Housekeeping genes & normalisasi

Pada eksperimen PCR kuantitatif real-time, kesalahan tertentu dapat dilihat

karena adanya perbedaan kecil pada jumlah awal, kualitas atau perbedaan RNA
dalam efisiensi sintesis cDNA dan amplifikasi PCR. Untuk meminimalkan
kesalahan ini dan mengoreksi variasi sampel ke sampel, RNA seluler sama-sama
diperkuat oleh target yang berfungsi sebagai referensi internal terhadap nilai RNA
lain yang dapat dinormalkan. Gen yang paling banyak digunakan untuk normalisasi
disebut Housekeeping genes, adalah β-aktin, protein sitoskeletal, dan
glceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), enzim glikolitik, dan
ribosom RNA (rRNA). Gen ini secara teoritis diekspresikan pada tingkat yang
konstan di antara jaringan yang berbeda pada organisme dalam semua tahapan
perkembangan, serta tingkat ekspresinya harus tetap relatif konstan pada percobaan
yang berbeda. Namun, tidak satu pun dari Housekeeping genes ini ideal. Telah
terlihat bahwa tingkat ekspresi GAPDH diubah oleh glukosa, insulin, heat shock
dan proliferasi sel dan tingkat β-aktin yang dapat dimodifikasi dengan tindakan
eksperimental. Produksi rRNA cenderung kurang bervariasi pada kondisi yang
mempengaruhi transkripsi mRNA. Namun, itu tidak selalu mewakili populasi
mRNA total dalam sel karena rRNA diekspresikan pada tingkat yang jauh lebih
tinggi daripada mRNA. Gen-gen rumah tangga alternatif lainnya telah diusulkan
tetapi tidak ada yang sepenuhnya memuaskan dan tidak ada gen referensi tunggal
yang secara pasti telah diidentifikasi. Beberapa penulis menyarankan penggunaan
beberapa Housekeeping genes dalam satu percobaan dan bahwa ekspresi rata-rata
dari Housekeeping genes ini digunakan untuk normalisasi. Pemilihan
Housekeeping genes untuk setiap eksperimen spesifik harus dibuat sangat hati-hati
karena keandalan hasil tergantung pada pilihan Housekeeping genes yang paling
relevan menurut sel dan perlakuan eksperimental tertentu.
Deteksi amplifikasi
Terdapat dua ikatan umumnya. Ini termasuk agen doublestranded (ds)
DNA-intercalating (DNA-binding dyes) dan fluorescent probe. Yang pertama
termasuk SYBR Green 1 atau ethidium bromide merupakan metode yang paling
sederhana dan paling hemat karena amplicon-specific labeled hybridization probes
tidak diperlukan. SYBR Green 1 hanya berfluoresensi ketika disisipkan menjadi
dsDNA. Intensitas sinyal fluoresensi tergantung pada kuantitas dsDNA dalam
reaksi. Kekurangan utama metode ini adalah hasilnya tidak spesifik karena pewarna
mengikat semua dsDNA yang terbentuk selama reaksi PCR (yaitu, produk PCR
nonspesifik dan dimer primer). Dengan probe fluorogenic, amplifikasi nonspesifik
karena mispriming atau artefak dimer primer tidak menghasilkan sinyal sebagai
hibridisasi spesifik antara probe dan template yang diperlukan untuk emisi
fluoresensi. Probe fluorogenik juga dapat diberi label dengan pewarna yang
berbeda, sehingga memungkinkan deteksi amplikon yang mungkin telah dihasilkan
pada satu atau beberapa pasangan primer dalam PCR reaksi tunggal yang disebut
multipleks PCR real-time. Probe yang berbeda harus dikembangkan untuk
mendeteksi urutan yang berbeda. Berbagai ikatan diuraikan secara lebih rinci.
