LAPORAN RESMI KULTUR JARINGAN

“Pembuatan Media Sederhana dan Inokulasi Eksplan

Daun Tanaman Belimbing (Averrhoa carambola)”

Disusun Oleh :
Nilam Cahya Ningrum
17030244048 / Biologi 2017E

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA

2019
 BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Kultur jaringan merupakan salah satu tekhnik memperbanyak suatu
tanaman dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang
sudah dalam keadaan steril. Teknik kultur jaringan bukan hanya digunakan
untuk beberapa tujuan seperti mendapatkan produksi metabolit sekunder,
mendapatkan keragaman seleksi dan pemuliaan tanaman.
Pada dasarnya langkah-langkah dalam melakukan proses kultur
jaringan ada 3 tahap, yaitu :
1. Tahap I atau disebut juga tahap persiapan eksplan
2. Tahap II atau disebut juga tahap penggandaan.
3. Tahap III atau disebut juga tahap pendewasaan. (D.F.
Wetherell,1976).

Langkah pertama yang harus dilakukan apabila akan melakukan

kultur jaringan adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai, karena akan
menyangkut materi yang akan digunakan. Misalnya tujuannya ingin
memperbanyak tanaman dengan hasil yang sesuai dengan induknya, maka
dilakukan kultur meristem atau kultur kalur. Apabila tujuannya ingin
mendapatkan tanaman yang homozigot, dilakukan kultur anther. Langkah
berikutnya adalah menentukan medium yang akan digunakan dengan
menambahkan ZPT vitamin dan suplemen lainnya. Selanjutnya adalah
tahap kerja di laboratorium.

Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses

terakhir yaitu penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga
masih digunakan pada pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada
pross penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah benar-
benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya
dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat
lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow).

Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus

steril, dan eksplan juga dalam keadaan yang steril pula. Penanaman dapat
dilakukan pada ruangan tertutup atau ruangan penabur dalam Laminair
Air Flow (LAF). Ruangan digunakan, setelah dilakukan sterilisasi dengan
menggunakan larutan alkohol 96 % pada lantai dan dinding ruangan, dan
membiarkan ruangan selama 30 menit dengan sinar UV yang menyala.
 Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok
yang cukup mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga
dapat dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara
praktikum diatas dilakukan sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media
kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga harus dalam keadaan
steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun terkena
serangan mikroba.

Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba

lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk
itu sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk
menciptakan lingkungan yang aseptic dan menghilangkan mikroba
maupun spora penyebab kontaminan.

B. RUMUSAN MASALAH
1. Bagaimana cara membuat media sederhana?
2. Bagaimana cara menanam eksplan dan sub kultur?
3. Bagaimana pertumbuhan eksplan dalam kultur jaringan?

C. TUJUAN
1. Mengetahui cara pembuatan media sederhana.
2. Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan sub kultur.
3. Mengamati pertumbuhan eksplan.
 BAB II
KAJIAN PUSTAKA

Kultur jaringan merupakan salah satu teknik memperbanyak suatu

tanaman dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah
dalam keadaan steril. Dalam melakukan proses kultur jaringan ada beberapa
langkah yang harus dilakukan diantaranya adalah menentukan tujuan yang ingin
dicapai hal ini penting karena menyangkut materi yang akan digunakan. Setelah
mengetahui tujuan yang ingin dicapai langkah yang dilakukan berikutnya adalah
menentukan medium yang akan digunakan (Nasir, 2001).

Menurut Sriyanti (1994), kultur jaringan adalah suatu metode untuk

mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel,
jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga
bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi
tanaman lengkap kembali. Tujuan dari Kultur jaringan diantaranya menciptakan
tanaman baru bebas penyakit, memperbanyak tanaman yang sukar diperbanyak
secara seksual, dan menghasilkan tanaman baru sepanjang tahun (Hendaryono,
1994).

Proses kultur jaringan tidak bisa dilakukan di tempat yang sembarangan,

akan tetapi dilaksanakan pada laboratorium tertentu. Proses penyimpanan eksplan
dilakukan di dalam ruang penabur. Dimana ruang penabur merupakan kunci
keberhasilan budidaya in-vitro. Didalam ruangan ini semua dilakukan dengan
steril, dan pengawasan kesterilan di ruang penabur tersebut sangat ketat (Steenis,
1987).

