MENENTUKAN PEWARNA MAKANAN SINTESIS

DALAM PRODUK IKAN DENGAN METODE

HPLC-DAD
ABSTRAK

metode yang dipercatya untuk menhitung pewarna makanan

sintesis yang larut dalam air pada matriks makanan yang kompleks yang
saat ini tidak tersedia. Penelitian ini menejelaskan pengembangan dan
validasi peningkatan protokol untuk analisis pewarna makanan sintesis
pada matriks makanan kompleks yang menyajikan protein tinggi dan
kandungan lmak yang tinggi. Metode yang dikembangkan menggunakan
yahap ekstraksi dan selanjutnya diikuti dengan sonikasi , sentrifugasi dan
tahap konsentrasi. Dalam proses pembersihan via SPE pada poliamida
kartrid juga digunakan pewarna yang terisolasi terpisah dan dianalisis oleh
RP-HPLC sistem DAD . perolehan tinggi dan konsisten (min. 81%) dan SD
rendah (max. 6%) dicapai untuk mempelajari semua pewarna. Persoalan
matriks kandungan lemak yang tinggi juga ditujukan untuk penambahan
tahapan kandungan lemak pada prosedur. Secara keseluruhan protokol
disajikan untuk menunjukkan presisi yang tinggi dan akurasi deteksi dan
dapat memberikan dasar bagi pembangunan masa dean dengan metode
yang sama dalam matriks makanan yang kompels.

1. PENDAHULUAN
warna yang telah ditambahkan pada makanan untuk meningkatkan
daya tarik penglihataan pada ratusan tahun tahun yang lalu. dalam
industri makanan berkembang pada abad ke-19 berbagai pewarna sintesis
yang digunakan, tapi masalah selama toksisitas aditif ini telah
menyebabkan pengembangan legislasi yang mengatur jenis dan jumlah
pewarna sintetis dalam produk makanan yang berbeda. Sebagai hasil dari
upaya ini, saat ini ada di Uni Eropa (UE) mengatur kerangka peraturan
peraturan per undang-undangan tentang pengendalian penggunaan
warna aditif dalam makanan (Directive EC, Peraturan EC). Masih tingkat
yang direkomendasikan dari pewarna ini tidak didefinisikan dengan baik
dan bukti baru dari in vitro dan in vivo telah disajikan mengenai kedua
karsinogenisitas dan genotoxicity untuk beberapa zat ini (EFSA Journal).
Selain itu, teknik dan protokol yang digunakan untuk penentuan pewarna
tersebut dalam matriks makanan yang kompleks tidak cukup kuat, dan
perlu perbaikan yang lebih lanjut. Penentuan yang akurat dan terpercaya
dari pewarna sintetis dalam matriks makanan yang berbeda adalah sangat
penting untuk memastikan keselamatan dan ketetapan dengan aturan.
Banyak teknik analisis telah dikembangkan untuk identifikasi dan
kuantifikasi berbagai pewarna sintetis makanan, seperti kromatografi
spektrometri, lapisan tipis (TLC), voltametri serap, dan diferensial
kromatografi pulsa. Namun, semua hadir dengan kelemahan utama
karena mereka memerlukan dan memakan waktu yang lama dan
perawatan yang luas dan tidak dapat diterapkan untuk campuran pewarna
kompleks. Untuk mengatasi keterbatasan ini, penggunaan elektroforesis
kapiler (CE) dan kromatografi ion (IC) teknik telah diusulkan sebagai
alternatif. Namun, volume injeksi kecil digunakan dalam teknik-teknik dan
latar belakang yang bising, hasil sensitivitas masalah membatasi
kekokohan metode ini. Kinerja tinggi fase terbalik kromatografi cair
(Komite Nordic Analisis Makanan (NMKL), dan pasangan ion kromatografi
cair ditambah dengan UV atau detektor diode-array (DAD) saat ini
merupakan teknik analisis yang paling disukai karena mereka memberikan
ketahanan yang sangat baik dikombinasikan dengan resolusi yang tak
tertandingi, sensitivitas dan selektivitas. Pendekatan ini, meskipun sangat
cocok untuk penentuan pewarna yang berbeda dalam matriks cair dan
larut dalam air (misalnya minuman ringan atau selai), bila diterapkan
matriks makanan kompleks protein tinggi dan / atau kadar lemak tinggi,
seperti daging atau prosuk ikan, mengakibatkan berbagai masalah
termasuk dalam pemulihan rendah dan tidak sesuai. Perilaku ini dapat
dikaitkan dengan interaksi analit dengan komponen makanan (yaitu
pengikatan pewarna yang dikajii untuk matriks protein) serta karena
komponen makanan dengan gangguan analisis kimia itu sendiri (Komite
Nordic Analisis Makanan (NMKL), penting , metode yang dapat diandalkan

