampel menggunakan ose
Dibuat goresan di atas agar (langsung, kuadran atau radian)
Dibungkus cawan petri dalam keadaan terbalik
Sampel diinkubasi selama 2 hari dalam suhu 30-32C

3.2 Pemeliharaan kultur cair

1. Disiapkan medium laktosa broth steril, kemudian dimasukan sebanyak

10 ml ke dalam tabung reaksi steril
2. Dia ambil1 loop (ose) kultur murni (hasil isolasi sebelumnya),
dimasukan kedalam medium laktosa broth
3. Di inkubasi pada suhu 30-320C selama 48 jam
4. Diamati pertumbuhan mikroorganisme

3.3 Pemeliharaan kultur padat

a. Agar miring
1. Disiapkan Medium NA, dimasukan kedalam tabung reaksi steril
2. Medium didinginkan dengan posisi tabung reaksi dimirigkan
3. Dilakukan inokulasi kultur murni pada permukaan medium agar
miring

dengan

cara

menggoreskan

(streak)

secara

zig-zag

menggunakan ose
4. Diamati pertumbuhan mikroorganisme
b. Agar tegak
1. Disiapkan Medium NA, dimasukan kedalam tabung reaksi steril
2. Dilakukan inokulasi kultur murni dengan cara loop ditusukan pada
bagian tengah tabung (stab)
3. Kultur diinkubasi pada suhu 30-320C selama 48 jam
4. Diamati pertumbuhan mikroorganisme