VALIDASI METODE

PENGUJIAN HISTAMIN
UHPLC 2017

I. PENDAHULUAN
Ikan segar merupakan ikan yang barsaja ditangkap, belum disimpan atau
diawetkan dan mempunyai mutu yang tidak berubah serta tidak mengalami
kerusakan (SNI 01-2729-1992). Kemunduran mutu ikan dapat dideteksi dengan
pengujian secara kimiawi yang salah satunya adalah kandungan histamine.
Tuna dan ikan-ikan dari keluarga scombridae banyak mengandung senyawa
asam amino histidin yang mudah mengalami proses dekarboksilasi menjadi senyawa
histamin. Kadar histamin pada ikan dapat digunakan sebagai indicator kemunduran
mutu. Menurut Shalabi (1996) dalam Hus et all. (2003) kandungan histamine pada
daging ikan tuna yang aman untuk dikonsumsi adalah < 5 mg/100gr.
Histamin adalah salah satu komponen dari group amina biogenic. Amina
biogenic adalah komponen biologis aktif yang dihasilkan oleh proses dekarboksilase
asam amino bebas yang terdapat pada beberapa bahan pangan. HIstamin yang
dihasilkan pada ikan dalam jumlah besar berpotensi mennimbulkan racun. Histamin
tahan terhadap panas, sehingga jika ikan ini telah dikalengkan atau dimasak pada
suhu yang tinggi sebelum dikonsumsi histamine yang sudah ada tidak dapat
dihancurkan dan tetap dikonsumsi oleh manusia (Huss, 1994).
Metode uji histamin mengacu pada : SNI 2354.10:2016 Histamin pada produk
perikanan.

II. WAKTU DAN TEMPAT

Validasi metode pengujian Histamin dilakukan pada bulan Januari 2017 di
Laboratorium Kimia UPTD. Balai Pembinaan dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan
dan Kelautan Makassar.

III. PELAKSANAAN
Validasi metode pengujian histamin ini dilakukan oleh tim yang terdiri dari
penyelia kimia dan analis yang bertanggung-jawab terhadap pengujian tersebut.

IV. METODE VALIDASI

A. Definisi validasi
 Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang
objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. (SNI
19-17025-2000, butir 5.4.5.1)
Validasi metode adalah suatu konfirmasi bahwa metode yang
bersangkutan memenuhi persyaratan yang ditentukan (sesuai tujuan tertentu)
dengan cara menguji metode dan melengkapi bukti-bukti yang objektif.
Validasi Metode :
Proses penentuan dan evaluasi kemampuan dan sekaligus juga
keterbatasan metoda yang bersangkutan.
Identifikasi faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode dan
mengetahui besarnya pengaruh tersebut (misalnya : faktor matriks contoh,
zat pengganggu, dan sebagainya)
Menguji presisi dan akurasi yang dapat dicapai oleh metode.
Merupakan kegiatan verifikasi untuk memastikan bahwa metode yang
bersangkutan akan dapat memenuhi persyaratan/ tujuan yang ditentukan
Harus dilaksanakan oleh personil yang kompeten dan menggunakan
peralatan yang baik kinerjanya dan terkalibrasi.
Menyamai hal-hal yang dilakukan dalam kegiatan pengembangan metode
analisis.

B. Verifikasi Versus Validasi

1. Verifikasi
Verifikasi adalah uji kinerja metode standar, dimana kinerja yang diuji
selektif/terbatas (tidak selengkap seperti dalam validasi) : minimal akurasi
(bias) dan presisi, serta kinerja yang lain bila perlu.
Verifikasi dilakukan terhadap metode standar sebelum diterapkan di
laboratorium, dengan tujuan untuk membuktikan bahwa laboratorium
mampu melakukan pengujian dengan metode itu dengan hasil yang
dapat diandalkan (Valid).
2. Validasi metode :
Berlaku untuk metode non standar
Berlaku untuk metode standar yang dimodifikasi sendiri.
Berlaku untuk metode yang dibuat / dikembangkan sendiri.

C. Prosedur Validasi
1. Uji Linearitas
 Uji linearitas dimaksudkan untuk mengetahui kesesuaian antara kerja analis
dengan respon alat. Uji linearitas dapat dilakukan dengan cara membuat
kurva kalibrasi larutan standar yang diinjeksikan langsung pada alat.

2. Uji Limit Of Detection Dan Limit Of Quantification

Kedua uji ini dilakukan dengan menganalisa blanko dan spike contoh pada
konsentrasi rendah sebanyak 7 ulangan. Berdasarkan data analisis nilai LoD
& LoQ.