agen penghubung dsDNA-intercalating (pewarna yang mengikat DNA)
SYBR Green 1 adalah pewarna DNA nonsekuen spesifik yang menjadi
dsDNA (tidak mengikat DNA single-stranded) (GAMBAR 3). SYBR Green 1
memperlihatkan sedikit fluoresensi ketika tidak terikat dalam larutan tetapi
memancarkan sinyal fluoresensi yang kuat saat mengikat dsDNA. Peningkatan
sinyal fluoresensi terjadi selama polimerisasi dan menurun ketika DNA
terdenaturasi. Pengukuran fluoresen dilakukan pada akhir langkah saat
perpanjangan setiap siklus PCR untuk memantau peningkatan jumlah DNA yang
diperkuat. Keuntungan teknik ini relatif murah karena dapat digunakan dengan
sepasang primer untuk setiap target. Namun, karena dsDNA menghasilkan
fluoresensi, spesifisitas uji ini turun karena amplifikasi produk PCR nonspesifik
dan primer-dimer. Menghasilkan dan membandingkan kurva leleh (merencanakan
fluoresensi sebagai fungsi suhu) menggunakan LightCycler ™ (Roche Molecular
Diagnostics) (atau RotorGene, Smart Cycler, iCycler, Mx4000) salah satu metode
untuk meningkatkan spesifisitas reaksi.
Puncak leleh yang khas pada suhu leleh (Tm) dari amplikon
membedakannya dari artifak amplifikasi yang meleleh pada suhu yang lebih rendah
pada puncak yang lebih luas yang mungkin mengatur perangkat lunak dalam
memperoleh fluoresensi di atas suhu peleburan dimmer primer tetapi di bawah dari
suhu target. Masalah lain yang dapat dikendalikan adalah amplikon yang lebih lama
dapat menciptakan sinyal yang lebih kuat. Biasanya, SYBR Green I digunakan
dalam reaksi singleplex. Namun, ketika digabungkan dengan analisis titik leleh
dapat digunakan untuk reaksi multipleks. Reaksi SYBR Green 1 digunakan untuk
banyak aplikasi (mis., Deteksi viral load dan kuantifikasi sitokin).
Probe hidrolisis (misalnya, probe TaqMan)
Ikatan ini telah diuraikan sebelumnya dalam tinjauan ini (GAMBAR 1).
Sebuah primer maju dan mundur serta probe digunakan. Efisiensi pemeriksaan ini
bergantung pada 5-3’ aktivitas nuklease, enzim yang paling sering digunakan
adalah Taq polymerase, tetapi enzim apapun dengan aktivitas 5' nuclease dapat
digunakan. Probe oligonukleotida memiliki pewarna neon dan fluoresen yang
terikat secara kovalen pada ujung 5’ dan 3’. Berbagai pewarna fluorescent
digunakan termasuk 6-carboxyfluorescein (FAM), tetrachloro-6-
carboxyfluorescein (TET), hexacholoro-6-carboxyfluorescein (HEX), atau VIC.
Quenchers termasuk 6-carboxytetramethylrhodamine acid (TAMRA) atau 4-
(dimethylaminoazo) benzene-4-karboksilat (DABCYL). Ketika probe dan
quencher pewarna berdekatan memungkinkan FRET, dan emisi fluoresensi tidak
terjadi.
 Selama probe anneal PCR amplifikasi ke target dan Taq polymerase
memotong probe memungkinkan peningkatan emisi fluoresensi. Peningkatan
intensitas fluoresensi berbanding lurus dengan jumlah amplikon yang dihasilkan.
Ikatan TaqMan adalah tes PCR realtime yang paling banyak digunakan dan telah
digunakan untuk berbagai tujuan. Probe TaqMan yang mengikat alur kecil baru-
baru ini telah dikembangkan. Dalam ikatan ini, TAMRA standar pada ujung 3'
diganti dengan pemoles nonfluoresen dan sebuah molekul pengikat alur kecil juga
dimasukkan pada ujung 3'. Yang terakhir untuk menstabilkan kompleks probe
target dengan melipat ke dalam alur minor dari dsDNA. Selain itu, Tm dari probe
meningkat dan memungkinkan penggunaan oligoprobes yang sangat pendek (14
nukleotida) dan memberikan diskriminasi alelik yang lebih akurat. Dengan
demikian, TaqMan probe pengikat alur kecil ideal untuk mendeteksi polimorfisme
nukleotida tunggal dan untuk analisis kuantitatif alel metilasi.