untuk kuantifikasi terhadap pewarna sintesi s yang latut dalam air pada
matriks makanan yang kompleks saat ini tidak tersedia.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan dan
mengoptimalkan protokol eksperimental efisien berdasarkan pada fase
terbalik kinerja tinggi teknik kromatografi cair untuk penentuan simultan
tujuh pewarna sintetis yang larut dalam air (E 110, E 122, E 123, E 124, E
127 , E 128 dan E 129), dalam matriks makanan protein tinggi dan / atau
kadar lemak yang tinggi. prosedur eksperimental yang berbeda diuji dan
dievaluasi terhadap efisiensi dan konsistensi isolasi dan pemisahan
langkah krustasea (binatang laut yang berkulit keras) dimasak, produk
imitasi kepiting (mis surimi) dan matriks telur ikan. Semua pewarna
dipelajari, diizinkan di pasar Uni Eropa, yang secara efisien dipisahkan
menggunakan elusi gradien dioptimalkan dalam menjalankan satu dalam
waktu kurang dari 19 menit. Metode analisis yang didasarkan pada
protokol dikembangkan sepenuhnya divalidasi dalam matriks crustacea
(binatang laut berkulit keras) dan berhasil diterapkan untuk sampel nyata
yang diperoleh dari pasar.
2. ALAT DAN BAHAN
2.1ALAT
peralatan HPLC terdiri dari Shimadzu LC-20AD keunggulan pompa
gradien mampu mencampur hingga empat pelarut, sebuah DGU-20A5
keunggulan fase gerak degasser, sebuah SIL-20A keunggulan sampel
otomatis, CTO-20AC kolom keunggulan oven dan Spectra UV-Vis sistem
SPD-M20A keunggulan dioda-array detektor. Data kromatografi
dikumpulkan dan diolah menggunakan komputer pribadi yang
menjalankan LC solusi 1,21 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Jepang).
Sebuah mikroprosesor pH meter (HACH, HQ 40d multifinance) yang
dilengkapi dengan gabungan dari kaca-elektroda kalomel yang
digunakan untuk pengukuran pH. Penentuan pewarna panjang
gelombang serapan maksimum (Kmax) dilakukan dengan balok ganda
UV-Visible spektrofotometer, UV-1700 Pharma Spec, dengan sel kuarsa
1 cm (Shimadzu, Jepang). Sebuah Omnilab D-78224 thermostatic
ultrasonik bath (Elma, Jerman) sebuah ALC PK 131R multi-kecepatan
mesin pemisah yang didinginkan dan disperser laboratorium IKA UltraTurrax 25 dasar (IKA, Germany) yang digunakan untuk perlakuan awal
sampel makanan.
2.2REAGENT / Pereaksi
Semua larutan disiapkan dengan air berion dan semua bahan kimia
yang grade analitis, kecuali yang dinyatakan berbeda. Ultra murni air
dari P.Nix Power System I (Human Corporation, kemurnian air Korea P
18,0 MXcm) digunakan untuk persiapan fase gerak cair serta untuk
persiapan solusi standar. Amonia cair (25% w / v) (Reag. USP, Ph Eur..)
P.A. dibeli dari Panreac Quimica, amonium asetat P97% P.A. ACS dari
Roth, petroleum , eter (40-60 C) (PAR) dari Panreac Quimica dan nheksana P99% dari Merck. HPLC mutu organik pelarut metanol (MeOH)

