Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt.

DASAR KROMATOGRAFI
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt.
2017 D3 Farmasi FMIPA, UNS
 Kromatografi
2

 Kroma = warna; Graf (grafi) = tulisan, gambar

 Teknik kromatografi adalah suatu metoda yang
digunakan untuk memisahkan campuran komponen
menjadi unit-unit yang terpisah satu dengan yang lain
yang didasarkan pada perbedaan sifat masing-
masing.
 Perbedaan yang dimaksud dapat berupa perbedaan
kelarutannya, perbedaan kemampuannya menyerap
atau terikat pada komponen lain, perbedaan muatan
ionik, ukuran molekul, dan lain sebagainya.
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
 Kromatografi
3

 Seorang ilmuwan botani dari Rusia, Michael Tswett,

pada tahun 1906 dengan suatu percobaan dapat
mernisahkan zat warna hijau yang terdapat pada
daun menjadi beberapa komponen.
 Karoten (kuning oranye/pucat), feofitin (hitam
keabu-abuan, kadang-kadang tidak tampak),
klorofil-b (hijau tua), klorofil-a (biru kehijauan), dan
xantofil (kuning) dapat dipisahkan melalui tabung
yang diisi dengan bubuk kalsium karbonat dan
dielusi dengan petroleum eter.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Definisi Kromatografi
4

 Prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses

migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang
terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu
diantaranya bergerak secara berkesinambungan
dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu
menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan
adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi,
kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau
kerapatan muatan ion, dengan demikian masing-
masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan
dengan metode analitik.
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
FI IV, 1995, halaman 1002
 Definisi Kromatografi
5

 Teknik pemisahan fisik yang terjadi pada fase

gerak dimana sampel dipisahkan ke dalam
komponen konstituen dengan distribusi diantara dua
fase gerak yang mengalir dalam fase
diam/sorben, sebuah detektor memonitor kadar
masing-masing komponen yang terpisah dan
menghasilkan kromatogram.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

Ahuja S & Dong MW (2005)
 Prinsip Dasar Kromatografi
6

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Prinsip Dasar Kromatografi
7

 Zat terlarut, yang didistribusi diantara dua fase, yaitu

fase diam dan fase gerak.
 Fase gerak membawa serta zat terlarut melalui media
hingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi
lebih awal atau lebih akhir.
 Zat terlarut dibawa melewati pemisah oleh aliran
pelarut dalam bentuk cair atau gas, disebut ELUEN
atau fase gerak
 Fase diam bertindak sebagai penjerap (adsorben)
atau pelarut zat terlarut sehingga terjadi partisi antara
kedua fase.
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
 Proses Pemisahan
8

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Proses Pemisahan
9

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Proses Pemisahan
10

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Penggolongan Kromatografi
11

 Atas dasar mekanisme pemisahan:

 kromatografi serapan (adsorption chromatography)
 kromatografi partisi (partition chromatography)
 kromatografi eksklusi (exclusion chromatography)
 kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography)
 kromatografi afinitas (affinity chromatography)
 Atas dasar fase gerak:
 Kromatografi gas
 Kromatografi cair

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Penggolongan Kromatografi
12

 Atas dasar bentuk fase diam:

 Kromatografi Planar
 Kromatografi lapis tipis
 Kromatografi kertas
 Kromatotron

 Kromatografi Kolom
 Kolomterbuka
 Kromatografi gas
 Kromatografi cair kinerja tinggi

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Penggolongan Kromatografi
13

 Atas dasar cara mengalirkan fase gerak:

 vacuum column chromatography
 flash column chromatography
 gravity column chromatography
 high pressure liquid chromatography

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Klasifikasi Sistem Kromatografi
14