Probe hibridisasi ganda
Metode ini divalidasi dengan tepat pada penelitian menggunakan instrumen
LightCycler (GAMBAR 4). Dua probe hibridisasi digunakan, satu membawa
fluorophore donor pada ujung 3' dan yang lainnya diberi label dengan fluorophore
akseptor di ujung 5'. Setelah tahap denaturasi, kedua probes hibridisasi ke urutan
target mereka dengan pengaturan ekor ke kepala selama langkah anil. Membawa
dua pewarna yang memungkinkan FRET. Pewarna donor di salah satu probe
mentransfer energi yang dapat menghilangkan fluoresensi pada panjang gelombang
yang berbeda. Fluoresensi berbanding lurus dengan jumlah DNA yang disintesis
selama reaksi PCR. Spesifisitas reaksi ini kemudian meningkat karena sinyal
fluoresen hanya terdeteksi ketika dua probe independen berhibridisasi ke urutan
target yang benar. Metode ini banyak digunakan untuk mendeteksi penyakit sisa
yang minimal setelah terapi dan kuantifikasi viral load.
Molecular beacons
Molecular beacons mengandung pewarna fluorescent dan quenching yang
terikat secara kovalen di kedua ujung molekul DNA beruntai tunggal. Mereka
dirancang mengadopsi struktur hairpin atau batang dan loop sementara bebas dalam
larutan untuk membawa pewarna fluorescent dan quencher di dekat FRET
(GAMBAR 5). Bagian loop melengkapi molekul nukleat target dan batang dibentuk
oleh lengan annealing sekuens pelengkap pada ujung urutan probe. Kedekatan
fluorophore dan pemadam dalam konfigurasi hairpin ini menekan fluoresensi.
Ketika urutan probe di loop hibridisasi ke urutan asam nukleat komplementer
selama annealing, perubahan konformasi terjadi sehingga memaksa batang
terpisah. Hal ini menghasilkan struktur linear dan pemisahan flurophore dari
quencher dye (FRET tidak terjadi) dan peningkatan emisi fluoresensi. Hibridisasi
baru terjadi pada tahap anil setiap siklus, dan intensitas fluoresensi yang dihasilkan
menunjukkan jumlah akumulasi amplikon pada akhir siklus sebelumnya. Molecular
beacon tetap utuh selama PCR dan harus rehybridize ke urutan target pada tiap
siklus emisi fluoresensi. Molecular beacons sangat cocok untuk mengidentifikasi
mutasi titik.
Scorpion
Mirip dengan beacon molekuler, Scorpion mengadopsi konfigurasi batang
dan loop dengan fluorophore quencher 5’ dan 3’ (GAMBAR 6). Urutan probe
spesifik dalam loop hairpin yang dilekatkan pada ujung 5' dari urutan PCR primer
oleh monomer yang tidak dapat diamputasi (disebut penghenti PCR). Modifikasi
ikatan ini mencegah PCR menyalin urutan stemloop primer Scorion. Selama PCR,
scorpion primer diperpanjang untuk membentuk amplikon. Pada fase anil, urutan
probe spesifik dalam ekor kalajengking mengerut kembali untuk hibridisasi ke
urutan target komplementer dalam amplikon, sehingga membuka loop hairpin. Hal
ini mencegah fluoresensi dari quenched dan sinyal diamati. Karena ekor
kalajengking dan amplikon sekarang menjadi bagian dari untaian DNA yang sama,
interaksinya menjadi intramolekul. Manfaat Scorpions ada pada elemen probe
secara fisik digabungkan ke elemen primer sehingga reaksi yang mengarah pada
pembentukan sinyal menjadi peristiwa unimolecular. Ini berbeda dengan
bimolecular collisions yang dibutuhkan oleh teknologi lain seperti TaqMan atau
molekuler beacons. Manfaat penataan ulang unimolekul secara signifikan efektif
pada reaksi yang seketika dan sinyal fluoresensi jauh lebih kuat. Perbedaan dan
spesifitas yang lebih baik menggunakan scorpion. Probe scorpion digunakan untuk
mendeteksi viral load dan mutasi. Scorpion dupleks adalah modifikasi dari
scorpion. Berbeda dengan scorpion (atau beacon molekuler), pewarna fluorophore
dan quencher dipisahkan ke oligonukleotida yang berbeda dan saling melengkapi.