3. Uji Akurasi (Recovery)

Uji akurasi dilakukan dengan menganalisa spike contoh sebanyak 7 ulangan
dari tiga seri konsentrasi yang sesuai. Hasil uji akurasi dilihat dari perhitungan
perolehan kembali. Batas nilai recovery untuk konsentrasi 10 ppb adalah
sebesar 80 120%

4. Uji Presisi (Repeability)

Uji presisi dilakukan dengan menganalisa contoh atau spike contoh sebanyak
7 ulangan dalam setiap matriks contoh. Berdasarkan data tersebut dihitung
nilai SD dan RSD. Nilai RSD maksimum yang dipersyaratkan sebesar 15-21
% untuk komsentrasi 10 ppb.

V. METODE ANALISA
A. Prosedur Kerja
1. Blender conrptoh hingga homogen
2. Timbang seksama lebih kurang 50 gram contoh ke dalam gelas piala,
tambahkan 100 ml TCA 10% kemudian blender
3. Pindahkan ke dalam tanung raksi 50 ml, sentrifugal pada 3500 rpm
selama 10 menit. Saring supernatan dengan membran filter 0.45 m
kemudian simpan pada suhu refrigerator ( 4C)
4. Derivatisasi
5. Pipet masing-masing 135 l larutan baku kerja dan filtrat contoh,
masukkan ke dalam tabung reaksi 10 ml
6. Tambahkan masing-masing ke dalam baku kerja dan filtrat contoh,
masukkan ke dalam tabung reaksi 10 mL
- 1,86 ml air pro KCKT kemudian divortex
- 0,4 ml NaOH 1 N, biarkan selama 1 menit
- 0,1 ml larutan OPA, vortex dan biarkan selama 4 menit
- 0,2 ml HCl 3 N, vortex
7. Masukkan ke vial dan siap untuk diinjeksikan ke kromatograf
8. Lakukan pengerjaan blanko 135 l Larutan Asam Trikloroasetat (TCA
10%) pengganti contoh dan dikerjakan seperti pengerjaan contoh.
9. Injeksikan ke dalam kromatograf secara berurutan larutan blanko baku,
baku kerja dari konsentrasi terendah, blanko pereaksi dan contoh. Rekam
area puncak kromatograf utama dari masing-masing lautan yang
diinjeksikan.
B. Kondisi KCKT
1. Detektor : Fluorosens (High Pressure Xenon Lamp)
2. Eksitasi : 350 nm
3. Emisi : 450 nm
4. Kolom : C-18 (4.6 mm x 220 mm) terkemas dengan ukuran partikel 5m
5. Fase Gerak : Asetonitril : Natrim dihidrogen Fosfat 50 mmol/l (45 : 55)
6. Volume injeksi : 20 l
7. Pastikan peralatan KCKT berfungsi dengan baik dan lakukan uji
kesesuaian sistem
VI. HASIL PENENTUAN
1. Kurva Kalibrasi Standar Histamin

Conc Std (ppm) Luas Area

0.00 0.000

2.50 210800.600

5.00 426220.000

10.00 859034.000

20.00 1613248.800

R2 0.99882
Slope 80774.56800
Intercept 16051.42000

Kurva Kalibrasi Histamin UHPLC

1800000

1600000
f(x) = 80774.57x + 16051.42
1400000 R = 1

1200000

1000000
Luas Are a 800000

600000

400000

200000

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Konse ntrasi Standar (ppm )

 Gambar 1. Kurva KalibrasiStandar Histamin

2. Uji Linieritas

a. Linearitas Kurva Standar

Kurva Linearitas Standar Histamin

250000

200000 f(x) = 11434.98x + 621.19

R = 1
150000
Luas Area 100000

50000

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Konsentrasi Larutan Standar Histamin (ppm)

Uji linearitas dimaksudkan

untuk mengetahui kesesuaian antara kerja analis dengan respon alat. Uji linearitas
dapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi larutan standar yang
diinjeksikan langsung pada alat.
Kurva Linearitas Standar Histamin
300000
250000
f(x) = 12752.06x + 1589.51
200000 R = 1
150000
Luas Area
100000
50000
0
0 5 10 15 20 25

Konsentrasi Larutan Standar Histamin (ppm)

Kurva Linearitas Standar Histamin

250000

200000
f(x) = 10206.61x + 2383.2
150000 R = 1
Luas Area 100000

50000

0
0 5 10 15 20

Konsentrasi Larutan Standar Histamin (ppm)

 Gambar 2. Kurva Linearitas Standar Histamin

Kurva standar menunjukkan linearitas dengan koefisien korelasi regresi 0.9980

0.9990.