dan asetonitril (ACN) yang dibeli dari Fisher Kimia dan Sigma Aldrich,
masing-masing larutan I adalah campuran dari NH3 cair an MeOH (5/95

v / v).
Pewarna makanan E 110 (sunset yellow), E122 (Azorubine E123
(Amaranth), E 124 (Ponceau 4R), E 127 (Erythrosine), E 129 (Allura Red
AC) yang diproduksi oleh IPS (Institute of Leather Industry, Polandia)
dan E 128 (Red 2G) yang diproduksi oleh IPM (Institute bahan Polimer
dan Pewarna, Polandia), semua kemurnian analisis yang dikenal (mulai
dari 80% sampai 94%) dan yang dibeli dari standar LGC. Rumus kimia
dari pewarna dipelajari bersama dengan nama umumnya, nomor
European Community (nomor E), Indeks Warna dominasi (CI nomor),
Maksimum absorbansi panjang gelombang (Kmax) dan pewarna
persentase pewarna kasar dilaporkan pada Tabel 1.

2.3kondisi kromatografi
Untuk kromatografi sebuah Simetri C18 (Waters, Milford, USA)
kolom (150 mm 4.6mm nomor pembayar) 5 lm ukuran partikel,
digunakan bersama-sama dengan C18 (25mm 4.6mm nomor
pembayar, 5 lm) kolom guard (Waters). Volume injeksi adalah 20 lL,
laju aliran disimpan di 1,5 mL min1 dan kolom suhu oven diatur pada
30 C. Fase gerak terdiri dari penyangga cair amonium asetat (1% b /
v) (0,13 M) dititrasi ke pH: 7,5 dengan penambahan 0,1 M NH3 cair
(pelarut A), metanol (MeOH, asetonitril Band pelarut (ACN, pelarut C ).
Pelarut A disiapkan setiap hari dan disaring oleh vakum melalui 0,22 lm
filter membran (Millipore, Type GVWP) sebelum analisis HPLC. Untuk
mencapai resolusi yang baik dari semua pewarna sejumlah program
elusi gradien yang diuji, akhir dari pengoptimalan gradien terdiri dari
langkah-langkah berikut:
0-2 min: elusi isokratik dari 100% pelarut A; 2-20 min: gradien linier
dari 100% pelarut A ke 20% pelarut A, 65% pelarut B, 15% pelarut C;
20-22 min: elusi isokratik dari 20% pelarut A, 65% pelarut B dan 15%
pelarut C; 22-24 min: gradien linier dari 20% pelarut A, 65% pelarut B,
15% pelarut C kembali ke kondisi awal 100% pelarut A dan 24-26 min:
kesetimbangan pada kondisi awal injeksi berikutnya.

Detektor diode-array diprogram untuk memantau tujuh pewarna pada kisaran

300-750 nm. Deteksi dan kuantifikasi masing-masing analit dilakukan pada
absorbansi panjang gelombang maksimum (&max) (lihat tabel 1). kromatogram
karakteristik larutan standar campuran dari semua pewarna diteliti menggunakan
program gradien dioptimalkan diuraikan di atas ditampilkan pada Gambar. 1.
2.4Zat pewarna larutan standar dan preparasi sampel

