III.

METODE PENELITIAN

A. Materi dan Bahan

1. Hewan Coba

Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus)

jantan galur Wistar dengan berat badan 125-250 gram. Hewan coba

didapatkan dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu unit IV

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Tikus putih (Rattus norvegicus) jantan

galur Wistar dipelihara dalam lingkungan dengan suhu dan kelembapan yang

sama serta mendapat pencahayaan (22 + 2 °C, kelembaban 50% serta siklus

gelap-terang selama 12 jam) (Moreno et al., 2011).

Penentuan besar sampel berdasarkan ketentuan rumus Federer adalah

jumlah hewan coba yang dibutuhkan untuk setiap kelompok disesuaikan

dengan banyaknya perlakuan yang diberikan, dan dihitung seperti di bawah

ini :

(t - 1) (r - 1) ≥ 15

Keterangan :

t :jumlah kelompok

r :jumlah tikus per kelompok

Maka, tikus yang digunakan tiap kelompok adalah:

(t-1) (r-1) ≥ 15

(5-1) (r-1) ≥ 15

4(r-1) ≥ 15

31
 32

4r - 4 ≥15

4r ≥ 19

r ≥ 19/4

r ≥ 4,75

r =5

Antisipasi drop out hewan coba:

r’ = r + 20% .r

= 5 + 20%.5

=5+1

=6

r’ =6

Tikus putih jantan yang didapatkan menurut rumus Federer per

kelompok adalah 5 ekor. Namun untuk mengantisipasi jika terdapat tikus

yang mati di tengah percobaan dengan estimasi drop out 20%, maka peneliti

menyediakan 25 ekor tikus dengan 1 ekor tikus sebagai cadangan pada setiap

kelompoknya sehingga tikus yang dibutuhkan berjumlah 30 ekor.

Kriteria Inklusi :

a. Berat badan tikus 125-250 gram

b. Usia 2-3 bulan

c. Sehat, aktif dan tidak memiliki kelainan anatomi (cacat)

d. Berjenis kelamin jantan

Kriteria Eksklusi :

a. Drop out apabila tikus mati selama percobaan

 33

b. Sakit selama aklimatisasi

2. Alat dan Bahan

a. Alat

1) Timbangan elektrik skala Kenko®

2) Timbangan tikus skala gram Foxanone®

3) Kandang tikus berukuran 60 x 30 x 30 cm

4) Microplate reader 340 nm SpectraMax®

5) Beaker glass Pyrex® kapasitas 20 – 50 ml

6) Tabung eppendorf Eppendorf® Research®

7) Alat sonde oral OneMed®

8) Sarung tangan Sensi®

9) Alat terminasi

10) Spidol Snowman Permanent Marker

11) Spektrofotometer

12) Perangkat pemeriksaan serum oleh laboratorium yang terdiri dari:

mikropipet, yellow tip, blue tip, kuvet plastik.

13) Tabung reaksi 5 ml

14) Rak tabung reaksi

15) Sentrifugator

b. Bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari :

1) Buah markisa ungu (Passifora edulis var edulis sims) segar yang

didapatkan dari Kabupaten Wonosobo, Jawa Tengah dengan

 34

kelembapan daerah 80-90%, suhu 20-30℃ dan wilayah tidak

berangin.

2) Hewan coba, yaitu tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar

yang didapatkan dari LPPT IV Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

3) Pelet AD II digunakan sebagai pakan tikus

4) Obat induksi diabetes melitus yaitu Aloksan

5) Aquadest sebagai air minum tikus putih

6) Reagen kit Creatinine FS (Diasys)

B. Metode Penelitian

Metode penelitian ini merupakan metode penelitian experimental dengan

desain pre test post test with control group dalam meneliti kadar glukosa dan

post test only with control group dalam meneliti kadar kreatinin. Penelitian ini

merupakan studi eksperimental karena peneliti melakukan intervensi terhadap

subjek penelitian, dilakukan randomisasi subjek yang mendapat perlakuan dan

terdapat grup kontrol. Metode post test only with control group digunakan karena

pengukuran hasil kreatinin serum dilakukan sesudah pemberian perlakuan

berakhir.

C. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau

Completed Randomized Design (CRD) dengan pendekatan post test with control

group design. Dalam penelitian ini, hewan coba dibagi menjadi lima kelompok

perlakuan, yaitu sebagai berikut:

 35

1. Kelompok kontrol normal, yaitu kelompok kontrol positif yang diberi pakan

AD II dan aquadest secara per sonde lambung selama 21 hari.

2. Kelompok kontrol sakit, yaitu kelompok kontrol negatif yang merupakan

kelompok tikus DM. Tikus yang telah diinduksi aloksan dosis 120 mg/kg BB

intraperitoneal, mendapat pakan AD II dan aquadest secara per sonde

lambung selama 21 hari.

