Tahap Proses Replikasi DNA. Deoxyribonucleic acid atau DNA adalah molekul yang
menarik yang menyimpan dan melewatkan semua informasi yang diperlukan dari satu
generasi ke generasi lain. Butuh beberapa eksperimen menarik oleh Frederick Griffith,
Avery, MacLeod, McCarty, Alfred Hershey, Martha Chase dll, menemukan bahwa DNA
adalah materi herediter. Dengan dasar ini, dan penelitian oleh beberapa ilmuwan seperti
Rosalind Franklin, struktur molekul ini akhirnya dipecahkan oleh James Watson dan Francis
Crick.
Kode kimia Sederhana dari molekul DNA menimbulkan kompleksitas besar dari semua
organisme hidup. Tetapi bahkan lebih memikat adalah kemampuannya dalam mereplikasi diri
dan menghasilkan molekul lain yang serupa dengan dirinya sendiri. Diberikan di bawah ini
adalah penjelasan singkat dari struktur DNA serta langkah-langkah melalui mana molekul
DNA membuat salinan dirinya dengan akurasi yang luar biasa.
Struktur DNA
Blok bangunan DNA adalah molekul yang disebut nukleotida, yang terdiri dari gula
deoksiribosa (gula 5-karbon), sebuah basa nitrogen yang melekat pada gula, dan gugus fosfat.
Ada empat jenis molekul nukleotida tergantung pada jenis basa nitrogen terpasang. Keempat
nukleotida (dan basa nitrogen masing-masing) adalah:
AdenosineAdenosine (Adenin)
ThymidineThymidine (Timin)
GuanosineGuanosine (Guanin)
CytidineCytidine (Sitosin)
Sitosin dan timin adalah pirimidin, sejenis molekul heterosiklik beranggota enam. Di sisi lain,
adenin dan guanin adalah purin, yang merupakan molekul dua cincin yang terdiri dari cincin
pirimidin dan cincin imidazol. Ini nukleotida dihubungkan melalui gugus fosfat dan gugus
gula untuk membentuk untai tunggal dari molekul DNA. Kelompok fosfat satu nukleotida
dan gugus hidroksil dari nukleotida yang berdekatan terhubung melalui ikatan fosfodiester.
gugus Gula dan gugus fosfat membentuk tulang punggung masing-masing untai DNA. Setiap
untai memiliki ujung 5 ‘fosfat dan 3′ hidroksil akhir.
Helix ganda DNA terdiri dari dua untai komplementer yang berjalan anti-sejajar satu sama
lain. Satu untai berjalan di arah 5’→ 3′, sedangkan lainnya berjalan ke arah anti-paralel 3 ‘→
5′. Ini untai melekat satu sama lain melalui ikatan hidrogen yang terjadi antara purin dan
pirimidin untai berlawanan. Pasangan adenin dengan timin melalui ikatan ganda (A = T),
sedangkan pasangan guanin dengan sitosin melalui tiga ikatan (G ≡ C). DNA berputar pada
jarak tertentu karena sudut ikatan dari molekul tulang punggung DNA. Ini membentuk
struktur heliks bukannya tangga lurus. A = T dan G ≡ C pasangan basa membentuk anak
tangga heliks ini.
Proses replikasi DNA merupakan suatu masalah yang kompleks, dan melibatkan set protein
dan enzim yang secara kolektif merakit nukleotida dalam urutan yang telah ditentukan.
Dalam menanggapi isyarat molekul yang diterima selama pembelahan sel, molekul-molekul
ini melakukan replikasi DNA, dan mensintesis dua untai baru menggunakan helai yang ada
sebagai template atau ‘cetakan’. Masing-masing dua resultan, molekul DNA yang identik
terdiri dari satu untai baru lama dan salah satu DNA. Oleh karena itu proses replikasi DNA
disebut sebagai semi-konservatif.
Rangkaian peristiwa yang terjadi selama replikasi DNA prokariotik telah dijelaskan di bawah
ini.
❶ Inisiasi
Replikasi DNA dimulai pada lokasi spesifik disebut sebagai asal replikasi, yang memiliki
urutan tertentu yang bisa dikenali oleh protein yang disebut inisiator DnaA. Mereka mengikat
molekul DNA di tempat asal, sehingga mengendur untuk docking protein lain dan enzim
penting untuk replikasi DNA. Sebuah enzim yang disebut helikase direkrut ke lokasi untuk
unwinding (proses penguraian) heliks dalam alur tunggal.
Helikase melepaskan ikatan hidrogen antara pasangan basa, dengan cara yang tergantung
energi. Titik ini atau wilayah DNA yang sekarang dikenal sebagai garpu replikasi (Garpu
replikasi atau cabang replikasi adalah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi).
