INSULIN ASPART MEMENGARUHI RESUMSI MEIOSIS PADA OOSIT

IKAN LELE (Clarias grapienus)

PENDAHULUAN

Insulin adalah hormon pusat untuk mengatur karbohidrat dan lemak

metabolisme dalam tubuh. Dalam sel target, insulin memulai transduksi sinyal
yang memiliki efek meningkatkan penyerapan glukosa dan penyimpanan, dan
akhirnya ketika insulin dikurangi maka responnya juga akan berkurang. Studi
sebelumnya telah melaporkan bahwa insulin faktor pertumbuhan-1 (IGF-1) juga
dapat menginduksi pematangan oosit ikan yang tidak dibuahi (Weber dan
Sullivan, 2000 ; Weber dan Sullivan, 2005 ; Mukherjee, dkk, 2006), tetapi bukti
langsung untuk aktivitas insulin masih kurang. Penggunaan insulin pada proses
meiosis menyebabkan terjadinya stimulasi enzim phospodi esterase (Sadler, dkk,
1990). Insulin memulai efek biologis oleh aktivitas reseptor yang mengandung
protein tyrosin kinase (Chuang, dkk, 1993). Pengikatan insulin untuk reseptornya
akan menghasilkan sinyal yang diteruskan kedalam sitoplasma oosit. Untuk
mendapatkan respon akhir dari sel, dibutuhkan sebuah docking protein yang
merupakan substrat dari insulin reseptor 1 (IRS-1 )untuk menghubungkan dengan
sinyal insulin. IRS-1 berperan penting dalam menghubungkan IGF-I dan insulin
untuk respon akhir sel (Chuang, dkk, 1993). Selanjutnya sinyal dari IRS-1 akan
mengaktifkan cascade berikutnya terutama phosphatidy linositol 3-kinase (PI3
kinase) dan mengaktifkan mitogen protein kinase (MAPK) (Mukherjee, dkk,
2006 ; Paul dkk, 2009), p21 ras (Sadler dkk, 1990), Phospodiesterase (PDE)
(Sadler dan Maller, 1987) yang pada gilirannya akan mengaktifkan maturation
promoting factor (MPF) untuk mencapai germinal vesicle breakdown (GVBD)
(Nagahama dkk, 1994 ; Masui, 2001), sebagai penanda terjadinya meiosis pada
oosit ikan.
 Pematangan oosit ikan, adalah sebuah pematangan akhir yang dimulai
ketika proses menangkap profase-I untuk reinitiation dan menyelesaikan pada
meiosis-I sampai mereka berhenti pada metafase-II (Yamashita, 2000 ; Masui,
2001 ; Suwa dan Yamashita, 2007 ; Nagahama dan Yamashita, 2008). Puncak
pencapaian aksi hormon sekuensial untuk merangsang pematangan adalah aktivasi
dari MPF (Nagahama dkk, 1995). Pematangan ofteleosts oosit dikendalikan oleh
kombinasi dari faktor eksogen dan endogen. Rangsangan lingkungan
diterjemahkan oleh otak melalui sinyal saraf yang mengakibatkan pelepasan
gonadotropin releasing hormone (GnRH) dan larangan melepaskan gonadotropin
release inhibiting factor (GnRIF) menyebabkan keluarnya lendir (pituitary) untuk
menyekresikan gonadotropins (GTHs) (Peter dkk, 1988). Ketika jumlah dari GTH
sudah cukup , oosit vitellogenik akan menjalani proses pematangan oosit akhir,
vesikula germinal berpindahke wilayah pinggiran, theca dan granulosa sel folikel
dirangsang untuk mensekresi pematangan yang merangsang steroid (MIS), dan
MIS menginduksi kerusakan germinal vesikula (GVBD) (Fostier dan Jaiabert,
1982 ; Goezt, 1983 ; Nagahama dkk, 1995). Periode pertumbuhan oosit diikuti
oleh proses yang disebut pematangan oosit yang terjadi sebelum ovulasi dan
merupakan prasyarat bagi suksesnya pembuahan. Pematagan oosit didefinisikan
sebagai reinitiation dan penyelesaian bagian meiosis I. Selanjutnya untuk
metafase II, pada beberapa spesies seperti ikan mas kejadian pertama pada
pematangan oosit adalah berpindahnya vesikula germinal (GV) menuju kutub
hewan dan sering digunakan sebagai indikator awaldari pematangan oosit
(Yamashita ,2000). Setelah GV bermigrasi, beberap proses terjadi di nukleus dan
sitoplasma dari oosit, termasuk kerusakan dari GVBD.