3. Kelompok perlakuan I (C), yaitu kelompok yang telah dinduksi aloksan dosis

120 mg/kg BB, mendapat pakan AD II dan sari buah markisa ungu dosis 1,05

ml/200 grBB per hari per sonde lambung selama 21 hari.

4. Kelompok perlakuan II (D), yaitu kelompok yang telah dinduksi aloksan

dosis 120 mg/kg BB, mendapat pakan AD II dan sari buah markisa ungu dosis

2,1 ml/200 grBB per hari per sonde lambung selama 21 hari.

5. Kelompok perlakuan III (E), yaitu kelompok yang telah dinduksi aloksan

dosis 120 mg/kg BB, mendapat pakan AD II dan sari buah markisa ungu dosis

4,2 ml/200 grBB per hari per sonde lambung selama 21 hari.

Sebelum melakukan penelitian, hewan coba akan diaklimatisasi selama 7

hari dipelihara dalam suhu dan kelembaban yang sama serta memperoleh

pencahayaan (siklus gelap terang selama 12 jam) yang cukup (Moreno et al.,

2011). Setiap kelompok hewan coba ditempatkan dalam kandang dengan bentuk,

ukuran, dan bahan yang sama, serta mendapatkan makanan dan minuman

dengan jenis, jumlah dan komposisi yang sama secara ad libitum (Willems,

2009).
 36

Hewan coba kemudian diaklimatisasi selama 7 hari. Pada kelompok 2, 3,

4, dan 5 kemudian dilakukan induksi aloksan secara intraperitoneal dengan dosis

120 mg/kgBB pada hari ke 8. Setelah itu akan diukur glukosa darah hewan

tersebut pada hari ke 11 untuk memastikan bahwa induksi telah berhasil dan

dapat dilanjutkan perlakuan selama 21 hari. Pengukuran kadar glukosa dilakukan

saat ≥ 72 jam setelah induksi karena menurut Lenzen (2008), puncak kadar

glukosa dimulai saat 72 jam setelah induksi. Pada akhir masa perlakuan hewan

coba diambil serum darah untuk dilakukan pemeriksaan kadar kreatinin serum

lalu diterminasi dengan metode dislokasi servikal. Setelah diterminasi, hewan

coba dikubur di dalam tanah sesuai ketentuan komisi etik.

D. Variabel Penelitian

Variabel yang digunakan adalah :

1. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian per oral sari buah

markisa ungu dengan berbagai dosis.

2. Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar kreatinin serum.

 37

E. Definisi Operasional Variabel

Variabel penelitian terdiri atas variabel bebas dan variabel terikat yang

didefinisikan dijelaskan pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Definisi operasional variabel

Variabel Definisi operasional Nilai data Skala data

Bebas Pemberi Sari buah markisa ungu 1. Tidak Kategorik
an Sari yang didapatkan dari diberikan Ordinal
Buah hasil budidaya di 2. Diberikan
Markisa kabupaten Wonosobo, dengan
Ungu Jawa Tengah. Sari buah dosis 1,05
markisa ungu didapatkan ml/200gB
B/hari
dari buah segar utuh
3. Diberikan
yang dipotong-potong
dengan
kemudian diperas dosis 2,1
dengan kain saring. mL/200gB
Pemberian sari buah B/hari.
markisa ungu secara oral 4. Diberikan
pada kelompok dengan
perlakuan dengan dosis 4,2
menggunakan sonde mL/200gB
lambung. B/hari.

Terikat Kadar Kadar kreatinin serum mg/dL Numerik

Kreatini hewan coba yang Rasio
n Serum diperiksa dari sampel
darah seluruh kelompok
tikus putih (Rattus
norvegicus) galur Wistar
menggunakan reagen
Creatinine FS dengan
metode enzimatik kinetik.
Pengukuran dengan
spektrofotometer dan
dibaca pada panjang
gelombang 546 nm.
 38

F. Cara Pengukuran Variabel

Variabel terikat berupa kadar kreatinin serum diukur dari sampel darah tikus

putih (Rattus norvegicus) pada 5 kelompok. Sampel darah diambil sebanyak 3 ml

melalui sinus retro-orbitalis, kemudian dimasukkan ke dalam tabung vacuum

tube non EDTA. Sampel darah kemudian disentrifugasi 4000 rpm selama 10

menit untuk mendapatkan serum darah. Penelitian ini menggunakan reagen kit

Creatinine FS dengan metode enzimatik kinetik untuk pengukuran kreatinin dan

diukur dengan menggunakan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang

546 nm. Hasil interpretasi dinyatakan dalam mg/dL.

G. Tata Urutan Kerja

1. Pengajuan telaah etik

Penelitian ini telah mendapatkan izin dari Komite Etik Penelitian

Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman berdasarkan surat

keterangan persetujuan etik nomor 2185/KEPK/2018.