Setelah heliks yang unwound, protein yang disebut untai tunggal mengikat protein (SSB)
mengikat daerah unwound, dan mencegah mereka untuk annealing (penempelan). Proses
replikasi sehingga dimulai, dan garpu replikasi dilanjutkan dalam dua arah yang berlawanan
sepanjang molekul DNA.
❷ Sintesis Primer
Sintesis DNA Primer
Sintesis baru, untai komplementer DNA menggunakan untai yang ada sebagai template yang
dibawa oleh enzim yang dikenal sebagai DNA polimerase. Selain replikasi mereka juga
memainkan peran penting dalam perbaikan DNA dan rekombinasi.
Namun, DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA secara independen, dan
membutuhkan 3′ gugus hidroksil untuk memulai penambahan nukleotida komplementer. Ini
disediakan oleh enzim yang disebut DNA primase yang merupakan jenis DNA dependent-
RNA polimerase. Ini mensintesis bentangan pendek RNA ke untai DNA yang ada. Ini
segmen pendek disebut primer, dan terdiri dari 9-12 nukleotida. Hal ini memberikan DNA
polimerase platform yang diperlukan untuk mulai menyalin sebuah untai DNA. Setelah
primer terbentuk pada kedua untai, DNA polimerase dapat memperpanjang primer ini
menjadi untai DNA baru.
DNA polimerase dapat menambahkan nukleotida baru hanya untuk ujung 3 ‘dari untai yang
ada, dan karenanya dapat mensintesis DNA dalam arah 5′ → 3 ‘saja. Tapi untai DNA
berjalan di arah yang berlawanan, dan karenanya sintesis DNA pada satu untai dapat terjadi
terus menerus. Hal ini dikenal sebagai untaian pengawal (leading strand).
Di sini, DNA polimerase III (DNA pol III) mengenali 3 ‘OH akhir primer RNA, dan
menambahkan nukleotida komplementer baru. Seperti garpu replikasi berlangsung,
nukleotida baru ditambahkan secara terus menerus, sehingga menghasilkan untai baru.
Di sini, primase menambahkan primer di beberapa tempat sepanjang untai unwound. DNA
pol III memperpanjang primer dengan menambahkan nukleotida baru, dan jatuh ketika
bertemu fragmen yang terbentuk sebelumnya. Dengan demikian, perlu untuk melepaskan
untai DNA, lalu geser lebih lanjut up-stream untuk memulai perluasan primer RNA lain.
Sebuah penjepit geser memegang DNA di tempatnya ketika bergerak melalui proses
replikasi.
❺ Penghapusan Primer
Meskipun untai DNA baru telah disintesis primer RNA hadir pada untai baru terbentuk harus
digantikan oleh DNA. Kegiatan ini dilakukan oleh enzim DNA polimerase I (DNA pol I). Ini
khusus menghilangkan primer RNA melalui ‘5→ 3′ aktivitas eksonuklease nya, dan
menggantikan mereka dengan deoksiribonukleotida baru oleh 5 ‘→ 3′ aktivitas polimerase
DNA.
❻ Ligasi
Setelah penghapusan primer selesai untai tertinggal masih mengandung celah atau nick antara
fragmen Okazaki berdekatan. Enzim ligase mengidentifikasi dan segel nick tersebut dengan
menciptakan ikatan fosfodiester antara 5 ‘fosfat dan 3′ gugus hidroksil fragmen yang
berdekatan.
Ligasi
❼ Pemutusan
Replikasi mesin ini menghentikan di lokasi terminasi khusus yang terdiri dari urutan
nukleotida yang unik. Urutan ini diidentifikasi oleh protein khusus yang disebut tus yang
mengikat ke situs tersebut, sehingga secara fisik menghalangi jalur helikase. Ketika helikase
bertemu protein tus itu jatuh bersama dengan terdekat untai tunggal protein pengikat.
Replikasi DNA
Dari
Replikasi DNA yang terjadi, disebut replikasi semikonservatif, karena masing-masing dari kedua
rantai DNA induk bertindak sebagai cetakan/templat untuk pembuatan dua rantai DNA dengan untai
ganda yang baru.
Replikasi DNA adalah proses penggandaan rantai ganda DNA. Pada sel, replikasi DNA
terjadi sebelum pembelahan sel. Prokariota terus-menerus melakukan replikasi DNA. Pada
eukariota, waktu terjadinya replikasi DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S siklus sel,
sebelum mitosis atau meiosis I. Penggandaan tersebut memanfaatkan enzim DNA polimerase
yang membantu pembentukan ikatan antara nukleotida-nukleotida penyusun polimer DNA.