Menekan produksi cAMP oleh siklik adenilat siklase (AC), menyediakan

mekanisme yang memungkinkan untuk proses pematangan oosit. Dengan
demikian, paparan substranse yang lain yaitu cyanoketon dan forsklorin
penggerak dari adenilat siklase (AC), sodium arsenit, natrium arsenit, natrium
azide, menadione, sorbitol, dinitrophenol, hidrogen proksida, 8-bromo-adenosin
dan 5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside (AICAR) dapat
menurunkan tingkat cAMP dan zat tersebut dapat dipertimbangkan/dianggap
sebagai penstimulasi untuk memulai pematangan in vitro oosit.
 Hipotesis bahwa insulin dapat menurunkan tingkat cAMP yang paling
menonjol diantara transduser yang menghambat AC oleh pengaktifan PDE di
sekitar membran perifer. Oleh karena itu, dalam penelitian terbari ini kita
menyingkap oosit ikan lele oleh insulin aspat, sebuah obat komersial yang lebih
murah dan lebih mudah didapat.

ISI

1. Metode
a) Hewan
Clarias grapienus menunjukkan kematangan gonad musiman yang
biasanya berhubungan dengan musim hujan. Proses pematangan C. gapineus
dipengaruhi oleh perubahan tahunan pada temperatur suhu air dan
photoperiodicity dan akhirnya dicetuskan bahwa ikan bertelur disebabkan
oleh naiknya permukaan air akibat curah hujan (de Graft dkk, 1995). Sevara
alami mereka bertelur pada bulan Juli sampai November, setelah itu
pendewasaan oosit secara barangsur-angsur dan menjadi matang lagi pada
bulan Maret. Lele yang digunakan untuk semua percobaan adalah yang berat
tubuhnya sekitar 700-1200 gram, panjang tubuhnya 400-600 mm yang
menyesuaikan diri pada luasnya laboratorium comet tank aeration pada suhu
29±2oC setidaknya selama 1 minggu sebelum percobaan. Lele-lele itu diberi
makan secara ad libitum (semaunya, tanpa memperhatikan takaran atau
jumlah) dengan perikanan (Hi-pro-vit 786 yang diproduksi oleh PT. Central
Pangan Pertiwi, Indonesia).

b) Bahan-bahan Kimia
Insulin aspart (Plexpen 70-250 unit/tabung), 17α, 20β-dihydroxy-4-
pregnen-3-one (DHP), ELISA-kit untuk cAMP dan asam okadic. Solusi
memberikan dibuat dengan mencampurkan etanol, formalin, dan asam asetat
(6:3:1 v/v) yang mengikuti metode Lessman (1984). Kemudian DHP
dilarutkan dalam etanol yang dipindahkan ke media sampai konsentrasi yang
diinginkan.
 c) Inkubasi untuk Pemotongan In Vitro
Ovarium yang dibedah dari ikan dibunuh dengan pemenggalan leher dan
segera ditempatkan dalam media Hank oksigen dingin. Ovarium dipotong
dari posterior ke daerah anterior dengan bantuan gunting halus dan gunting
tang kemudian dikupas untuk mengumpulkan folikel, yang kemudian segera
direndam dalam media. Folikel yang sepenuhnya dewasa kemudian dicuci 5x
dengan media dan sekitar 2.400 dari lele-lele itu ditempatkan pada masing-
masing petridish Ф7 cm yang menampung 10 ml media. Media dilengkapi
dengan penicilin (100 U/ml) dan streptomisin (100ng/ml) dan dengan gas O2
95 % dan CO2 5 %. Kelangsungan hidup folikel ovarium terdeteksi
menggunakan 0,1 % trypan blue dye exclusion. Setiap percobaan yang baik
dengan bahan kimia yag sama atau berbeda dilakukan dengan menggunakan
sfolikel dari satu ikan. Inkubasi folikel ovarium dilakukan 30±1oC dengan
goncangan yang hati-hati di suhu udara. Folikel yang tidak dierami selama 2
jam sebelum ditambahkan dengan insulin dan bahan kimia. Waktu 2 jam
preinkubasi kelihatannya baik untuk melepaskan shock karena bedah yang
dilakukan sebelumnya. Folikel yang diinkubasi pada periode waktu yang
berbeda atau sampai 24 jam pada 30±1oC dengan tidak adanya (kontrol) atau
kehadiran hormon. GVM dan GVBD dimonitor setiap jam dan menyatakan
persentase asa dari jumlah. Proses pematangan dinilai dengan merendam
oosit dalam larutan pembersih yang mengandung ethanol/formalin/asam
asetat ; 6:3:1 (Levavi dan Yaron, 1986). Solusi clearing ini diterapkan dengan
mengambil masing-masing sampel untuk mengamati yang memberikan
transparansi melalui folikel, sehingga memungkinkan pemeriksaan mudah
dengan mikroskopis dari tahap kematangan oosit berikut, seperti germinal
vesicle (GV), permulaan dari migrasi GV, migrasi perifer GV, dan GVBD.