Keuntungan dari scorpion dupleks adalah pemisahan yang secara signifikan lebih
besar antara quencher dan fluorophore reporter yang mengurangi proses quenching
fluorophore ketika probe terikat pada target yang menghasilkan intensitas sinyal
yang lebih baik dibandingkan dengan scorpion konvensional.
Desain primer, probe & amplicon
Perhatian besar harus masuk ke desain pengujian. Primer, probe dan
amplikon dirancang pada spesifikasi yang sangat spesifik dan sistem TaqMan
menyediakan perangkat lunak desain primer/probe sendiri dari Applied Biosystems
yang dikenal sebagai Primer Express, yang mungkin merupakan program desain
oligonukleotida yang paling banyak digunakan untuk mengembangkan pengujian
PCR kuantitatif real-time. Primer3 merupakan program gratis dari Massachusetts
Institute of Technology (MA, USA) yang dapat digunakan untuk menghasilkan tes
PCR real-time yang baik, termasuk desain yang menggabungkan probe hibridisasi
internal. Amplikon untuk produk PCR harus sekecil mungkin, biasanya 50-150 bp
panjang untuk desain menggunakan probe hibridisasi (dan kurang dari 300 bp untuk
tes SYBR Green). Amplikon yang lebih pendek memperkuat lebih efisien dan lebih
toleran terhadap kondisi reaksi. Panjang optimal untuk primer single-stranded
adalah 15-20 basis dengan konten G/C 20–80%. Tm mereka harus berada dalam
jangkauan 68-70°C untuk primer TaqMan. Molecular beacon dan hibridisasi probe-
primer yang terkait dapat memiliki rentang Tm yang lebih luas, tetapi Tm dari setiap
pasangan harus serupa (tidak berbeda >1-2°C). Priming non-spesifik diminimalkan
dengan memilih primer yang hanya memiliki satu atau dua G/C dalam lima
nukleotida terakhir di ujung 3'. Jika menggunakan pendekatan SYBR Green I, PCR
primer tidak boleh membentuk ikatan dimer primer dalam jumlah yang cukup
besar. Analisis kurva leleh setiap produk diperlukan untuk memastikan bahwa
sinyal fluoresensi yang diamati berasal dari produk PCR yang diinginkan. Dalam
tes ekspresi mRNA menggunakan probe hibridisasi, urutan probe harus mencakup
batas ekson jika memungkinkan. Probe Tm 8-10°C lebih tinggi dari primer
memastikan bahwa probe sepenuhnya hibridisasi selama ekstensi primer. Probe
TaqMan seharusnya tidak mengandung G di ujung 5' karena efek quenching dari G
dalam posisi ini pada fluoresensi reporter, bahkan setelah pembelahan probe.
Peralatan yang tersedia
Ada berbagai instrumen yang tersedia, masing-masing memiliki
karakteristik masing-masing (TABEL 1). Perhatian besar harus diambil ketika
memilih instrumen yang akan dibeli dan penting mencocokkan kemampuan
instrumen dengan kebutuhan laboratorium. Biaya tidak boleh menjadi satu-satunya
faktor ketika membuat pilihan, model yang lebih murah tidak dapat mengimbangi
varians dalam optik dan karena itu tidak mampu mendeteksi perbedaan yang lebih
kecil. Instrumen yang lebih tinggi mungkin lebih dari yang dibutuhkan. Sistem
Deteksi Urutan ABI Prism® 7700 (SDS) dari Applied Biosystems adalah
thermocycler komersial pertama yang tersedia untuk PCR real-time tetapi sekarang
telah dihentikan. Fluoresensi laser gelombang panjang yang berkelanjutan dari 500-
660 nm diperbolehkan untuk multipleks PCR. ABI Prism 7700 baru-baru ini
digantikan oleh ABI Prism 7900HT yang memiliki spesifikasi serupa dengan 7700
SDS tetapi sepenuhnya otomatis dan dirancang khusus untuk aplikasi yang sangat
tinggi (384 sampel/run). Pengenalan terbaru lainnya adalah ABI Prism 7000 SDS
yang lebih murah. Ini mempertahankan Peltier berbasis 96-well block thermal
cycling format ABI 7700, tetapi menggantikan laser dengan lampu tungsten-
halogen yang secara bersamaan menerangi semua sumur sampel. Perangkat lunak