Pertumbuhan dan perkembangan dalam kultur in vitro dipengaruhi oleh

beberapa faktor, diantaranya: faktor genetik, media tumbuh, faktor lingkungan,
dan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh (ZPT) di dalam dalam media
berfungsi untuk mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman pada setiap
tingkat pertumbuhan dan perkembangan (Wetherrel, 1982).

Di dalam tanaman terdapat fitohormon yang mendorong pertumbuhan dan

perkembangan, serta fitohormon yang menghambat. ZPT akan bekerja secara
aditif (sinergis) dengan fitohormon (pendorong) atau antagonis dengan
fitohormon yang menghambat. Resultan dari interaksi ini akan tampil dalam
pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Tanaman pada kultur jaringan tidak
dapat menghasilkan karbohidrat sendiri dalam jumlah cukup sehingga perlu
diberikan sumber energi karbon dalam media berupa sukrosa (Gardner, 1991).

LAF cabinet merupakan suatu kotak tempat sterilisasi dan penanaman

eksplan (bahan tanam). Di dalam laminar, terdapat blower dan lampu ultra violet.
Blower menghembuskan udara halus melalui suatu kotak filter yang fungsi untuk
mencegah kontaminan yang berasal dari udara. Sementara itu, lampu ultra violet
berfungsi untuk mematikan kontaminan yang berada di permukaan dalam laminar,
permukaan dalam laminar dilap dengan kapas atau tissu yang sebelumnya
dicelupkan dalam alkohol 70% dan lampu ultra violetnya dinyalakan selama 0,5 -
1jam (Hendaryono, 1994).

Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme

seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Namun, sumber utama kontaminan
adalah spora jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari atmosfer.
Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya
bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kontaminasi permukaan dapat diatasi
dengan cara pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia.
Keterbatasan utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk
mengeliminasi kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman. Ini biasanya dicapai
dengan menambahkan detergen, agitasi (digoyang –goyang), atau membenamkan
eksplan dengan sedikit tekanan untuk mengilangkan gelembung udara yang
mungkin mengandung mikroorganisme (Hendaryono, 1994).
 BAB III
METODE PENELITIAN

A. WAKTU DAN TEMPAT

Pembuatan media sederhan dilakukan pada Kamis, 7 Februari 2019
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, UNESA.
Sedangkan inokulasi eksplan dilakukan pada Senin, 11 Februari
2019 bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laminar Air Flow
Cabinet, Jurusan Biologi, UNESA.

B. ALAT DAN BAHAN

1. Pembuatan Media Sederhana
Alat :
- Kompor gas
- Panci stainless dan pengaduk
- pH meter
- Beaker glass 1000 ml
- Gelas ukur
- Timbangan digital
- Botol media/kultur
- Autoklaf

Bahan :

- Aluminium foil
- Elpiji
- Agar-agar batang 12-14 gram
- Air kelapa 150 ml
- Gula 20-30 gram
- Aquades
- Pupuk cair sesuai dosis
- Kertas label
- HCl 1 M
- KOH 1 M

2. Inokulasi eksplan
Alat :
- Laminar Air Flow (LAF), entkas
- Lampu spiritus
- Cawan petri 2
- Gunting
- Pinset
- Gagang scalpel
 - Mata pisau scalpel steril no 11 dan 13
- Korek api
- Botol saos
- Botol selai untuk sterilisasi 8 buah
- Sprayer

Bahan :

- Spiritus
- Alkohol 90 dan 70%
- Dettol, tween 80
- Formalin tablet
- Kertas tissue
- Kertas saring
- Kertas label
- Benang kasur
- Aluminium foil
- Kapas
- Aquades
- Kertas bekas
- Eksplan (daun belimbing)