Disiapkan dengan melarutkan sekitar 25 mg pewarna unpurified di

25 mL air yang terionisasi, dengan memperhatikan kemurnian
pewarna tersebut. Larutan disimpan dalam lemari es (4-8 C) untuk
jangka waktu maksimal 3 bulan.
Pembuatan latrutan standar dari 100 mg LA1 dibuat dengan
pengenceran yang tepat dari larutan stock yang terionisasi dan terus
stabil selama 1 bulan (pada 4-8 C).
Larutan standar yang berisi campuran dari semua pewarna pada
konsentrasi antara 0,8 dan 100 mg LA1 juga dibuat dengan cara
mencampur dan dilarutkan dengan penambahan air yang sesuai dari
penambahan larutan stok standar dari masing-masing pewarna.
Semua larutan di atas disimpan pada 4-8 C selama 1 bulan.
Semua sampel diperoleh dari kontrol pasar internal dan juga dari
kontrol perbatasan barang impor dari ketiga negara (di luar Uni Eropa)
dan termasuk krustasea (binatang laut berkulit keras), produk imitasi
kepiting dan produk ikan lainnya (misalnya ikan roe). Sampel homogen
sebelum dianalisis dan waktu antara homogenisasi dan analisis tidak
melebihi 24 jam.
Secara khusus, untuk mempersiapkan sampel yang dibubuhi
sekitar 50 g sampel warna krustasea (binatang laut berkulit keras)
ditimbang dengan jumlah yang sesuai dari larutan standar campuran
tergantung pada tingkat konsentrasi yang diinginkan (misalnya: untuk
konsentrasi pewarna akhir dari 3 ppm 4 mL aliquot dari 100mgL1
larutan campuran standar digunakan). Kemudian , penyangga
amonium asetat (larutan A) ditambahkan dengan campuran yang
dihasilkan hingga berat akhir 150 g dan keseluruhan dihomogenkan.
Dihasilkan ampas yang dibubuhi itu dan terbagi ke Subsamples yang
tepat dan dianalisis mengikuti protokol yang dijelaskan di bawah.

Ekstraksi pewarna untuk sebagian sampel 5 g dilakukan dengan

menambahkan 10 mL larutan berisi NH3 cair (25% w / v) dan MeOH (5/95 v / v)
(Larutan I) dan 10 ml H2O atau penyangga amonium asetat (0,13 M),
bergantung pada protokol. Sampel kemudian selanjutnya divortex selama 1 menit
dan diaduk selama 1 jam atau disonifikasi selama 20 menit pada 30 C,
tergantung pada protokol eksperimental.
Dispersi yang dihasilkan disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm /
15 C selama 10 menit menggunakan botol yang dilengkapi dengan
tutup sekrup untuk menghilangkan hilangnya ekstraksi yang berwarna.
Supernatan larutn berwarna kemudian dituangkan dan diekstraksi
ulang setidaknya dua kali atau sampai ekstrak yang dihasilkan tidak
berwarna. Biasanya sebanyak tiga kali ekstraksi cukup untuk warna
yang akan diekstrak secara kuantitatif dari matriks makanan
dipelajari. Dihasilkan larutan berwarna yang jernih dan dikumpulkan
bersamaan dan diuapkan (biasanya dalam bak air atau alat vakum
penguap) untuk sekitar 15 mL sampai semua bekas metanol dan
Amonia dipisahkan dan pH larutan berubah netral. Konsentrat tersebut

kemudian disaring melalui serat kaca filter (Macherey-Nagel, GF) dan langkah
bersih selanjutnya dilakukan pada kartrid ekstraksi fase padat (SPE) dari