Proses replikasi DNA dapat pula dilakukan in vitro dalam proses yang disebut reaksi berantai
polimerase (PCR).
Garpu replikasi
Garpu replikasi atau cabang replikasi (replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika
DNA bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-
ikatan hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda
tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah untaian tunggal DNA.
Masing-masing cabang tersebut menjadi "cetakan" untuk pembentukan dua untaian DNA
baru berdasarkan urutan nukleotida komplementernya. DNA polimerase membentuk untaian
DNA baru dengan memperpanjang oligonukleotida yang dibentuk oleh enzim primase dan
disebut primer.
DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan nukleotida—dalam
hal ini, deoksiribonukleotida—ke ujung 3'-hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang
sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai DNA baru disintesis dari arah 5'→3', sedangkan
DNA polimerase bergerak pada DNA "induk" dengan arah 3'→5'. Namun demikian, salah
satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi 3'→5', sementara untaian lainnya
berorientasi 5'→3', dan helikase bergerak membuka untaian rangkap DNA dengan arah
5'→3'. Oleh karena itu, replikasi harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut.
Replikasi DNA. Mula-mula, heliks ganda DNA (merah) dibuka menjadi dua untai tunggal oleh enzim
helikase (9) dengan bantuan topoisomerase (11) yang mengurangi tegangan untai DNA. Untaian
DNA tunggal dilekati oleh protein-protein pengikat untaian tunggal (10) untuk mencegahnya
membentuk heliks ganda kembali. Primase (6) membentuk oligonukleotida RNA yang disebut primer
(5) dan molekul DNA polimerase (3 & 8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak sepanjang
untai tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA baru yang disebut leading
strand (2) dan lagging strand (1). DNA polimerase yang membentuk lagging strand harus
mensintesis segmen-segmen polinukleotida diskontinu (disebut fragmen Okazaki (7)). Enzim DNA
ligase (4) kemudian menyambungkan potongan-potongan lagging strand tersebut.
Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading strand) ialah untaian DNA yang disintesis
dengan arah 5'→3' secara berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA polimerase mampu
membentuk DNA menggunakan ujung 3'-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis
DNA berlangsung secara berkesinambungan, searah dengan arah pergerakan garpu replikasi.
Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang berseberangan dengan
leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang
disebut fragmen Okazaki. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA
polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3' bebas pada primer RNA
tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5'→3'. Fragmen primer RNA tersebut lalu
disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan deoksiribonukleotida
baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase lalu
menyambungkan fragmen-fragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis lagging strand
menjadi lengkap.
Dinamika pada garpu replikasi
Bukti-bukti yang ditemukan belakangan ini menunjukkan bahwa enzim dan protein yang
terlibat dalam replikasi DNA tetap berada pada garpu replikasi sementara DNA membentuk
gelung untuk mempertahankan pembentukan DNA ke dua arah. Hal ini merupakan akibat
dari interaksi antara DNA polimerase, sliding clamp, dan clamp loader.
Sliding clamp pada semua jenis makhluk hidup memiliki struktur serupa dan mampu
berinteraksi dengan berbagai DNA polimerase prosesif maupun non-prosesif yang ditemukan
di sel. Selain itu, sliding clamp berfungsi sebagai suatu faktor prosesivitas. Ujung-C sliding
clamp membentuk gelungan yang mampu berinteraksi dengan protein-protein lain yang
terlibat dalam replikasi DNA (seperti DNA polimerase dan clamp loader). Bagian dalam
sliding clamp memungkinkan DNA bergerak melaluinya. Sliding clamp tidak membentuk
interaksi spesifik dengan DNA. Terdapat lubang 35A besar di tengah clamp ini. Lubang
tersebut berukuran sesuai untuk dilalui DNA dan air menempati tempat sisanya sehingga
clamp dapat bergeser pada sepanjang DNA. Begitu polimerase mencapai ujung templat atau
mendeteksi DNA berutas ganda (lihat di bawah), sliding clamp mengalami perubahan
konformasi yang melepaskan DNA polimerase.
Clamp loader merupakan protein bersubunit banyak yang mampu menempel pada sliding
clamp dan DNA polimerase. Dengan hidrolisis ATP, clamp loader terlepas dari sliding clamp
sehingga DNA polimerase menempel pada sliding clamp. Sliding clamp hanya dapat
berikatan pada polimerase selama terjadinya sintesis utas tunggal DNA. Jika DNA rantai
tunggal sudah habis, polimerase mampu berikatan dengan subunit pada clamp loader dan
bergerak ke posisi baru pada lagging strand. Pada leading strand, DNA polimerase III
bergabung dengan clamp loader dan berikatan dengan sliding clamp.