C. LANGKAH KERJA
 Pembuatan media sederhana :
1. Memasukkan aquades ke dalam gelas piala (beaker glass) 1000 ml
sebanyak 500 ml kemudian menambahkan gula sukrosa 20-30
gram sambil diaduk sampai semua larut.
2. Menambahkan air kelapa 150 ml dan menambahkan pupuk cair
sesuai dosis.
3. Menambahkan aquades hingga volumenya mencapi 1000 ml.
4. Mengukur pH berkisar 6,5 dengan pH meter. Jika terlalu basa,
ditambahkan HCl 1 M. Jika terlalu asam, ditambahkan KOH 1 M.
5. Menambahkan aquades dalam larutan hingga volumenya
mencapai 1000 ml.
6. Menuangkan larutan ke dalam panci. Kemudian menambahkan
agar batangan (12 g/l).
7. Media kemudian dipanaskan dengan kompor gas sambil diaduk
hingga agar-agar larut dan homogeny.
8. Setelah agar-agar larut, media dituang ke dalam gelas piala
(beaker glass) 1000 ml dan dimasukkan ke dalam botol kultur
yang telah disterilisasi, dengan volume tiap botol 15 ml dan diberi
label nama untuk membedakan masing-masing perlakuan.
 9. Botol yang telah berisi media ditutup denagn aluminium foil lalu
disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm2 dan
temperatur 121°C selama ± 15 menit.
10. Botol dikeluarkan dari autoklaf dan diinkubasi selama tiga hari,
jika tidak terjadi kontaminasi, media siap digunakan.

 Inokulasi eksplan :
1. Menyaipkan alat (pinset, mata pisau scalpel, gagang pisau scalpel,
cawan petri yang berisi kertas saring), bahan (alkohol 90% dan
70%, twees, aquades) dan botol kultur yang telah berisi media
sederhana yang semuanya telah disterilkan. Sterilisasi dan
inokulasi eksplan dilakukan di Laminar Air Flow Cabinet.
2. Mencuci tangan menggunakan sabun cair kemudian dikeringkan
dengan lap bersih.
3. Mencuci eksplan dengan sabun cair kemudian dibilas dengan iar
mengalir hingga sabun hilang.
4. Eksplan dibawa kedalam Laminar Air Flow Cabinet.
5. Eksplan direndam dengan aquades steril selama 5 menit sambil
digoyang-goyang.
6. Merendam eksplan dengan alkohol 70% untuk mensterilkan
eksplan selam 5 detik, sambil digoyang - goyang.
7. Eksplan dicuci dengan aquades steril selama 5 menit.
8. Eksplan direndam dalam larutan NaCl 0,5% + 1 tetes antiseptik
(chloroxyenol) selama 3 - 4 menit.
9. Membilas eksplan dengan aquades steril selama 5 menit. Langkah
ini diulang sebanyak tiga kali.
10. Menempatkan eksplan pada cawan petri yang sudah diberi alas
kertas saring steril.
11. Memotong bagian tepi eksplan (jaringan yang rusak atau kontak
dengan bahan kimia). Kemudian memotong eksplan dengan
ukuran ± 0,5 cm menggunakan pinset dan pisau scalpel.
12. Mengusap aluminium foil yang menjadi tutup botol kultur dengan
alkohol 90%.
13. Membuka tutup botol kultur, kemudian bibir botol dan aluminium
foil dilewatkan nyala api lampu spirtus.
14. Mengambil potongan eksplan dengan pinset dan memasukkannya
dalam botol kultur yang telah berisi media.
15. Bibir botol kultur dan aluminium foil dilewatkan nyala api lampu
spirtus, kemudian ditutup kembali.
16. Botol yang telah ditanami diletakkan dalam ruang inkubasi dan
lakukan pengamatan.
 BAB IV

PEMBAHASAN

A. HASIL DAN ANALISIS

Tabel 1. Hasil pengamatan pertumbuhan eksplan selama 5 hari
Pengamatan
No. Botol ke- Selasa, Rabu, Kamis, Jumat- Sabtu,
12-02-2019 13-02-2019 14-02-2019 15-02-2019 16-02-2019
1. Pertama - - - X X
2. Air kelapa - - - X X
3. Pupuk cair - - - X X
Keterangan :
- = belum tumbuh

V = tumbuh kalus

X = Kontaminasi

ANALISIS

Pada botol pertama, hari pertama pengamatan pada selasa, 12

Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari kedua pengamatan pada
rabu 13 Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari ketiga pengamatan
pada kamis 14 Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari keempat
pengamatan pada jumat 15 Februari 2019 eksplan mengalami
kontaminasi oleh jamur, hari kelima pengamatan pada sabtu 16
Februari 2019 eksplan mengalami kontaminasi oleh jamur.