d) Pengujian Kadar Logam cAMP

Konsentrasi AMP siklik diukur menggunakan ELISA-kit, mengikuti
metode Pradelless dkk. Pada hari dilakukannya analisis sampel diencerkan
dengan assay penyangga (disedikan dengan kit). Sampel (50 µl) direaksikan
 dengan 50 µl setiap cAMP-acetycholine esterase (AchE) dan cAMP antibodi
pada monoklonal tikus ant- kelinci IgG, diikuti oleh 18 jam inkubasi pada
suhu 4oC. Setelah inkubasi larutan yang tertuang dibilas 5x dengan
penyangga. 200 µl reagen Ellman (disediakan kit) ditambahkan ke sumur dan
diinkubasi dalam gelap untuk 90-120 menit untuk pembentukan warna
optimal (0,3-0,8 a.u., setelah pengurangan kosong). Gambar dikembangkan
dibacakan pada 405 nm pembaca ELISA. Total konsentrasi cAMP dihitung
sebagai pmol/mg oosit.

e) Analisis Data
Data dianalisis dengan analisis satu arah varian (ANOVA). Dimana
nilai F menunjukkan signifikansi, berarti dibanding dengan beberapa
tes jangkauan. Semua nilai-nilai yang dinyatakan sebagai ±SEM

HASIL

Gambar 1 menunjukkan migrasi GV dalam satu oosit dalam menanggapi

insulin. Hal ini dapat dilihat dari gambar 1a dan 1d yang GV nya terletak dipusat
oosit dan penambahan insulin itu mulai bermigrasi ke arah mikrofil disitus perifer
pada 6 jam (Gambar 1b-c). Selama 6 jam inkubasi beberapa oosit mulai berubah
noda bintik gelap palsu yang dianggap sebagai vesikel germinal (GV). GV
mencapai wilayah mikrofil dari tiang hewan pada 16 sampai 20 jam (Gambar 1d)
dan mulai untuk membubarkan (Gambar 1e) dari larutan yang utuh. GVBD terjadi
pada 20-24 jam (Gambar 1f). Memvisualisasikan gerakan germinal dan GVBD
seperti ditegaskan oleh oosit yang direndam selama 10-15 menit dalamlarutan
clearing. Pada oosit kontrol in vitro yang diinkubasi tanpa insulin GV tetap
dipusat pada akhir 24 jam tanpa adanya migrasi.