Replikasi DNA kromosom prokariota, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus
pertumbuhannya. Daerah ori pada E. coli, misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan
protein inisiator DnaA, yang masing-masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini
sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju
pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi; DNA kromosom
prokariota dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ori yang baru terbentuk sebelum
putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima
kromosom yang sebagian telah bereplikasi.
Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga 40 buah molekul,
yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP. Daerah ori akan mengelilingi kompleks
DnaA-ATP tersebut. Proses ini memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua
untai DNA berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan
pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT sehingga
memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan enzim helikase, yaitu
enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang
kedua untai DNA dan memisahkannya.
Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh protein
pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (Ssb) untuk melindungi DNA
untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian
akan menempel pada DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau
menginisiasi sintesis pada untai pengarah. Agar replikasi dapat terus berjalan menjauhi ori,
diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena pembukaan heliks akan diikuti oleh
pembentukan putaran baru berupa superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi
secara alami ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain,
yaitu topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini
merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah
berlanjutnya replikasi DNA bakteri.
Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai pengarah maupun pada
untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks yang disebut primosom akan
menyintesis sejumlah RNA primer dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom
terdiri atas helikase DnaB dan DNA primase.
Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami elongasi
dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini merupakan
dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai
tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang
sama.
Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas subunit a, yang
mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e, yang mempunyai fungsi
penyuntingan berupa eksonuklease 3’– 5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan
polimerase pada DNA.
Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase III, mereka akan segera
dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA
polimerase I, yang mempunyai aktivitas polimerase 5’ – 3’, eksonuklease 5’ – 3’, dan
eksonuklease penyuntingan 3’ – 5’. Eksonuklease 5’ - 3’ membuang primer, sedangkan
polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan
dipersatukan oleh enzim DNA ligase. Secara in vivo, dimer holoenzim DNA polimerase III
dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom.
Dengan adanya replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.
Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180 °C dari ori. Di sekitar daerah
ini terdapat sejumlah terminator yang akan menghentikan gerakan garpu replikasi.
Terminator tersebut antara lain berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB.
Ketika replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan
oleh enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian
disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.
Pada eukariota, replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki
fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase
tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan
diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan
melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada
masing-masing ori.
Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariota bergerak
hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus
dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan
diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu
sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia.
Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara
serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal
adalah eukromatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. Daerah
sentromer dan telomer dari DNA bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan
aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.
Seperti halnya pada prokariota, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut
dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan
kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi.
Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer
dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a.
Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA
polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA
polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d
untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear
sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b
holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan
histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.
Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu
replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat
divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi.
Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan
visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan
antibodi yang mengenali BUdR.
Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat
menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian,
informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom
eukariota (telomer) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi
informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung
molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif
tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens
repetitif pada ujung 3’.
Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis
pada organ
Salah satu sumber kesalahan DNA adalah pada kesalahan replikasi yang dipengaruhi oleh
berbagai factor, diantaranya karena kondisi lingkungan dan kesalahan replikasi sendiri
sehingga menyebabkan terjadinya mutasi. Supaya replikasi sel dari generasi ke generasi tidak
terjadi kesalahan maka perlu ada repair DNA. Selain karena kesalahan replikasi, DNA juga
sangat rentan terhadap bahan kimia, radiasi maupun panas (hal yang dapat menyebabkan
mutasi pada DNA pada saat replikasi).
Replikasi terjadi dengan proses semikonservatif karena semua DNA double helix. Hasil
replikasi DNA double strand. Kedua DNA parental strand bisa menjadi template yang
berfungsi sebagai cetakan untuk proses replikasi: Semikonservaative process. Primer strand :
Pada 3’ dia akan melepaskan 2P dipakai sebagai energy untuk menempelkan, tetapi pada 5’ P
tidak bisa dilepas karena ketiga P dibutuhkan sehigga tidak ada energy sehingga tidak pernah
terjadi sintesis dari 3’-5’, tetapi dari 5’-3’, jadi yang menambah selalu ujung 3’.
DNA polymerase
Pada proses replikasi DNA terdapat enzim sentral, yaitu DNA polymerase. Pada proses
replikasi, DNA polymerase hanya bisa menempel pada gugus OH (hidroksil) dimana gugus
OH hanya ada pada ujung 3’ sedangkan ujung 5’ adalah ujung fosfat. (ciri utama DNA
polymerase). Ciri kedua: DNA polymerase tidak bisa mensintesis/ menempelkan DNA ke
pasangan-nya kalau tidak ada primer (lokomotif). Sifat dari DNA polymerase dia hanya bisa
mensintesis DNA dari arah 5’-3’ sehingga pertumbuhan dari 5’-3’ karena penambahan pada
ujung 3’, dimana pada ujung 3’ ada ujung hidroksil.