Poliamida 6 (Macherey-Nagel, Chromabond PA, 6ml / 500mg). Kartrid mulanya

AC dengan air panas (60-70 C), dan kemudian warna konsentratnya terpaksa
melewati kartrid dengan vakum. Dengan prosedur ini warna sintetis
diserap pada poliamida ketika warna-warna alami yang dielusi. Sebuah
tahap pemurnian MeOH lanjut dielusi dengan warna alami (jika ada).
Akhirnya, warna sintetis diserap dengan 10 mL larutan I. Saat
dihasilkan jelas warna Cairan 2 ml air i yang ditambahkan dan langkah
konsentrasi akhir berlangsung sampai volume 1-2 mL dicapai
(pengangkatan semua bekas MeOH). Konsentrat akhir diencerkan ke 5,
10 atau 20ml Volume dengan penambahan air, tergantung pada
konsentrasi yang diharapkan dari pewarna yang ditentukan, disaring
melalui 0.45 filter lm PVDF (Millipore, Millex-HV) dan dianalisis
menggunakan teknik RP-HPLC / DAD.
2.5protokol percobaan
Untuk keperluan penelitian ini prosedur ekstraksi yang berbeda
dan campuran pelarut 'diuji untuk optimasi tahap ekstraksi:
protocol khusus (Tahapan): 3 langkah ekstraksi yang digunakan
masing-masing 10 mL menggunakan Larutan I dan 10 mL H2O
deionisasi, pengadukan mekanik dispersi untuk setiap langkah
ekstraksi selama setidaknya 1 h (manual atau pengaduk magnet),
disentrifugasi pada 3000 rpm di RT ( menggunakan botol tanpa tutup)
selama 5 menit, konsentrasi dalam rendaman air (sekitar 90 C) untuk
volume akhir 15 mL, pengasaman dari konsentrat dengan
penambahan tetes demi tetes larutan diencerkan HCl atau CH3COOH
(0,1 M) untuk pH: 4-5, yang terakhir memebersihkan SPE. (Komite
Nordic Analisis Makanan (NMKL), 1989).
Protokol alternatif (Tahapan): 4 langkah ekstraksi yang digunakan
masing-masing menggunakan 10 mL Larutan I dan 10 mL H2O
deionisasi, selanjutnya disonikasi di RT selama 20 menit, disentrifugasi
pada 3000 rpm / RT / 10 menit, konsentrasi menggunakan inkubasi
dalam penangas air untuk sekitar 15 mL, pH netral (setelah langkah
konsentrasi, pH: 7), yang terakhir memebersihkan SPE.
2.6Cara uji pengulangan dan reproduktifitas
Intra-day dan inter-day presisi dinilai dengan menganalisa enam
kali pengulangan sampel selama satu hari pengerjaan (n = 6, df = 12,
intra-day ketepatan pengulangan) atau tiga kali pengulangan oleh dua
pengamatan di dua hari yang berbeda (n = 3 , df = 6, antar-hari
presisi reproduktifitas), masing-masing.
3. hasil dan Diskusi
Penelitian ini menjelaskan pengembangan dan optimalisasi
protokol baru dan efisien untuk analisis simultan dari tujuh air merah
mudah larut dalam pewarna sintetis (E 110, E 122, E 123, E 124, E
127, E 128 dan E 129) yang saat ini diizinkan untuk digunakan dalam
masakan krustasea di Uni Eropa , produk imitasi kepiting (contohnya
surimi) dan telur ikan.
Krustasea dipilih sebagai perwakilan dari matriks makanan yang
kompleks karena konsumsi yang tersebar luas di seluruh dunia. Selain
itu, mereka memiliki kandungan protein yang tinggi bersama dengan

lemak diabaikan, sehingga menghadirkan substrat yang unik untuk

studi analisis pewarna makanan di dengan adanya kandungan protein
yang tinggi.
3.1Pengoptimalan protokol percobaan
Untuk ketiga protokol yang berbeda diuji dengan pengaruh
percobaan yang dilakukan untuk menentukan presisi dan akurasi
deteksi. Pengaruh percobaan dilakukan dalam matriks Crustacea,
memanfaatkan campuran empat pewarna yang berbeda (E 110, E 122,
E 124 dan E 129) di tiga tingkat fortifikasi (3, 7 dan 15 ppm). Pengaruh
tingkat tersebut dipilih di kisaran 10 ppm berdasarkan observasi
laboratorium dari analisis sampel nyata. Khususnya, lebih dari 300
produk ikan telah dianalisis di laboratorium kami untuk pewarna
makanan sintetis dua tahun terakhir diperoleh baik dari kontrol pasar
internal dan otoritas Bea Cukai. Sebagian besar sampel (> 98%) disajikan