Pengaruh insulin aspart pada pembukaan meiosis, dengan dan tanpa

pengobatan bersamaan mulai dari 0,01 sampai 10 U/ml menunjukkan efek dari
variasi konsentrasi yang berbeda dari insulin aspart pada oosit GVBD pda tingkat
waktu yang berbeda (Gambar 2). Data yang ditampilkan adalah untuk oosit ikan
yang dipelihara dari Malang-Indonesia yang mengikuti 24 jam inkubasi setelah
penambahan hormon. Hasil terbaik yang diperoleh yaitu 1,0 U/ml yang merespon
baik progesteron sehingga dikombinasikan dengan 100 M progesteron.
 Menggabungkan pengobatan mencapai persentase tertinggi GVBD
stimulasi oosit (74,66%, Gambar 3). Pengobatan oosit dengan insulin aspart,
ditingkatkan dengan enambahkan progesteron dan DHP setidaknya 1-20 jam.
Konsentrasi terendah dimana jumlah insulin 0,01 U/ml tidak berpotensi
memberikan rangsangan pematangan, menunjukkan bahwa lele-lele itu tidak
cukup menginduksi meiosis kembali. Efek tertinggi insulin disebabkan mulainya
kembali meiosis yang diamati dengan 0,01 U/ml, peningkatan yang signifikan
dalam pembukaan kembali meiosis dibandingkan dengan kontrol (P <0,01) dapat
dideteksi 10 jam linier meningkat sampai16 jam. Pengobatan insulin (1 U/ml)
muncul untuk menginduksi lebih cepat dari yang lain tapi sampai 20 jam tidak ada
efek samping berkepanjangan dari pembukaan meiosis.
PENUTUP

Percobaan ini dengan menggunakan lele oosit dengan berbagai dosis

insulin aspartad dan tingkat waktu yang berbeda memberikan menunjukkan
keterlibatan cAMP di insulin dan induksi progesteron pematangan oosiit pada
lele. Total tingkat oosit cAMP menurun secara signifikan dan terus menerus
seiring dengan peningkatan GVBD. Perubahan serupa dengan yang dilaporkan
dalam (Clarias batrhacus) oosit lele setelah pengobatan 17-20 DP. Para pekerja
ini berkolerasi dengan perubahan tingkat cAMP dengan tahap morfologi oosit,
tinggi pada oosit GV terletak menurun sehubungan dengan migrasi GV dan
menurunkan oosit yang telah mengalami GVBD. Penurunan 10-21 % di tingkat
cAMP sudah cukup untuk menginduksi GVBD di Xenopus. Banyak penelitian
telah melaporkan penurunan 10-50 % di tingkat cAMP selama pematangan.
Icirelli dan Smith (1983) telah menemukan penurunan 20 % dalam isi cAMP dari
Xenopus selama 2-50 menit. Selain progesteron berikut, (Mailer, 1985) ulasan
yang berjarak 0,1 GVBD, penurunan yang cepat terjadi d tingkat cAMP sekitar
40-60 % dari basal setelah penambahan progesteron.

Besarnya penurunan cAMP masih diperdebatkan saat ini. Beberapa

penulis berpendapat bahwa penurunan ditingkat cAMP kecil dibanding dengan
peraturan cAMP oleh hormon di sel somatik. Tapi, Thaiber dkk (1982) telah
menghitung bahwa 10-20 % penurunan kadar cAMP akan cukup untuk memicu
peatangan oosit. Progesteron dan DHP juga merupakan stimulator yang sangat
ampuh untuk pada oosit ikan lele, mereka bertindak dalam dosis yang lebih
rendah dan menghasilkan efek yang jauh lebih besar dari insulin. Hal ini
diharapkan sebagai progesteron dan insulin memiliki dua kelas yang berbeda dari
reseptor di ovarium ikan. Tapi, tujuan percoban ini untuk melihat pengaruh dari
insulin aspart untuk digunakan dalam praktek budidaya. Di lapangan peternakan
induksi ikan ekonomis penting dan hampir mustahil menggabungkan
gonadotropin sintesis. Insulin aspart disisi lain,adalah tidak mahal dan mudah
tersedia. Gonadotropin melepaskan hormon, mengikat sel gonadotropin hipofisis,
merangsang GTH rilis, dan GTH pada gilirannya menginduksi produksi progestin
dari sel folikel ovarium, sangat ampuh untuk penarikan penangkapan meiosis.
Kami telah menemukan aktivitas pematangan progestin di lele oosit secara
signifikan ditambah dengan insulin aspart. Hal ini berdampak pada praktek
budidaya induksi hormonal ovulasi tergantung pada penarikan dan penangkapan
meiosis.