Ciri lain DNA polymerase: membutuhkan primer, tidak bisa mensintesis DNA tanpa adanya
primer, primer yang dipakai adalah RNA (sekitar 4-5 basa dan dilanjutkan DNA). DNA yang
dibutuhkan adalah DNA primase untuk meletakkan RNA pada tempatnya. DNA primase
untuk mensintesis RNA sebagai lokomotif (4-5 basa). Bila lokomotif sudah jadi maka akan
di-take over oleh DNA polymerase, dan yang ditambahkan adalah DNA.
Pada Proses replikasi di butuhkan titik awal (replication origin) biasa di singkat ORI. Contoh
pada plasmid (prokariot), terdapat proses replikasi yang dimulai pada replication origin dan
mengembang sampai dihasilkan 2 plasmid yang sama persis. Tetapi pada eukariot (mamalia)
lebih kompleks tetapi tetap membutuhkan replication origin.
Pada mamalia ada beberapa replication origin (replication bubble) yang akan bergabung satu
sama lain. DNA harus terbuka dahulu baru bisa digandakan. Origin replication disebut
sebagai unique sequence yang merupakan pertanda sebagai tempat proses/titik mulai
terjadinya replikasi, dimana ada protein tertentu yang akan mengenali sequence. Pada bakteri
(prokariot) hanya butuh satu titik ORI (origin of replication) sedangkan pada mamalia
(eukariot) butuh beberapa ORI karena kalau hanya 1 ORI akan butuh waktu 3 minggu untuk
mereplikasi 3 milyard DNA. Sehingga pada mamalia ada 30.000 titik ORI yang bekerja
secara bersamaan sehingga fase S untuk replikasi hanya butuh beberapa jam saja.
Untuk replikasi perlu sequence tertentu yaitu yang disingkat (ACS) merupakan urutan basa
yang sangat terjaga karena urutan basa tersebut dikenali oleh protein Origin Recognition
Complex (ORC) sehingga bila ORC mengenali sequence maka replikasi dapat dimulai. ORI
lebih global sedangkan ACS sudah pada sequence (pada urutan basa tertentu). Replikasi
terjadi pada fase S sedangkan transkripsi bisa terjadi pada fase S atau G1 dimana terjadi
sintesis protein maka bisa terjadi transkripsi.
Saat awal akan di mulainya repliaksi, pada G1 akhir ORC mengenali sequence ACS,
kemudian ada molekul lain, juga helikase yang membentuk pre-replicative complex (pre-
RC). selanjutnya pada fase S degradasi fosporilasi ORC, degradasi fosforilasi Cdc6 maka
terbentuk bubble replication. Helikase membuka pilinan, topoisomerase yang memotong
pada titik tertentu.
secara singkat dalam siklus sel : Pada fase G2/M sudah ada 2 copy. Pada fase G1 persiapan, S
proses replikasi, G2/M sudah selesai
Kemudian terjadi proses replikasi. Karena arah DNA anti parallel maka perlu Leading-strand
dan lagging strand. Dari ORI didapatkan 2 replication fork.
Ada ORI dan helikase yang membuka pilinan terus sampai terbentuk replication bubble.
Selanjutnya perlu primase untuk membuka primary. Merah RNA, Biru DNA. Bubble
semakin besar, replikasi berlanjut dan 1 ORI akan membentuk 2 replication fork.
Pada leading strand karena arahnya sudah dari 5’-3’ maka tinggal menambah saja. Sedangkan
pasangannya (lagging strain) karena arahnya 3’-5’ maka hanya diam, tetapi pada titik tertentu
akan ditambahkan primase lagi dan akan mensintesis lagi dari arah 5’-3’ (okazaki fragmen:
fragmen2 potongan kecil yang terjadi pada saat replikasi pada lagging strain)-> Pada lagging
strand arahnya dari 3’-5’
Okazaki fragment: fragment potongan kecil pada saat replikasi yang terjadi pada lagging
strand template. Yang terjadi pd Okazaki fragment (OF): kita punya RNA primer sehingga di
OF ada RNA-DNA hybrid. Tetapi RNA harus dibuang oleh RNase H. Setelah itu untuk
menggantikan RNA dibutuhkan polymerase delta (delta) yang bisa bersifat exonuclease tetapi
juga bisa bersifat endonuclease, yaitu mereplace atau menempatkan dNTP. Pada saat RNA
dibuang maka akan digantikan dengan DNA polymerase delta yang baru sampai hilang sama
sekali. Tetapi masih belum lengkap karena masih ada celah sehingga perlu DNA ligase untuk
menempelkan. Akhirnya diperoleh 2 strain yang sama persis.