dengan pewarna buatan dalam konsentrasi sampai 15 ppm, sedangkan untuk

kasus yang tersisa (hampir 2% dari total) konsentrasi pewarna sintesis kisaran
dari 20 sampai 30 ppm. Data ini menunjukkan bahwa pengaruh tingkat di kisaran
10 ppm akan cukup untuk mensimulasikan sampel nyata yang ditemukan di pasar
Uni Eropa.
Pengaruh dari setiap percobaan yang dilakukan dalam rangkap
dan perbedaan perolehan , serta nilai-nilai RSD, telah dicatat. Hasilnya
dirangkum pada Tabel 2. variasi perolehan nilai antara protokol yang
berbeda juga digambarkan.
Protokol pertama diuji dengan didasarkan pada kondisi standar
(Protokol Khas, lihat Tabel 2) cocok untuk analisis warna sintetis dalam
matriks cair dan larut dalam air (misalnya minuman ringan, selai atau
gula) (Komite Nordic Analisis Makanan (NMKL), 1989; Kirschbaum et al,
2006;. Minioti et al, 2007;. Vachira Patama et al, 2008;.. Zhang et al,
2005). Namun, ketika diuji dalam matriks makanan yang kompleks
(yaitu krustasea) protokol ini mengakibatkan perolehan yang buruk
dari semua yang dipelajari, umumnya di kisaran 20-40%, disertai
dengan karakteristik presisi yang buruk ( RSD berkisar antara 14%
sampai 25%) . Secara lebih rinci tahap ekstraksi ini kurang
memeberikan hasil yang baik dari uji coba substrat yang
meninggalkan sampel warna secara signifikan yang telah tiga kali
diekstraksi. Penggunaan penambahan memecah protein sebelum
prosedur tahap ekstraksi, seperti yang diusulkan dalam literatur
(Komite Nordic Analisis Makanan (NMKL), 1989), ini tidak
meningkatkan perolehan yang dihasilkan ( tetap dalam kisaran 3040%). Selain itu, hilangnya warna yang signifikan diamati selama
pengasaman konsentrat, setelah NH3 dan pengangkatan MeOH.
Pengasaman biasanya digunakan untuk menstabilkan (yang tidak
stabil pada pH basa) sebelum sampel dibersihkan, tetapi dalam kasus
ini menghasilkan endapan berwarna. Hilangnya warna pada tahap ini

dapat dikaitkan dengan penggumpalan protein dalam kondisi asam

yang mengakibatkan pengendapan endapan berwarna.
Dengan demikian, protokol berbeda (Protokol Alternatif, lihat Tabel
2) diuji berikutnya. Dalam pengasaman protokol ini dihilangkan dan
perbaikan di tahap ekstraksi yang ditambahkan. Secara khusus, ada
peningkatan dari jumlah langkah ekstraksi dari 3 sampai 4 bersamaan
dengan yang disonikasi dispersi yang dihasilkan. Menggunakan
protokol ini, solusinya tetap netral (pH: 7) setelah penhilangan MeOH
dan NH3 di bawah pemanas, sehingga mencegah endapan protein dan
penurunan warna. Warna yang diteliti adalah stabil pada pH netral dan
penelitian masih efisien pada bahan poliamida cartridge selama
sampel dibersihkan. keseluruhan penggunaan Protokol Alternatif
mengakibatkan peningkatan perolehan nilai mulai di daerah 40-80%,
keseluruhan dari keempat pewarna . perbaikan selanjutnya dari
perolehan didapatkan dengan penambahan menuju ke pengoptimalan
tahap ekstraksi (New Protocol, lihat Tabel 2). Perbaikan ini meliputi: (a)
penggantian H2O dengan larutan amonium asetat (0,13 M, pH: 7,5)
dalam ekstraksi campuran pelarut (peningkatan kekuatan ion); (B)
modifikasi di disonikasi (dilakukan pada 30-40 C); dan (c) sentrifugasi
(5000 rpm / 15 C dan penggunaan tutup botol sekrup). Modifikasi
tersebut mengakibatkan peningkatan yang signifikan dalam perolehan
RSD (Tabel 2). Penggunaan ini dioptimalkan untuk Protocol baru yang
menyebabkan peningkatan dari rata-rata perolehan hingga 90%.
Selanjutnya kita menguji dengan menyelesaikan Protokol baru
untuk analisis dari 110 sampel udang berduri dengan tujuh campuran
yang diteliti (E 110, E 122, E 123, E 124, E 127, E 128 dan E 129) di
berbagai tingkatan fortifikasi ( 3, 7 dan 15 ppm). Hasil percobaan ini
dari pengaruh setiap uji coba yang dilakukan dan beberapa
ditampilkan pada Tabel 3.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa protokol percobaan akhirnya
diadopsi untuk analisis pewarna ( Protokol baru ) ditandai dengan yang
cukup tinggi dan konsisten perolehan nilai (min. 81%) serta RSD
rendah (max. 6%) untuk semua warna diteliti. Pengecualian untuk
gambaran umum ini adalah kasus Erythrosine (E 127). Dalam semua ,
pewarna ini menunjukkan karaketeristik perolehan yang lebih buruk
(umumnya di kisaran 50-60%) disertai dengan nilai RSD lebih tinggi (di
daerah 10%). Perilaku ini bisa sebagian disebabkan oleh sensitivitas
yang relatif lebih tinggi dari pewarna khusus pada kondisi suhu yang
tinggi. Untuk menjelaskan hal ini, kondisi suhu yang ringan yang
diterapkan pada tahap konsentrasi Protokol dengan menggunakan
evaporator vakum pada 60 C. Dengan kondisi tersebut, perolehan
untuk E 127 mencapai nilai setinggi 91% (Gambar. 2). Perlu
diperhatikan bahwa semua diteliti disajikan dengan gejala yang sama
dan peningkatan umum dalam perolehan diamati (umumnya 5-15%
sehubungan dengan prosedur percobaan bianya - Protokol baru ,