yang disertakan dengan instrumen jauh lebih ramah pengguna dan berbasis
Microsoft Windows yang memungkinkan ekspor data dan plot amplifikasi dengan
mudah. Salah satu kelebihan utama instrumen ABI adalah pengumpulan data dari
sinyal referensi pasif untuk menormalkan setiap reaksi untuk varians dalam sistem
optik. Selain itu, Applied Biosystems meluncurkan sistem Biologi Terapan 7300 dan
7500 PCR Real Time yang menjadi alternatif yang lebih murah. LightCycler harga
rendah dari Roche Molecular Biochemicals menginduksi eksitasi fluoresensi oleh
pemancar dioda cahaya biru yang dibaca oleh tiga foto silikon dengan filter panjang
gelombang yang berbeda, memungkinkan deteksi fluorophores spektral yang
berbeda. Oleh karena itu, PCR multipleks dapat dilakukan. PCR menjalankan 30-
40 siklus dalam 20-30 menit tetapi hanya sejumlah sampel terbatas (maksimum 32)
yang dapat dianalisis secara bersamaan. LightCycler menganalisis kekhususan hasil
dengan melakukan kurva titik leleh, membuat penggunaan pewarna dsDNA-
binding seperti SYBR green I yang lebih bisa diandalkan. Namun, sebagai sampel
harus di kapiler daripada tabung, hal itu kurang praktis untuk pemeriksa.. ICycler
iQ dari BioRad Instruments memiliki lampu tungsten-halogen yang memungkinkan
eksitasi berbagai fluorofor (400-700 nm). Ia mampu melakukan multiplexing empat
fluorofor berbeda per tabung sampel. Alat tersebut juga memiliki modul optik yang
memungkinkan emisi fluoresensi untuk dilihat selama amplifikasi PCR. Dapat
melacak 96 sampel secara bersamaan, sehingga uji dapat dilakukan dengan cepat.
Modul yang baru saja diluncurkan memungkinkannya untuk memperkuat
384 sampel pada satu waktu. Opsi baru adalah Mx4000® Multiplex dari Stratagene.
Instrumen detektor ini mampu mendeteksi ikatan PCR multifluorescence, termasuk
TaqMan dan probe hibridisasi dan beacon molekul. Sumber cahaya untuk sistem
Mx4000 adalah lampu tungsten-halogen kuarsa yang menghasilkan kisaran eksitasi
dengan luas 350-750 nm dan ada empat tabung photomultiplier dengan jangkauan
deteksi 350-830 nm. Instrumen ini ideal untuk melakukan PCR multipleks. Yang
penting, sistem ini pada komputer pribadi yang terintegrasi beroperasi secara
independen dari mikroprosesor instrumen yang tertanam sehingga dapat mencegah
kehilangan data. Sistem Smart Cycler baru-baru ini tersedia dari Cepheid. Sistem
ini dapat dioperasikan dengan beacon molekuler, scorpion, probe hibridisasi, probe
TaqMan atau SYBR Green I. Keuntungan sistem ini adalah fleksibilitasnya yang
tinggi, karena berisi 16 modul yang berbeda. Setiap modul dapat diprogram secara
individual dan memiliki subsistem optiknya sendiri dan dapat mendeteksi empat
fluorofor berbeda dalam satu reaksi. Operator yang berbeda dapat menentukan
parameter dalam setiap reaksi dan melakukan uji yang berbeda secara bersamaan.
Kerugian dari sistem dasar adalah jumlah sampel yang kecil (maksimum 16),
namun dapat ditingkatkan menjadi 96 sumur per run. The Rotor Gene ™ 3000,
dirancang oleh Corbett Research adalah alat sentrifugal panas yang sebanding
dengan LightCycler. Ini menggunakan empat sumber cahaya dioda dengan
pemancar cahaya terpisah pada 470, 530, 585 dan 625 nm. Eksitasi dideteksi
menggunakan enam filter dan photomultipliers pada 510, 555, 610, 660, 580 dan
610 nm. Desain instrumen ini secara radikal berbeda dengan instrumen lain: reaksi
real-time dilakukan dalam tabung microfuge standar di dalam rotor 36- atau 72-
well yang berputar dengan kecepatan 500 rpm. Ini diklaim dapat menghilangkan
waktu equilibrium suhu dan nonuniformity serta variasi sampel ke sampel <0,01°C.