DNA Polimerase yang memiliki DNA single-strand binding protein monomer yang bertugas
untuk mencegah supaya DNA tidak hanya menempel dengan lawannya tetapi juga bisa
membentuk hairpins.
Karena sudah terbuka sehingga ada basa-basa tertentu yang saling berpasangan sehingga
terbentuk hairpins. Supaya tidak terbentuk hairpins maka didatangkan single strand binding
protein supaya tetap lurus dan tidak berbelok-belok.
Topoisomerase, cirinya memotong DNA pada tempat tertentu sehingga mudah untuk
memutar karena sudah dipotong. Tugasnya adalah memasangkan kembali DNA yang
terpotong.
Protein aksesori :
Brace protein, : Replication factor C (RFC), supaya DNA polimerasenya menempelnya stabil
(tidak mudah terlepas dari DNA template).
Sliding-clamps protein, supaya kedudukannya stabil dan tidak goyang2.
Proses pada leading dan lagging strand berlangsung secara bersamaan, tetapi proses pada
lagging bertahap. Ada DNA polimerase dan sliding clamps. Sintesis terjadi pada leading
strand terlebih dahulu. Pada tahap tertentu DNA primase akan ditambahkan sehingga clamps-
nya datang lagi. Setelah proses replikasi selesai maka RNA akan segera dibuang digantikan
dengan DNA yang baru.
Perangkat untuk replikasi: DNA polimerasi, brace, clamp, DNA helicase, single-strand
binding protein, primase, topoisomerase.
Setelah direplikasi ujung DNA harus ada telomere (ujung DNA). Bila tidak ada telomere
maka kromosom akan saling menempel sehingga kromosom tidak 46 tetapi dalam bentuk
gandeng2 (tidak diketahui).
Chromosome end:
Pada lagging strand, di akhir replikasi ujungnya akan dihilangkan, RNA juga akan
dihilangkan, sehingga hasil replikasi menjadi lebih pendek. Hal ini terjadi karena
menggunakan primer RNA untuk proses replikasi, dan RNA primer setelah replikasi harus
dibuang dan tidak bisa digantikan. Untuk mengatasinya maka diadakan telomerase yang
dibuat berkali-kali. (slide 76: TTGGGGTTGGGTTGGGG). Telomer dibuat oleh enzim
telomerase. Telomer: ujung yang merupakan non coding DNA sehingga kalau memendek
tidak akan menjadi masalah karena tidak mengkode apapun. Telomer diadakan untuk
mengantisipasi pada saat replikasi karena DNA akan memendek. EXTENDS 3’ PRIMARY
GENE --> TELOMERE, dan enzim yang membuatnya : telomerase. Semua sel selain stem
sel tidak punya telomere. Pada saat sel replikasi maka akan selalu memendek. Sampai pada
suatu titik tertentu yang merupakan signal bagi sel untuk berhenti membelah. Karena
kemampuan sel untuk membelah dibatasi oleh panjangnya telomerase. Pada saat telomere
memendek sampai batas tertentu maka akan memberikan sinyal bagi sel untuk berhenti
membelah. Sedangkan pada stem sel yang memiliki telomerase, maka kemampuan
membelahnya tidak terbatas karena pada saat telomere habis maka telomerase akan
membentuk telomere baru. Hal ini yang dimanfaatkan oleh sel kanker karena sel kanker
memiliki telomerase sehingga sel kanker dapat terus membelah. Manusia memiliki
kemampuan replikasi sel yang terbatas karena keterbatasan telomere, shg bila telomere habis
sel akan berhenti membelah
isme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap
generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel
akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan
sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker
juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase
Proses replikasi DNA terjadi menjelang proses pembelahan sel. Kegunaannya adalah
untuk menggandakan DNA pada suatu mahluk hidup. Urutan DNA yang terbentuk harus
sama dengan DNA asalnya
Proses ini dikatalisis oleh enzim helikase. Enzim ini menghidrolisis ATP pada DNA
rantai tunggal.
Pemanjangan rantai DNA baru
Replikasi DNA bersifat semidiskontinyu, artinya salah satu rantai mengalami replikasi
secara kontinyu, sedangkan rantai lainnya mengalami replikasi secara terputus-putus.