2. Determinasi tumbuhan

Determinasi tumbuhan dilakukan di Laboratorim Taksonomi

Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman untuk

memastikan taksonomi sebelum pengambilan sari buah.

3. Persiapan hewan coba

a. Tahap Pengadaan

Hewan coba dipilih sesuai dengan kriteria inklusi yaitu tikus

putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar dengan berat badan antara

125-250 gram, usia 2-3 bulan dan sehat. Pengadaan hewan coba
 39

dilakukan oleh petugas laboratorium hewan LPPT IV Universitas

Gadjah Mada Yogyakarta.

b. Tahap aklimatisasi

Pada masa aklimatisasi, setiap hewan coba ditempatkan dalam

kandang dengan bentuk, ukuran, dan bahan yang sama, serta

mendapatkan makanan dan minuman dengan jenis, jumlah dan

komposisi yang sama secara ad libitum (Willems, 2009). Hewan coba

menempati kandang (Lampiran 2) yang terbuat dari stainless dengan

ukuran 20 x 15 x 20 cm secara individual selama 7 hari dan dipelihara

dalam suhu dan kelembaban yang sama serta memperoleh

pencahayaan (siklus gelap-terang selama 12 jam) yang cukup (Moreno

et al., 2011). Hewan coba diberi makanan berupa pelet AD II® dan

aquades yang diberikan secara ad libitum oleh peneliti. Aklimatisasi

bertujuan agar hewan coba dapat beradaptasi dengan lingkungan

laboratorium (Yantolis, 2014).

c. Tahap pengelompokan

Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok dipilih secara

randomisasi oleh peneliti dengan masing-masing kelompok terdiri dari

6 hewan coba. Pada setiap kandang diberi label dengan ketentuan

sebagai berikut :

1). Kelompok kontrol normal diberi label A

2). Kelompok kontrol sakit diberi label B

3). Kelompok perlakuan I diberi label C

 40

4). Kelompok perlakuan II diberi label D

5). Kelompok perlakuan III diberi label E

Setelah dikelompokkan, hewan coba diberi tanda garis

menggunakan spidol merah permanen pada masing-masing tikus

pada setiap kelompok dengan cara sebagai berikut, kemudian

dikandangkan secara individu :

1). Tikus 1 diberi tanda pada bagian kaki kanan depan

2). Tikus 2 diberi tanda pada bagian kaki kiri depan

3). Tikus 3 diberi tanda pada bagian kaki kanan belakang

4). Tikus 4 diberi tanda pada bagian kaki kiri belakang

5). Tikus 5 diberi tanda pada bagian kepala

6). Tikus 6 diberi tanda pada bagian ekor

2. Induksi diabetes pada hewan coba

Hewan coba pada kelompok B, C, D dan E diinduksi DM oleh laboran

farmakologi pada hari pertama setelah masa aklimatisasi selesai dengan

aloksan dosis 120 mg/kg BB yang dilarutkan di dalam aquabidestilasi

streril for injection secara intraperitoneal (Lachin dan Reza, 2012). Aloksan

segera diinjeksikan sebelum terjadi perubahan warna dari merah muda

menjadi bening. Selanjutnya dilakukan pengecekan kadar glukosa darah

puasanya oleh petugas laboratorium patologi klinik dengan metode GOD-

PAP dengan mengambil darah tikus dari sinus retroorbital menggunakan

tabung hematokrit pada hari ketiga pasca induksi. Hewan coba dianggap

DM apabila kadar glukosa darah puasanya ≥200 mg/dL. Tikus yang sudah
 41

mengalami DM akan mulai diberikan perlakuan pada hari selanjutnya.

Tikus yang belum mengalami DM akan diberikan induksi kedua, dan

dilakukan pengecekan pada hari kelima.

3. Pembuatan sari buah markisa ungu

a. Pengadaan

Markisa ungu didapatkan dari tempat budidaya markisa ungu di

kota Wonosobo dengan kelembapan daerah 80-90%, suhu 20-30℃ dan

wilayah tidak berangin. Tanaman markisa diberi pengairan secara teratur

terutama pada saat tanaman berbunga dan berbuah serta pemberian

ditingkatkan saat mendekati pematangan buah. Buah markisa dipanen

satu tahun sekali yaitu setelah berumur sekitar 9 bulan dengan

karakteristik buah matang berwarna keunguan.

b. Pembuatan sari

Sari buah adalah cairan yang dihasilkan dari pengepresan daging

buah. Pembuatan sari buah markisa dimulai dari memilih buah yang

matang dan tidak cacat, lalu dicuci dengan air, kemudian dikeringkan

diudara bebas. Buah kemudian dibelah dan dikerok isinya dengan

sendok. Isi buah kemudian diperas dan disaring dengan kain saring yang

kasar (berlubang-lubang besar) untuk memisahkan antara biji dan daging

buahnya (Muhsin dan Iskandar, 2017). Sari buah markisa ungu dibuat

setiap hari oleh peneliti sesuai dengan perhitungan yang dibutuhkan oleh

kelompok hewan coba yang diberi perlakuan disesuaikan dengan berat

badan masing-masing hewan (Lampiran 3).