Gambar. 2). Namun, penggunaan evaporator vakum terbukti menyita

waktu untuk aplikasi dalam praktek laboratorium sehari-hari. Vakum
evaporator tahap konsentrasinya bisa bertahan selama 45 menit
untuk setiap sampel, ketika penangas air alternatif terakhir tidak lebih
dari 20-30 menit untuk analisis pewarna 4-6 sampel. Dengan
demikian, dalam analisis sampel nyata tahap vakum evaporator tidak
diadopsi. Sebaliknya, kondisi suhu dan waktu disesuaikan selama .
Tahap konsentrasi untuk mencapai perolehan tertinggi pada waktu
analisis yang wajar.
3.2Metode Validasi
Prosedur Protokol baru sepenuhnya divalidasi untuk analisis ketujuh
pewarna dalam matriks krustasea. Hasil akhir gabungan diperluas
ketidakpastian (U) dihitung sebagai akar kuadrat dari jumlah kuadrat
dari ketidakpastian komponen standar, U (xi), dikalikan dengan faktor
cakupan (k = 2, tingkat kepercayaan: 95%). Sumber ketidakpastian
dalam prosedur analitis diidentifikasi dan diukur. Kontribusi dari
ketidakpastian komponen berikut diperkirakan: relatif standar deviasi
dalam hal reproduksi (RSD), perolehan nilai ketidakpastian u (rec),
ketidakpastian konsentrasi bahan referensi u (CS), ketidakpastian dari
kurva kalibrasi u (Co), ketidakpastian karena pengukuran Volume u (Vd)
dan ketidakpastian karena pengukuran massa u (m). Komponen
dengan kontribusi tertinggi terhadap ketidakpastian diperluas
gabungan (U) adalah adanya ketidakpastian kurva kalibrasi, u (Co)
pada tingkat konsentrasi rendah (<10 ppm), sedangkan standar relatif
reproduktifitas (RSDL) memiliki dampak tertinggi pada ketidakpastian
pada konsentrasi tingkat yang lebih tinggi dari 10 ppm. Hasilnya dapat
dilihat pada Tabel 3. penghitungan ketidakpastian adalah penting t
untuk pengukuran analitis, penawaran, untuk laboratorium yang
berbeda di seluruh dunia, kemampuan untuk membandingkan hasil
analisis dengan ditelusuri. Ini adalah studi pertama di mengetahui
kuantitasnya lapangan dan melaporkan perhitungan tidak menentu
untuk protokol yang diusulkan. Selain itu, nilai kritis (xc) dengan nilai
yang terdeteksi minimum (MDV, xd) (menurut ISO 11843) dihitung
untuk semua yang diteliti (lihat Tabel 3). Untuk ini, data set dari
persamaan kalibrasi (n = 10) dari standar solusi campuran dari semua
dalam enam tingkat kalibrasi ( konsentrasi pewarna sintesis kisaran:
0,8-30 lg mL1) yang digunakan. Kurva kalibrasi masing-masing
pewarna yang digunakan untuk validasi (estimasi u (Co)) serta
penghitungan. Data yang sesuai diperoleh dalam jangka waktu lebih
dari satu tahun. Akhirnya, koefisien korelasi (R2) untuk semua kurva
kalibrasi ditentukan pada 0.999 atau lebih tinggi.
3.3masalah matriks kandungan lemak tinggi
Masalah matriks kandungan lemak yang tinggi juga dibahas dalam
penelitian ini. Kandungan lemak yang tinggi dari matriks makanan
dapat menimbulkan masalah tambahan selama tahap ekstraksi,