Rantai yang mengalami replikasi secara kontinyu disebut jalur cepat, yaitu jalur yang
memanjang dari arah 5� ke 3�. Sedangkan jalur yang memanjang pada arah 3� ke
5� disebut jalur lambat karena terdiri atas fragmen yang terputus-putus.
Fragmen Okazaki adalah rantai DNA baru yang terbentuk secara terputus-putus.
Pada akhir proses replikasi, terbentuk dua pasang rantai DNA. Masing-masing rantai
DNA itu akan membentuk rantai ganda, sehingga didapat dua pasang rantai ganda.
REPLIKASI DNA
Definisi Replikasi
Bahan genetik yang ada pada setiap jasad akan mengalami proses perbanyakan sebagai
salah satu tahapan sangat penting dalam proses pertumbuhan sel atau perbanyakan
partikel virus. Proses perbanyakan bahan genetik dikenal sebagai proses replikasi. Replikasi
bahan genetik dapat dikatakan sebagai proses yang mengawali pertumbuhan sel, meskipun
sebenarnya pertumbuhan merupakan suatu resultan banyak proses yang saling berkaitan
satu sama lain. Sel mempunyai mekanisme replikasi bahan genetik yang dilengkapi dengan
system penyutingan (editing) yang sangat akurat sehingga bahan genetik yang diturunkan
kepada sel anakan (progeny) mempunyai komposisi yang sangat identik dengan komposisi
bahan genetik sel induk. Replikasi bahan genetik diikuti oleh pembentukan sel-sel anakan
yang membawa duplikat bahan genetik hasil replikasi. Sehingga kesalahan dalam proses
replikasi bahan genetik dapat mengakibatkan perubahan pada sifasifat sel anakan.
Mekanisme replikasi bahan genetik sangat kompleks dan melibatkan banyak protein yang
masing-masing mempunyai peranan spesifik. Protein-protein yang terlibat di dalam proses
replikasi bahan genetik dikode oleh gen-gen yang terdapat di dalam bahan genetik itu
sendiri. Oleh karena itu, ada kaitan fungsional yang sangat erat dan tidak terpisahkan antara
proses replikasi bahan genetik dengan proses ekspresi genetik dan metabolisme sel secara
keseluruhan. Hambatan yang terjadi pada proses metabolisme, misalnya penghambatan
produksi energy, dapat pula mempengaruhi proses replikasi karena replikasi juga
memerlukan pasokan energy.
1. Semikonservatif yang dikemukakan oleh Watson dan Crick, dimana setiap molekul
untaian ganda DNA anakan terdiri atas satu untaian-tunggal DNA induk dan satu
untaian-tunggal DNA hasil sintesis baru.
2. Konservatif. Molekul DNA untaian-ganda induk tetap bergabung sedangkan kedua
untaian DNA anakan terdiri atas molekul hasil sintesis baru.
3. Dispersif, menyatakan bahwa molekul DNA induk mengalami fragmentasi sehingga
DNA anakan terdiri atas campuran molekul lama (berasal dari DNA induk) dan
molekul hasil sintesis baru.
Gambar macam-macam hipotesis mekanisme replikasi DNA
Sel E.coli yang berkembang pada medium 15N ditransfer ke medium baru yang hanya
mengandung isotop 14N, dimana sel-sel tersebut dibiarkan berkembang sampai populasi sel
menjadi berlipat ganda. DNA yang terisolasi dari generasi pertama sel membentuk pita
tunggal pada gradient CsCl pada posisi yang mengindikasikan bahwa DNA helik ganda dari
sel turunan merupakan hibrida yang mengandung satu strand 14N baru dan satu stran 15N
inang.
Hasil ini menumbangkan replikasi konservatif, hipotesis lain dimana satu turunan molekul
DNA akan terdiri dari dua strand DNA hasil sintesa baru dan yang lainnya akan
mengandung dua strand inang, sementara tidak akan dihasilakan molekul DNA hybrid pada
percobaan Meselson-Stahl. Hipotesis replikasi semikonservatif kemudian mendukung
langkah selanjutnya pada percobaan. Pada medium 14N, sel dibiarkan mengganda, dan
produk hasil DNA dari lingkaran kedua replikasi ini menunjukan dua pita, satu memiliki
densitas yang sama dengan DNA ringan dan yang lainnya memiliki densitas DNA hybrid
yang diamati sel pertama menggandakan diri. Hasil eksperimen seperti gambar dibawah ini:
Meskipun demikian, bukti-bukti baru menunjukkan adanya penyimpangan dari teori replikasi
semacam ini. Diketahui bahwa mekanisme replikasi DNA pada virus tertentu, misalnya virus
ϕX174, yang genomnya berupa DNA untaian-tunggal, melibatkan tahapan proses replikasi
DNA dengan mekanisme yang berbeda yaitu dengan model konservatif, meskipun hanya
pada tahapan tertentu.
keterangan: (1) Lagging strand; (2) Leading strand; (3) DNA polimerase; (4) Enzim DNA
ligase; (5) Primer; (6) Primase; (7) Fragmen Okazaki (8) Molekul DNA polymerase;
(9) Enzim helikase; (10) Protein pengikat untaian tunggal; (11) Topoisomerase
1. Heliks ganda DNA (merah) dibuka menjadi dua untai tunggal oleh enzim helikase (9)
dengan bantuan topoisomerase (11) yang mengurangi tegangan untai DNA.