Pada botol kedua, hari pertama pengamatan pada selasa, 12

Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari kedua pengamatan pada
rabu 13 Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari ketiga pengamatan
pada kamis 14 Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari keempat
pengamatan pada jumat 15 Februari 2019 eksplan mengalami
kontaminasi oleh jamur, hari kelima pengamatan pada sabtu 16
Februari 2019 eksplan mengalami kontaminasi oleh jamur.

Pada botol ketiga, hari pertama pengamatan pada selasa, 12

Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari kedua pengamatan pada
rabu 13 Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari ketiga pengamatan
pada kamis 14 Februari 2019 eksplan belum tumbuh, hari keempat
pengamatan pada jumat 15 Februari 2019 eksplan mengalami
kontaminasi oleh jamur, hari kelima pengamatan pada sabtu 16
Februari 2019 eksplan mengalami kontaminasi oleh jamur.
B. PEMBAHASAN
Kultur jaringan merupakan salah satu teknik memperbanyak suatu
tanaman dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang
sudah dalam keadaan steril. Dalam melakukan proses kultur jaringan ada
beberapa langkah yang harus dilakukan diantaranya adalah menentukan
tujuan yang ingin dicapai hal ini penting karena menyangkut materi yang
akan digunakan. Setelah mengetahui tujuan yang ingin dicapai langkah
yang dilakukan berikutnya adalah menentukan medium yang akan
digunakan (Nasir, 2001).
Proses kultur jaringan tidak bisa dilakukan di tempat yang
sembarangan, akan tetapi dilaksanakan pada laboratorium tertentu. Proses
penyimpanan eksplan dilakukan di dalam ruang penabur. Dimana ruang
penabur merupakan kunci keberhasilan budidaya in-vitro. Didalam
ruangan ini semua dilakukan dengan steril, dan pengawasan kesterilan di
ruang penabur tersebut sangat ketat (Steenis, 1987).
LAF cabinet merupakan suatu kotak tempat sterilisasi dan
penanaman eksplan (bahan tanam). Di dalam laminar, terdapat blower dan
lampu ultra violet. Blower menghembuskan udara halus melalui suatu
kotak filter yang fungsi untuk mencegah kontaminan yang berasal dari
udara. Sementara itu, lampu ultra violet berfungsi untuk mematikan
kontaminan yang berada di permukaan dalam laminar, permukaan dalam
laminar dilap dengan kapas atau tissu yang sebelumnya dicelupkan dalam
alkohol 70% dan lampu ultra violetnya dinyalakan selama 0,5 - 1jam
(Hendaryono, 1994).
Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai
mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Namun,
sumber utama kontaminan adalah spora jamur dan bakteri yang
membentuk bagian alami dari atmosfer. Banyak yang bersifat non-
patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang
pada kondisi normal. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara
pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia. Keterbatasan
utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk
mengeliminasi kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman. Ini biasanya
dicapai dengan menambahkan detergen, agitasi (digoyang –goyang), atau
membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan untuk mengilangkan
gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme
(Hendaryono, 1994).
Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofilik
(organisme yang hidup di dalam sel atau ruang antar sel tanaman) yang
sering merupakan biote dari tanaman sumber eksplan, sulit diatasi dengan
sterilisasi permukaan. Keadaan ini disebabkan oleh koloni bakteri sering
tidak muncul pada saat eksplan baru dikulturkan pertama kali, tetapi
beberapa minggu kemudian muncul koloni bakteri. Bakteri tersebut tetap
ada setelah disubkulturkan berkali-kali, karena hidupnya memang secara
epifit di dalam jaringan tanaman.
Praktikum kultur jaringan kali ini, eksplan yang digunakan adalah
daun tanaman belimbing (Averrhoa carambola) dan ditanam pada media
yang telah dibuat sebelumnya yaitu Media Sederhana. Setelah dilakukan
penanaman, eksplan tersebut diamati selama 5 hari, untuk mengetahui
apakah eksplan yang ditanam telah tumbuh kalus atau terjadi kontaminasi
pada eksplan.
Adapun kontaminasi yang sering terjadi pada kultur jaringan
tanaman terdiri atas dua jenis yaitu kontamiasi oleh bakteri dan
kontaminasi oleh jamur. Untuk membedakan kedua jenis kontaminasi ini,
dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang muncul pada eksplan maupun media
kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka tanaman akan basah atau
menyebabkan adanya lendir, hal ini dikarenakan bakteri langsung
menyerang terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan
bila terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering dan akan
muncul hifa jamur pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat
dicirikan dengan adanya garis – garis (seperti benang) yang berwarna
putih sampai abu – abu. Penyebab terjadinya kontaminasi bisa diakibatkan
karena kesalahan pada saat penanaman, saat sterilisasi media dan eksplan
atau bahkan pada saat pembuatan media.
Berdasarkan pengamatan dilakukan selama 5 hari (5 kali
pengamatan) ternyata ketiga eksplan terkontaminasi. Adapun pada
pengamatan pertama, kedua, dan ketiga (3 hari setelah penanaman) kondisi
eksplan dan media tumbuh kultur masih dalam keadaan baik. Sedangkan
pada pengamatan keempat, eksplan dan media kultur telah terkontaminasi
oleh jamur. Hal ini ditunjukkan dengan adanya kontaminan yang berwarna
putih dan membentuk seperti benang (hifa). Begitupun pada pengamatan
kelima, kontaminasi yang terjadi oleh jamur makin jelas dan terlihat begitu
nyata karena hampir seluruh bagian permukaan eksplan dan media kultur
ditumbuhi oleh jamur. Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya
kesalahan atupun kurang optimalnya dalam penanaman maupun
melakukan hal lain yang dapat mendukung keberhasilan kultur jaringan
tersebut, terutama dalam hal sterilisasi.
 BAB V