b. Uji Linearitas Spike Sampel

Uji linearitas dilakukan dari data spike sampel yang berasal dari data table uji
akurasi, selanjutnya dibuat kurva antara konsentrasi spike (0; Spike LOD; 0.5 MRL;
1 MRL dan 1,5 MRL) versus luas area. Nilai koefisien korelasi regresi adalah
0.9910 seperti pada gambar kurva linearitas dibawah ini :

Kurva Linearitas Konsentrasi Spike Histamin

6000000

5000000 f(x) = 35122.34x + 304809.72

R = 0.99
4000000

3000000
Luas Area
2000000

1000000

0
0 50 100 150

Konsentrasi Spike Histamin (g/g)

Gambar 3. Kurva Linearitas Spike Sampel
3. Rekapitulasi Hasil Luas Area Blanko Contoh

Bobot Volume Kadar

Luas Konsentrasi
No Nama Sampel Contoh Akhir Histamin
Area Sampel (g/mL)
(g) (mL) (g/g)

1 Blanko Contoh 1 50.0204 114635 100 1.2205 2.4400

2 Blanko Contoh 2 50.0228 114908 100 1.2239 2.4466

3 Blanko Contoh 3 50.0210 115734 100 1.2341 2.4671

4 Blanko Contoh 4 50.0650 115642 100 1.2329 2.4627

5 Blanko Contoh 5 50.0555 115251 100 1.2281 2.4535

6 Blanko Contoh 6 50.0637 115742 100 1.2342 2.4652

7 Blanko Contoh 7 50.0427 115607 100 1.2325 2.4629

Rata-rata 1.2295

SD 0.0055

% RSD 0.44

4. Limit of Detection (LOD) and Limit of Determination (LOQ)

Rekapitulasi Data Luas Area LOD dan LOQ (Spike 10 g/g)
N Luas Area
Uraian
o 1 2 3 4 5 6 7
1 Spiked 10 ug/g 888803 876752 872156 871107 872773 871861 865118

2 Blanko sampel 114635 114908 115734 115642 115251 115742 115607

Kadar Spiked Sampel (g/g) dan Kadar Blanko Sampel (g/g)
3 Kadar Spiked sampel 10.80 10.65 10.60 10.59 10.60 10.60 10.51

4 Kadar Blanko Sampel 1.22 1.22 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23

5 Rerata Luas Area Blanko Sampel 115359.8571

6 Rerata Luas Area Spiked 10 ug/g 874081.4286

7 Rerata Kadar Spiked Sampel 10.62 g/g

8 Rerata Kadar Blanko Sampel 1.23 g/g

9 SD Blanko Sampel 0.0054

10 SD Spiked Sampel 0.0910

11 3 SD 0.0163

12 6 SD 0.0327

13 LOD 0.0174 g/g

14 LOQ 0.0348 g/g

Uji batas deteksi dilakukan dengan pengujian terhadap blanko sampel sebanyak tujuh
kali ulangan (replikat), menghasilkan rata-rata konsentrasi 1.23 g/g dengan standar
 deviasi 0.0054. Dari rata-rata tersebut maka dapat ditentukan batas deteksi (LOD =
0.174 g/g)

5. Uji Presisi (Repeatibility)

Uji kecermatan/ketelitian (Precision) dilakukan untuk mengetahui besarnya
penyebaran data analis yang dihasilkan dengan rata-rata. Secara kuantitatif,
kecermatan suatu data analisis replikat dinyatakan sebagai standar deviasi relative
(Relative Standart Deviation / RSD).

0.5 MRL = Contoh + 250 L dari 1000 mg/L (Spike 50 g/gr)

Kadar
Bobot Volume Konsentrasi Kadar Kadar
Luas Histamin
No Nama Sampel Contoh Akhir Sampel Blanko Histamin % Recovery
Area Awal
(g) (mL) (g/mL) (g/g) (g/g)
(g/g)
1 Blanko 50.0204 86134 100 0.8676 - 1.734556 - -

2 Spike 0.5 MRL 1 50.0228 2172542 100 26.6976 53.3709 - 51.64 103.27

3 Spike 0.5 MRL 2 50.021 2167002 100 26.6291 53.2358 - 51.50 103.00

4 Spike 0.5 MRL 3 50.065 2161729 100 26.5638 53.0586 - 51.32 102.65

5 Spike 0.5 MRL 4 50.0555 2162423 100 26.5724 53.0858 - 51.35 102.70

6 Spike 0.5 MRL 5 50.0637 2158509 100 26.5239 52.9803 - 51.25 102.49

7 Spike 0.5 MRL 6 50.0427 2153882 100 26.4666 52.8881 - 51.15 102.31

8 Spike 0.5 MRL 7 50.0389 2162883 100 26.5781 53.1148 - 51.38 102.76

RATA-RATA 51.37 102.74

SD 0.16 0.32

% RSD 0.31 0.31

Dari hasil Uji Presisi histamin pada contoh Tuna dngan spike 50 g/g , dihasilkan nilai
Standar Deviasi Relative (% RSD) yaitu 0.31 %

