CHROMATOGRAPHY & ELECTROPHORESIS

CHROMATOGRAPHY
Merupakan teknik analisis yang digunakan untuk memisahkan suatu campuran dari
komponen-komponennya dengan akurasi yang cukup tinggi
Dasar: komponen dalam suatu campuran dipisahkan atau didistribusikan menjadi :
o Fase diam/ stasioner atau adsorbent
o Fase bergerak/ mobile atau carrier fluid/ eluent
Karena terdapat perbedaan misalnya tingkat kelarutan antarkeduanya
Dapat memurnikan berbagai substansi terlarut atau menguap
Dapat digunakan untuk memisahkan 2 senyawa yang memiliki kemiripan tinggi misalnya
protein yang mungkin memiliki perbedaan hanya 1 asam amino saja.
Fase mobile sangat menentukan karena menentukan kelarutan dari senyawa tersebut.
Prinsip kromatografi:
o Senyawa yang memiliki berbagai perbedaan misalnya ukuran dan muatan biasanya
mempunyai kekuatan terhadap fase diam yang berbeda.
o Molekul yang ukurannya besar akan sulit terikat/ melekat pada fase diam karena
terperangkap dalam pori.
o Muatan molekul tergantung adsorbennya lebih polar atau tidak dan bermuatan positif
atau negatif. Jika adsorben bermuatan lebih positif dan senyawa yang lebih bermuatan
negatif akan lebih mudah terikat di adsorben.
o Gerakan senyawa2 yang ada dalam campuran tersebut akan menempuh jarak yang
berbeda saat melewati adsorben. Senyawa yang mempunyai afinitas tinggi terhadap
adsorben mempunyai kecepatan lebih lambat dan sebaliknya.
o Perbedaan komponen yang dianalisis mempunyai derajat kekuatan adhesi untuk
adsorbent
o Proses tersebut memisahkan beberapa kompenen yang akan dianalisis menjadi sampel
individual.
Metode kromatografi :
o Kromatografi kolom
Tipe :
Kromatografi gas : biasanya untuk analisis asam lemak karena lemak tidak larut
dalam air (bersifat nonpolar), metode gas-cair (cairan sebagai fase diam yang
 akan terikat di permukaan atau suatu senyawa yang padat; gas sebagai fase
bergerak), metode gas-padat (padat sebagai fase diam).
Kromatografi liquid : metode cair-cair, metode cair-padat, metode size
exclusion.
Kromatografi supercritical fluid
Kromatografi ion exchange menggunakan resin sebagai fase diam
Karakteristik :
Kemampuan memisahkan campuran kompleks
Menyediakan kuantitatif analisis data
o Kromatografi planar
Tipe :
Kromatografi kertas
Kromatografi lapis tipis paling sederhana
Karakteristik :
Relatif murah, cepat, mudah, kualitatif
Kromatografi Kertas
o Sampel dried liquid akan ditempatkan pada bak kromatografi. Biasanya memakai
pelarut non polar. Sampel dipisahkan dari pelarut liquid (fase bergerak) dan paper strip
(fase diam).
o Campuran larutan dipisahkan dengan spot yang diletakkan pada kromatografi kertas
(seperti kertas saring yang tebal).
o Kromatogram dibangun dengan menempatkan bawah kertas (bukan sample spot). pada
tangki yang mengandung pelarut yg sesuai
o Spot tidak boleh terendam dalam pelarut
o Tujuan tanki ditutup agar gerakan pelarut ke atas akan sama
o Kapan mengambil kertas? Sebelum pelarut mencapai 1 cm ujung kertas bagian atas
 Rf = Distance solute moves
Distance solvent front moves

o Prinsip kromatografi kertas:

Aksi kapiler : gerakan cairan sela-sela pori material, dipengaruhi kekuatan adhesi
kohesi dan tegangan permukaan. Mampu bergerak menjalar ke atas kertas karena
daya tariknya lebih kuat daripada gravitasi.
Kelarutan : daya kelarutan berbeda tiap senyawa sehingga larutan yang berbeda
akan terpisah oleh perbedaan kombinasi pelarut. Pemisahan komponen tergantung
pada kelarutannya saat fase bergerak dan perbedaan afinitas fase bergerak dan fase
tetap.
Kromatografi Kolom

o Pemilihan pelarut sangat penting, harus dapat melarutkan sampel, berkaitan dengan
fase gerak.
o Sampel yang terlalu larut dalam fase gerak terlalu cepat bergerak keluar tidak
memberi kesempatan tinggal di fase diam pemisahan tidak sempurna.
o Fase diam terbagi dalam bentuk solid seperti gel silika atau alumina
 o Kromatografi kolom bervariasi ukuran dan polaritasnya.
Kromatografi Lapis Tipis

o Lebih menguntungkan daripada Kromatografi Kertas karena sangat efisien dan ukuran
partikel lebih kecil pada fase diam
o Lembar plastik/glass/alumunium dilapisi silika gel lapis tipis
o Fase bergerak : pelarut
o Fase diam : lapis tipis solid misalnya alumina atau gel silika
o Mirip Kromatografi Kertas yang melibatkan spot mixture
Kromatografi Gas
o Prinsipnya: pemisahan molekul antara gas (fase
bergerak) dan cairan nonvolatile; solid (fase diam)
o Biasanya untuk memisahkan asam lemak
o Fase bergerak : gas inert misalnya nitrogen (paling
sering), helium, argon, CO2
o Punya kemampuan lebih baik dibanding
kromatografi kertas maupun lapis tipis

o Sampel berjalan sepanjang kolom ada interaksi antara fase diam dan fase bergerak
di kolom terjadi pemisahan senyawa2 dalam campuran
 o Preparasi sampel harus diperhatikan
o Waktu retensi : waktu yang diperlukan senyawa dari injeksi ke deteksi. Waktu retensi
meningkatkan ukuran dan polaritas senyawa. Tergantung pada :
Interaksi antara larutan fase diam dan fase bergerak
Kecepatan aliran gas pembawa
Temperatur
Panjang dan diameter kolom

ELECTROPHORESIS
Metode untuk memisahkan partikel koloid, karbohidrat, sediaan farmasi, dan molekl
biologi seperti DNA, RNA, protein berdasarkan ukuran maupun muatannya.
Partikel berpindah melalui elektoda pada polaritas listrik yang berlawanan.
Analisis yang melibatkan medan listrik. Terdiri dari 2 elektroda :
o negative elektroda - cathode mendonorkan elektron
o positive elektroda - anode mengambil elektron

Ion katoda (-) bermigrasi ke anoda (+). Ion negatif disebut anion
Tipe elektroforesis :
o Satu dimensi : digunakan paling rutin untuk memisahkan protein dan asam nukleat
o Dua dimensi : memisahkan protein digunakan untuk finger printing dan akurat
memisahkan protein dalam sel.

Medium : gel agarousa, poliakrilamid

Unit elektroforesis : elektoforesis vertikal dan horisontal