A.

Tujuan :
1. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
2. Dapat menentukan/menghitung kadar akrilmid.
B. Prinsip
pemisahan komponen-komponen dari campurannya berdasarkan perbedaan kekuatan
interaksi antara masing-masing komponen terhadap fasa gerak dan fasa diam.
C. Dasar Teori
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran
tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti
adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan
dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus
tersebut, yang berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya,
masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential
migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada.
(Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran
yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu
fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa
diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau
didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik
HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan
area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu
konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
(Wiji, dkk. 2010 : 17).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan bahan
pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 m (1m = 10 -6 m).

Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa (

200 atmosfir)

untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.

Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah
memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah menghasilkan suatu
teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang
diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis
zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut
normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat
kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6
mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa
polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding
dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya
maka sistem ini disebut HPLC fase normal.
b) Fase Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non
polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana
baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara
pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak
sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan
molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat
bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena
interaksi dengan gugus hidrokarbon.
Jumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik seperti
heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti metanol,tergantung kepada
apakah

kita

bekerja

kromatografilainnya.

menggunakan

fasa

normal

atau

fasa

terbalik

atau

metode

Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai lebih dari
satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-campuran pelarut dengan komposisi yang
diatur dengan bantuan suatu programener, maka diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini
diperlukan untuk melakukan elusi bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama
pengelusian. Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga
campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan (pulseless).
Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 10 mL/menit.
Gas yang terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih dahulu
(de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-partikel kecil yang
tidak larut. Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 m) untuk
mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom. Saringan ini harus
diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan.
Diantara jenis-jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC adalah
jenis pompa isap dan tekan (reciprocating). Pompa isap dan tekan yang sederhana
mempunyai kecepatan isap yang tetap. Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis
sama dengan waktu untuk langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam
denyutan yang baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap yang
masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap memppunyai dua katup
pengendali.Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian
ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien diperlukan dua
sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu atau dua penghisap. Ada dua macam
rancangan utama pompa gradien yaitu pecampuran tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua
pompa dan pencampuran tekana rendah dengan hantaran satu pompa.
Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan tinggi,
mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa menghantarkan satu sistem
pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan aliran masing-masing pelarut sesuai
dengan komposisi yang diinginkan dan juga berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan
yang baik oleh suatu pengaduk dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap
penghisap mempunyai dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya
mempunyai satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa.
Pompa ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien. Dengan katup-

katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran terner (tiga jenis pelarut) dengan
perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk melakukan gradien gradien tidak diperlukan lebih dari
satu pompa. Katup-katup pembagi ini dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka
selama langkah pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

D. Alat dan bahan

Alat :
Instrumen
Spatula
Labu ukur 50 mL
Labu ukur 10 mL
Neraca analitik
Pipet tetes
Gelas kimia 10 mL
Gelas ukur 500 mL
Kertas saring

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Bahan :
1. Buffer Fosfat
2. Natrium Hidroksida
3. Akrilamid PA
4. Metanol for HPLC
5. Aquabides
6. Asetonitril