PENUTUP

A. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dan pelaksanaan praktikum kultur
jaringan tanaman acara Penanaman Eksplan dapat diperoleh beberapa
simpulan sebagai berikut :
1. Penanaman eksplan dilakukan di LAF (Laminar Air Flow).
Penggunaan alat sebelumnya sudah dalam keadaan steril.
Penanaman dilakukan dengan cara mencelupkan scalpel dan pinset
ke dalam alkohol lalu dibakar pada nyala api Bunsen. Setelah itu
alat baru bisa digunakan untuk menanam. Pada setiap botol kultur,
diisi 2 potong eksplan.
2. Pada eksplan daun tanaman belimbing (Averrhoa carambola) di
ketiga botol media terjadi kontaminasi oleh jamur, hal ini
ditunjukkan dengan adanya kontaminan yang berwarna putih dan
membentuk seperti benang (hifa).
3. Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya kesalahan atupun
kurang optimalnya dalam penanaman maupun melakukan hal lain
yang dapat mendukung keberhasilan kultur jaringan tersebut,
terutama dalam hal sterilisasi.

B. SARAN
Dalam pemilihan eksplan terutama eksplan yang berasal dari daun,
sebaiknya memilih daun yang bertekstur lebih keras / kaku. Begitu juga
dalam hal pemotongan eksplan, sebaiknya dibentuk lebih lancip untuk
bagian yang akan ditanam guna memudahkan dalam proses penanaman
eksplan.
DAFTAR PUSTAKA

Wetherell, D. F. 1976. Pengantar Propagasi Tanaman secara In Vitro.

Terjemahan: D. Gunawan. IKIP Semarang Press.

Nasir, M. 2001. Pengantar Pemuliaan Tanaman. Direktorat Jenderal

Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Jakarta.

Hendaryono, D. P. S dan Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan dan

Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif Modern. Yogyakarta:
Kanisius.

Van Steenis, C.G.G.J. 1987. Flora. Diterjemahkan oleh Moeso S. 1996.

Pradnya Paramita, Jakarta.

Gardner, 1991. Fisiologi Tanaman Budidaya. UI Press: Jakarta.

Wetherell, DF. 1982. Introduction to In Vitro Propagation Wayne. A very

Publishing Group. New Jersey.

Hendaryono, D. P. S dan Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan dan

Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif Modern. Yogyakarta:
Kanisius.

Sriyanti, D. P. dan A Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta:

Kanisius.
LAMPIRAN

Botol pertama Botol kedua terjadi

terjadi kontaminasi kontaminasi oleh
oleh jamur jamur

Botol ketiga terjadi

kontaminasi oleh
jamur