 42

4. Perlakuan hewan coba

Pemberian perlakuan terhadap hewan coba dilakukan oleh peneliti

dengan bantuan laboran farmakologi dengan ketentuan sebagai berikut:

a. Kelompok kontrol normal, yaitu kelompok kontrol positif yang diberi

pakan AD II dan aquadest secara per sonde lambung selama 21 hari.

b. Kelompok kontrol sakit, yaitu kelompok kontrol negatif yang merupakan

kelompok tikus DM. Tikus yang telah diinduksi aloksan dosis 120 mg/kg

BB intraperitoneal, mendapat pakan AD II dan aquadest secara per sonde

lambung selama 21 hari.

c. Kelompok perlakuan I, yaitu kelompok yang telah dinduksi aloksan dosis

120 mg/kg BB, mendapat pakan AD II dan sari buah markisa ungu dosis

1,05 ml/200 grBB per hari per sonde lambung selama 21 hari.

d. Kelompok perlakuan II, yaitu kelompok yang telah dinduksi aloksan dosis

120 mg/kg BB, mendapat pakan AD II dan sari buah markisa ungu dosis

2,1 ml/200 grBB per hari per sonde lambung selama 21 hari.

e. Kelompok perlakuan III, yaitu kelompok yang telah dinduksi aloksan

dosis 120 mg/kg BB, mendapat pakan AD II dan sari buah markisa ungu

dosis 4,2 ml/200 grBB per hari per sonde lambung selama 21 hari.

5. Pengambilan sampel darah

Pengambilan sampel darah dilakukan oleh laboran patologi klinik

setelah perlakuan (post test) untuk mengetahui efek perlakuan. Tikus

dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam sebelum pengambilan sampel.

Pemeriksaan post test dilakukan terhadap parameter kreatinin serum. Sampel

 43

darah diambil melalui sinus retro orbital. Sampel darah diambil sebanyak 3cc

dan dimasukkan dalam vacutainer / tabung non EDTA.

6. Pengukuran kadar kreatinin serum

Pengukuran kadar kreatinin serum dilakukan oleh peneliti dengan

bantuan laboran patologi klinik dengan persiapan reagen kreatinin serum

serta spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm, celah optik 1 cm,

dengan suhu ruang 20-25°C. Serum diambil sebanyak 60 μl dan dicampur

dengan 1 cc working reagen. Setelah itu, lakukan pembacaan absorbansi pada

spektrofotometer.

7. Pengolahan dan analisis data

Pengolahan dan analisis data hasil penelitian dilakukan dengan

menggunakan perangkat lunak komputer untuk pengolahan data, yaitu

Stastistical Package for Social Sciences (SPSS) 24.0.

H. Analisis Data

1. Analisis Univariat

Analisa univariat dilakukan dengan menyusun statistik deskriptif

terhadap variabel-variabel yang diukur. Hasil analisis dicantumkan dalam

bentuk rerata dan simpangan baku (Dahlan, 2013).

2. Analisis Bivariat

Penilaian normalitas data dengan uji Saphiro Wilk dengan sampel

berjumlah 25 ekor (<50 sampel data) dilakukan sebelum analisis bivariat.

Selanjutnya dilakukan uji varians data menggunakan Levene test. Analisis

dilanjutkan dengan uji parametrik One Way ANOVA. Pengujian data

 44

dilanjutkan dengan uji post hoc LSD karena data yang didapat dinyatakan

bermakna (p<0,05) (Dahlan, 2013).

Pemberian sari buah markisa ungu berpengaruh positif apabila kadar

kreatinin serum tikus model DM yang mendapatkan sari buah markisa ungu lebih

rendah daripada kadar kreatinin serum tikus model DM yang tidak mendapatkan

sari buah markisa ungu (kontrol sakit), dan atau berbeda tidak bermakna dengan

kadar kreatinin serum tikus kontrol sehat.

I. Waktu dan Tempat Penelitian

a. Waktu penelitian

Penelitian dilaksanakan dari Juli 2018 – Oktober 2018

b. Tempat Penelitian

1. Pemeliharaan hewan coba ditempatkan di Laboratorium Farmakologi

dan Hewan Coba FK Unsoed
2. Analisis kadar kreatinin dilakukan di Laboratorium Patologi Klinik FK
Unsoed.