2. Untaian DNA tunggal dilekati oleh protein-protein pengikat untaian tunggal (10) untuk
mencegahnya membentuk heliks ganda kembali.
3. Primase (6) membentuk oligonukleotida RNA yang disebut primer (5)
4. Molekul DNA polimerase (3) & (8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak
sepanjang untai tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA
baru yang disebut leading strand (2) dan lagging strand (1).
5. DNA polimerase yang membentuk lagging strand mensintesis segmen-segmen
polinukleotida diskontinu (disebut fragmen Okazaki (7)).
6. Enzim DNA ligase (4) kemudian menyambungkan potongan-potongan lagging
strand.
3. Pemanjangan Untaian DNA. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan
menambahkan nukleotida dalam hal ini, deoksiribonukleotida ke ujung 3′ hidroksil bebas
nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai DNA baru (DNA
“anak”) disintesis dari arah 5′→3′, sedangkan DNA polimerase bergerak pada DNA “induk”
dengan arah 3′→5′. Namun demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi
berorientasi 3′→5′, sementara untaian lainnya berorientasi 5′→3′, dan helikase bergerak
membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5′→3′. Oleh karena itu, replikasi harus
berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut.
4. Pembentukan Leading strand. Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading strand)
ialah untaian DNA disintesis dengan arah 5′→3′ secara berkesinambungan. Pada untaian
ini, DNA polimerase mampu membentuk DNA menggunakan ujung 3′-OH bebas dari
sebuah primer RNA dan sintesis DNA berlangsung secara berkesinambungan, searah
dengan arah pergerakan garpu replikasi.
5. Pembentukan Lagging strand. Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi
yang berseberangan dengan leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis
dalam segmen-segmen yang disebut fragmen Okazaki. Panjang fragmen okazaki mencapai
sekitar 2.000 nukleotides panjang dalam sel-sel bakterial dan sekitar 200 panjang
nukelotides dalam sel-sel eukaryotic. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA.
DNA polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3′ bebas pada primer
RNA tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5′→3′. Fragmen primer RNA tersebut
lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan
deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh
RNA. DNA ligase lalu menyambungkan fragmen-fragmen Okazaki tersebut sehingga
sintesis lagging strand menjadi lengkap.
DNA polymerases tidak mampu ‘mengisi’ ikatan covalent yang hilang. Celah yang tersisa
direkat oleh DNA ligase. Enzim ini mengkatalis pembentukan ikatan phosphodiester antara
3’ – OH dari salah satu helaian dari 5’-P dari helaian yang lain.DNA ligase diaktifkan oleh
AMP (adenosine monophosphate) sebagai ‘cofactor’ (faktor pengendali). Dalam E.coli, AMP
dibawa dari nucleotide NAD+. Dalam sel-sel eukaryotik, AMP ditandai dari ATP. Ligase-
ligase tidak dilibatkan dalam pemanjangan rantai; melainkan, mereka berperan pemasang
enzim-enzim untuk perekatan ‘celah’ melalui molekul DNA.
Pola methylasi melindungi DNA dari cernaan oleh sel yang memiliki endonucleases tapi
tidak melawan pembatasan enzim-enzim yang diproduksi sel-sel spesies yang lain.
Pembatasan ini menyederhanakan pertukaran DNA antar sel dari spesies yang diproduksi
sel-sel spesies yang berbeda. Methylasi DNA pada titik-titik tertentu mungkin akan berakhir
pada konversi terdekat dari B-DNA ke bentuk-bentuk Z-DNA. Dalam bentuk B-DNA, grup-
grup hydropholic methyl dari alur utama, menghasilkan pengaturan yang tepat. Dengan
mengubahnya ke bentuk Z, grup-grup methyl membentuk area hydropholik yang membantu
menstabilkan DNA. Konversi lokal ini (dari B-DNA ke Z-DNA) mungkin mempengaruhi fungsi
beberapa gen.
Enzim-enzim yang berperan dalam proses replikasi DNA
mensintesis RNA-primer