1 MRL = Contoh + 500 L dari 1000 mg/L (spike 100 g/g)

Kadar
Bobot Volume Konsentrasi Kadar Kadar
Luas Histamin
No Nama Sampel Contoh Akhir Sampel Blanko Histamin % Recovery
Area Awal
(g) (mL) (g/mL) (g/g) (g/g)
(g/g)
 1 Blanko 50.0528 86134 100 0.8676 - 1.733433 -

2 Spike 1.0 MRL 1 50.0624 3965769 100 48.8980 97.6742 - 95.94 95.94

3 Spike 1.0 MRL 2 50.0369 3965953 100 48.9003 97.7285 - 96.00 96.00

4 Spike 1.0 MRL 3 50.0595 3911652 100 48.2281 96.3415 - 94.61 94.61

5 Spike 1.0 MRL 4 50.0308 3900657 100 48.0919 96.1247 - 94.39 94.39

6 Spike 1.0 MRL 5 50.0263 3892366 100 47.9893 95.9281 - 94.19 94.19

7 Spike 1.0 MRL 6 50.0517 3892394 100 47.9896 95.8801 - 94.15 94.15

8 Spike 1.0 MRL 7 50.0368 3892821 100 47.9949 95.9193 - 94.19 94.19

RATA-RATA 94.78 94.78

SD 0.83 0.83

% RSD 0.87 0.87

Dari hasil Uji Presisi histamin pada contoh Tuna dngan spike 100 g/g , dihasilkan nilai
Standar Deviasi Relative (% RSD) yaitu 0.87 %

1,5 MRL = Contoh + 750 L dari 1000 mg/L (spike 150 g/g)
Kadar
Bobot Volume Konsentrasi Kadar Kadar
Luas Histamin
No Nama Sampel Contoh Akhir Sampel Blanko Histamin % Recovery
Area Awal
(g) (mL) (g/mL) (g/g) (g/g)
(g/g)
1 Blanko 50.0528 86134 100 0.8676 - 1.733433 -

2 Spike 1.5 MRL 1 50.0874 5496858 100 67.8531 135.4694 - 133.74 89.16

3 Spike 1.5 MRL 2 50.0265 5474825 100 67.5804 135.0891 - 133.36 88.90

4 Spike 1.5 MRL 3 50.0632 5469388 100 67.5130 134.8556 - 133.12 88.75

5 Spike 1.5 MRL 4 50.0155 5461711 100 67.4180 134.7942 - 133.06 88.71

6 Spike 1.5 MRL 5 50.0537 5437860 100 67.1227 134.1014 - 132.37 88.25

7 Spike 1.5 MRL 6 50.0187 5438410 100 67.1295 134.2089 - 132.48 88.32

8 Spike 1.5 MRL 7 50.0259 5425625 100 66.9712 133.8731 - 132.14 88.09

RATA-RATA 132.89 88.60

SD 0.58 0.39

% RSD 0.44 0.44

Dari hasil Uji Presisi histamin pada contoh Tuna dngan spike 150 g/g , dihasilkan nilai
Standar Deviasi Relative (% RSD) yaitu 0.44 %
VII. KESIMPULAN
Dari tahapan proses validasi yang telah dilakukan meliputi batas deteksi (LOD),
batas kuantitasi (LOQ), dan uji repeatability/presisi, uji linearitas, diambil kesimpulan
bahwa metode yang diacu untuk pengujian Histamin dinyatakan valid untuk
pengujian Histamin pada Ikan Tuna.
Data yang didapatkan sebagai beikut:

PARAMETER NILAI

LOD 0.0174 g/g

LOQ 0.0348 g/g

% RSD untuk 0.5 MRL 0.31 %

% RSD untuk 1.0 MRL 0.87 %
% RSD untuk 1.5 MRL 0.44 %

Koefisien Regresi 0.9980 0.9990

Analis,

1. Nur Ulfa Zulhulaifa Arief

2. Hajria Yunus, S.Pi

Mengetahui,

Manajer Teknis Penyelia Kimia,

Taufik, S.Pi., MM Ardawaty Rasyid, S.Si

NIP :19690416 199203 1 013 NIP :19790506 201408 2 001