Pendapat ahli
Pengenalan teknologi PCR real-time telah merevolusi bidang diagnostik
molekuler dan memungkinkan pergeseran diagnostik molekuler menuju keluaran
yang tinggi, teknologi otomatis dengan waktu perputaran yang lebih rendah. Hal ini
memungkinkan kuantifikasi mRNA yang sensitif, spesifik dan dapat diprodukasi
kembali. PCR real-time dikarakterisasi oleh rentang dinamis yang luas dari
kuantifikasi 7–8 dekade logaritmik, sensitivitas teknis tinggi (<5 eksemplar) dan
presisi tinggi (<2% standar deviasi). Tidak ada langkah pasca-PCR yang
diperlukan, sehingga menghindari kemungkinan kontaminasi silang akibat produk
PCR. Kerugian PCR kuantitatif real-time bila dibandingkan dengan PCR
konvensional, meliputi:
• Ukuran Amplikon tidak dapat dimonitor tanpa membuka sistem.
• Kemampuan multipleks yang terbatas dari instrumen yang ada.
• Ketidakcocokan beberapa sistem dengan beberapa ikatan fluorogenik.
Teknologi PCR real-time hanya dapat diandalkan dengan kontrol yang
menyertainya dan program jaminan kualitas terkait. Termasuk kualitas standar dan
pilihan Housekeeping genes (pencarian untuk Housekeeping genes atau protokol
yang ideal), penggunaan kurva standar yang dikontrol secara tepat dan kebutuhan
agar dapat sepenuhnya optimal, memvalidasi dan mengevaluasi semua pengujian
terhadap standar tuji sebelumnya. Tanpa kepedulian seperti itu, PCR real-time akan
menyediakan sejumlah besar data yang cepat namun tidak akurat.
Prediksi lima tahun
Konfirmasi tingkat ekspresi gen yang dipilih dari eksperimen microarray
akan terus dilakukan menggunakan metode PCR real-time. Ini karena teknologi
microarray membutuhkan jumlah material awal yang tinggi dan hanya
menampilkan rentang dinamis yang terbatas untuk kuantifikasi. Oleh karena itu,
kombinasi dari kedua teknologi skrining gen yang terlibat dilakukan oleh
microarray serta kuantifikasi yang tepat dan tinggi sepanjang skrining dilakukan
oleh PCR real-time sebagai metode yang ideal. Demikian pula teknologi PCR real-
time akan terus dikombinasikan dengan teknik mikrodiseksi lanjut atau asam
nukleat yang diperoleh dari sampel fix parafin. Deteksi dan analisis sisa penyakit
yang minimal dan viral load akan tetap menjadi aplikasi penting. Dimungkinkan
juga untuk mengukur ekspresi gen atau nomor salinan DNA dalam sel-sel tertentu
yang terisolasi dengan kesulitan dan hanya dalam jumlah yang sangat kecil. Teknik
real-time akan digunakan dalam analisis sampel klinis untuk membantu dokter
dalam prognosis dan manajemen pasien. Menggabungkan teknik untuk menyortir
sel-sel janin atau DNA dari sirkulasi ibu dengan PCR real-time akan
memungkinkan diagnostik prenatal dini dari berbagai kelainan kongenital
menggunakan prosedur minimal invasif. Perbaikan desain instrumentasi real-time
dan pengembangan tag FRET kombinatorial akan membuat PCR real-time
multipleks meningkat di masa depan. Selain itu, perusahaan-perusahaan
bioteknologi besar saat ini sedang mengerjakan proyek-proyek di mana semua tes
spesifik secara otomatis dikembangkan untuk semua polimorfisme nukleotida
tunggal yang diidentifikasi selama program sekuensing. Tes ini cenderung menjadi
bidang penting dalam diagnostik molekuler di masa depan