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Singkatan
15

 SFC =SUPERCRITICAL FLUID CHROMT = KROMT CAIR SUPERKRITIK

 GSC = GAS SOLID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI GAS

PADAT= KGP

 GLC = GAS LIQUID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI GAS CAIR

=KGC

 LSC =LIQUID SOLID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI CAIR

PADAT =KCP

 LLC =LIQUID LIQUID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI CAIR

CAIR =KCC

 BPC =BONDED PHASE CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI FASE

TERIKAT

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Singkatan
16

 IEC =ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI

PENUKAR ION

 EC =EXCLUSION CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI EKSKLUSI

 TLC =THIN LAYER CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

 PC =PAPER CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI KERTAS

 GPC =GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI

PERMIASI GEL

 GFC =GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI

FILTRASI GEL

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 KROMT METODE PEMISAHAN F. F. DIAM TYPE KESETM
GERAK
17

GSC/KGP GAS – PADAT GAS PADAT ABSORPSI

GLC/KGC GAS – CAIR GAS CAIR PARTISI
GBPC GAS – BONDED PHASE GAS F.ORG ADSORPSI / PARTISI
TERIKAT

LLC CAIR – CAIR CAIR CAIR PARTISI

LSC CAIR – PADAT CAIR PADAT ADSORPSI
LBC CAIR – BONDED PHASE CAIR F. ORG ADSORPSI/PARTISI
TERIKAT

IEC PERTUKARAN ION CAIR RESIN PERTUKARAN ION

GPC PERMIASI GEL CAIR Z. PDT PENYARINGAN
POLIMER
CAIR
PC CAIR- CAIR CAIR PARTISI
PADAT
TLC CAIR-PADAT CAIR ADSORPSI

SFC GAS/ CAIR CAIR GAS/CAIR CAIR PARTISI

(COS.Farm.,
Adi Yugatama, 2 SC) M.Sc., Apt. 2017
 Elusi Kromatografi
18

 Pada dasarnya hampir semua proses kromatografi

melibatkan proses elusi sehingga akan terjadi
pemisahan zat berdasarkan perbedaan
partisi/distribusi antara fase diam dan fase gerak.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Kecepatan Migrasi Solut
19

 Jika dalam sampel terdapat zat A dan B yang akan

dipisahkan, maka saat keduanya bergerak ke bawah
sepanjang kolom, kecepatannya tergantung pada Ratio
Distribusi (DC ATAU m )
jumlah zat terlarut dalam fase diam
Dm 
jumlah zat terlarut dalam fase gerak
konsentrasi zat terlarut dalam fase diam
Dc 
konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak
 Dalam kromatografi ratio distribusi lebih sering disebut
dengan ratio kapasitas atau faktor kapasitas (k )
jumlah zat terlarut dalam fase diam
k
jumlah zat terlarut
Adi Yugatama, dalam
S.Farm., fase2017
M.Sc., Apt. gerak
 Pengaruh Kecepatan Migrasi
20

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

21

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Waktu Retensi (tR)
22

 Lamanya solut tinggal di dalam sistem kromatografi =

waktu yang diperlukan untuk mengeluarkan solut dari
dalam ke luar kolom = waktu yang diperlukan untuk
membentuk puncak kromatogram sejak sampel
diaplikasikan.
 Waktu migrasi/waktu mati (tM) = waktu retensi spesies
yang tidak ditahan oleh kolom atau waktu yang
diperlukan fase gerak untuk keluar kolom.
 Volume retensi (VR) = volume fase gerakyang
diperlukan untuk mengelusi sampel keluar dari kolom.
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
 Waktu Retensi (tR)
23

Puncak kecil sebelah kiri menggambarkan

komponen yang tidak tertahan oleh fase diam pada
kolom dan mencapai detektor hampir langsung
setelah elusi dimulai.
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
 Faktor Kapasitas (k)
24

 Faktor kapasitas menggambarkan laju migrasi

komponen dalam kolom.
 Faktor kapasitas adalah perbandingan mol solut
dalam fase diam terhadap mol solut dalam fase
gerak.

t t
k '
R M

t M

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Faktor Kapasitas (k)
25

 Jika harga k kecil, maka komponen / analit akan bergerak

dalam kolom lebih cepat .
 Bila komponen A dan B mempunyai harga k yang berbeda
cukup besar, maka akan terjadi pemisahan.
 Jika faktor kapasitas < 1, elusi terjadi lebih cepat sehingga
penentuan waktu retensi yang akurat sangat sulit.
 Jika faktor kapasitas lebih besar dari 20 (antara 20 - 30),
elusi menjadi terlampau panjang.
 Idealnya faktor kapasitas mempunyai harga antara 1 - 5.
 Faktor kapasitas dalam GC dapat divariasikan dengan
mengubah temperatur dan packing kolom.
 Dalam LC, faktor kapasitas dapat dimanipulasi dengan cara
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
memvariasikan komposisi fase diam dan fase gerak.
 Faktor Selektivitas (α)
26

 Faktor selektivitas adalah relatif komponen

diantara fase diam dan fase gerak.