terutama dalam hal pemisahan dua fase, air dan lipofilik, setelah
sonikasi dan sentrifugasi . Untuk mengatasi kesulitan tersebut satu langkah

penambahan defatting dilakukan dalam Protokol Baru, memanfaatkan pelarut

organik (baik petroleum eter atau n-heksana). Dalam analisis ini, sampel telur
ikan berwarna (tersedia secara komersial) atau telur ikan berduri (disiapkan di
laboratorium) diperkaya dengan tujuh campuran tiga warna (E 110, E 122 dan E
124) yang digunakan dan dianalisis mengikuti protokol percobaan dioptimalkan
untuk ( Protokol baru ) dengan dan tanpa langkah defatting. Semua sampel
dianalisis dalam rangkap. Dengan tidak adanya langkah , pemisahan yang
lemah berlangsung dan dalam beberapa sampel emulsi terbentuk,
yang membuat penuangan kuantitatif terhadap tahap air sangat sulit.
Bagaimanapun, peningkatan yang signifikan dalam perolehan nilai
diamati ketika langkah dilakukan (Tabel 4). Ini merupakan pertama kali
dipublikasikan perekaman data dan memperkirakan karakteristik
kinerja metode yang diterapkan (akurasi - sebagai Pemulihan%, dan
presisi yang - sebagai RSD%) dalam produk makanan lemak tinggi dan
/ atau kandungan protein yang tinggi berdasarkan analisis sampel
nyata memanfaatkan RP teknik -HPLC / DAD.

4. KESIMPULAN
Dengan metode yang ada untuk analisis ketujuh pewarna makanan
terutama sesuai untuk matriks cair dan dapat larut dalam air. Metode ini
tidak diperoleh analisis yang akurat dan dapat diulang dari matriks
makanan kompleks pada kandungan protein tinggi seperti ikan dan produk
daging. Pada penelitian ini, kami mengembangkan dan mengoptimalkan
protokol baru yang didedikasikan untuk matriks makanan protein tinggi
dan / atau kadar lemak yang tinggi. Metode ini divalidasi menggunakan
matriks krustasea sehingga pengukuran yang kuat dan efisien dari
Perolehan dan RSD. Selain itu penentuan bersama ketujuh pewarna
makanan yang dapat larut dalam air (E 110, E 122, E 123, E 124, E 127, E
128 dan E 129) pada konsentrasi yang sangat rendah (<1 ppm). Secara
keseluruhan, protokol yang disajikan di sini memberikan metode yang
sederhana dan relatif cepat untuk menentukan makanan dengan adanya
matriks analitis yang menantang. Protokol ini menunjukkan presisi tinggi
dan akurasi deteksi dan dapat memberikan dasar bagi pembangunan
masa depan metode yang serupa dalam matriks makanan kompleks
lainnya seperti produk daging.