KA

k ' 
t  t A RA M

KB k' t t B RB M
 Jika nilai α =1, maka tidak ada pemisahan karena
waktu retensinya sama.
 Pemilihan fase diam dan fase gerak dapat
mempengaruhi nilai α.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Profil Puncak dan Pelebaran Puncak
27

 Dalam kromatografi (GLC), bentuk kromatogram yang

bagus adalah berupa garis tegak.

 Garis yang tipis merupakan pemisahan yang sempurna,

tapi keadaan ideal ini sulit tercapai
 Bentuk kromatogram yg sering muncul adalah kurva
melebar (kurva gauss) atau puncak yang mengekor atau
pemanjangan dimuka.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Penyebab terjadinya pelebaran puncak
28

Difusi Eddy

Distribusi Aliran

Difusi molekul sampel dalam fase gerak

Perpindahan massa antara fase gerak, fase gerak

yang stagnan, dan fase diam
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
 Difusi Eddy
29

 Disebabkan oleh kecepatan fase gerak yang

tidak sama di dalam kolom karena bagian dari
pori yang dilalui tidak sama panjang: Multipath
effect (pengaruh jalan berganda)  beberapa
molekul sampel meninggalkan kolom lebih dahulu
dibanding yang lainnya.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Distribusi Aliran
30

 Fase gerak mengalir di antara partikel fase diam

dalam suatu gerakan laminer. Kecepatan fase gerak
lebih cepat jika melalui pusat saluran daripada fase
gerak melalui daerah di dekat partikel fase diam.
 Difusi Eddy dan Distribusi Alir dapat dikurangi dengan
mengemas kolom menggunakan partikel fase diam
berukuran rata (distribusi ukuran partikel sesempit
mungkin  kurang dari 2).

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Difusi Molekul
31

 Molekul sampel menyebar di dalam pelarut tanpa

adanya pengaruh luar apapun  difusi
longitudinal.
 Kecepatan alir fase gerak dipilih sedemikian rupa
sehingga difusi longitudinal tidak mempunyai efek
yang merugikan.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Perpindahan Massa
32

 Struktur partikel fase diam, salurannya ada yang sempit

dan ada yang lebar. Pori-pori akan terisi oleh fase gerak
yang tidak bergerak. Suatu molekul sampel yang masuk ke
dalam pori akan berhenti untuk dipindahkan dengan fase
gerak dan akan pidah hanya dengan difusi.
 Ada 2 kemungkinan yang terjadi:
 Molekul sampel berdifusi balik ke aliran fase gerak.
 Molekul berinteraksi dengan fase diam dan akan teradsorpsi.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Persamaan Van Deemter
33

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Evaluasi Kinerja Kolom
34

Efisiensi kolom

Resolusi (daya pisah)

Faktor asimetri
Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017
 Efisiensi Kolom
35

 Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng

teoritis (N).

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Efisiensi Kolom
36

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Efisiensi Kolom
37

 Height equivalent of a theoritical plate (HETP)

= ketinggian ekivalen terhadap pelat teoritis.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Efisiensi Kolom
38

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Resolusi (Daya Pisah)
39

 Puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah

sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit
overlapping/ tidak ada tumpang tindih.
 Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena
akan memberikan pemisahan puncak yang baik.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Resolusi
40

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

 Faktor Asimetri
41

 Menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik

apabila ditemukan suatu puncak yang mengalami
pengekoran (tailing) sehingga menyebabkan puncak
tidak simetri.
 Semakin besar harga Tailing Factor (TF) maka kolom
yang dipakai semakin kurang efisien.

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017

42 TERIMA KASIH

Adi Yugatama, S.Farm., M.Sc., Apt. 2017