BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kromatografi
Menurut Farmakope edisi IV, kromatografi didefinisikan sebagai prosedur
pemisahan zat oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang
terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara
berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan
perbedaan mobilitas, disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan,
tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion.

Secara singkat, kromatografi adalah suatu cara pemisahan berdasarkan perbedaan

pengikatan zat-zat dalam campuran oleh suatu sistem dua fase, yaitu fase diam
(stasioner) dan fase bergerak (mobil), dimana pengikatannya bersifat reversibel.

Jenis-jenis kromatografi dapat digolongkan berdasarkan berbagai kriteria, yaitu :

1. Berdasarkan mekanisme pengikatan zat

a. Kromatografi Penyerapan (adsorption chromatography)
Pada kromatografi ini zat teradsorpsi pada permukaan partikel fase
stasioner/padat.

b. Kromatografi Partisi (partition Chromatography)

Pada kromatografi partisi zat terbagi/terlarut dalam cairan fase stasioner dan
fase mobil.

c. Kromatografi Pertukaran Ion (ion exchange chromatography)

Pada kromatografi ini, ion zat terikat pada fase stasioner/padat yang bersifat
penukar ion.

d. Kromatografi Eksklusi (exclusion chromatography, gel permeation

chromatography )

Pada kromatografi eksklusi, molekul zat terjaring/terserap didalam pori-pori

fase stasioner.
 e. Kromatografi Afinitas (affinity chromatography)

Pada kromatografi ini zat terikat secara biospesifik, misalnya enzim-substrat,

antigen-antibodi, hormon-reseptor

2. Berdasarkan Fasenya

a. Kromatografi cairan

- Kromatografi cairan-cairan

- Kromatografi cairan-padatan

b. Kromatografi gas

- Kromatografi gas-cairan

- Krromatograf gas-padatan

Cairan dapat berlaku sebagai fase stasioner dengan bantuan zat padat
sebagai penyangga/pendukung

3. Berdasarkan Kriteria lain

a. Penempatan fase stasionernya dalamm tabung (kromatografi kolom) atau

pada permukaan bidang (kromatografi planar)

b. Arah gerak fase mobilnya (kromatografi menaik, kromatografi menuru,

kromatografi mendatar)

Jenis Jenis Kromatografi

Secara praktis dapat dibedakan jenis-jenis kromatografi sebagai berikut.
1. Kromatografi kolom konvensional, kromatografi cairan dengan mekanisme
pemisahan yang beragam
2. Kromatografi kertas (paper chromatography), tergolong kromatografi cairan
planar dengan mekanisme pemisahan partisi yang dominan
3. Kromatografi lapis tipis (thin-layer chromatography), tergolong kromatografi
cairan planar dengan mekanisme pemisahan partisi yang beragam
4. Kromatografi gas (gas chromatography)
5. Kromatografi cairan kinerja tinggi (high performance liquid chromatography)
Kromatografi kertas dan Kromatografi lapis tipis umumnya lebih bermanfaat untuk
tujuan identifikasi karena mudah dan sederhana.

Nilai Rf
Dalam kromatografi kertas dan Kromatografi lapis tipis, nilai Rf dinyatakan
sebagai perbandingan jarak rambat (diukur sampai titik yang memberikan
intensitas maksimum pada bercak) suatu senyawa tertentu terhadap jarak rambat
fase gerak, diukur dari titik penotolan. Nilai Rf berubah sesuai dengan kondisi
percobaan, karena itu identifikasi sebaiknya dilakukan dengan menggunakan baku
pembanding yang sama dengan uji kromatogram yang sama.

Ada beberapa faktor yang menentukan nilai Rf yaitu:

a. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan - perubahan
yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan
perubahan perubahan harga Rf.
b. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
c. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer
jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen - komponen pelarut dari
kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti
perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan
berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.
d. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan
serapan, yang berbeda untuk macam -macam kertas. Kertas mempengaruhi
kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.
e. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume
yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi
karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf
mereka.

Penentuan Bercak
Bercak yang dihasilkan kromatografi kertas atau lapis tipis letaknya dapat ditetapkan
dengan cara sebagai berikut.
1. Pengamatan langsung jika senyawanya tampak pada cahaya biasa, cahaya
ultraviolet gelombang pendek (254 nm) atau gelombang panjang (366 nm)
 2. Pengamatan dengan cahaya biasa atau ultraviolet setelah disemprot dengan
pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak
3. Menggunakan pencacah Geiger-muller atau teknik autoradiografi jika terdapat zat
radioaktif
4. Menempatkan potongan penjerap dan zat pada media pembiakan yang telah
ditanam untuk melihat hasil stimulasi atau hambatan pertumbuhan bakteri.

2.2. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas tergolong kromatografi cairan dengan kertas sebagai zat
pendukung. Karena kertas/serat-serat selulosa merupakan adsorben lemah yang
hidrofil, adsorpsi zat oleh kertas tidak terlalu kuat dan akan terdesak oleh air. Air
atau bagian yang lebih polar dari cairan yang dipakai sebagai eluen, akan berlaku
sebagai fase stasioner, jadi kromatografi kertas dapat digolongkan sebagai jenis
kromatografi cairan-cairan dan mekanisme pemisahan yang dominan adalah partisi.
Oleh gaya kapiler dari kertas, fase mobil dapat bergerak naik, mendatar, maupun
menurun.

Pada kromatografi menaik, panjang kertas yang dipakai sekitar 20 cm. Pada
kromatografi menurun, panjang kertas dapat mencapai 50 cm atau lebih. Pada
kromatografi mendatar sirkulasi memerlukan kertas berdiameter 10-20 cm. Kertas
kromatografi berupa kertas saring khusus, dengan lebar tidak kurang dari 2,5 cm,
tidak lebih lebar dari panjang bak pelarut dan dipotong mebih kurang sama dengan
tinggi bejana.

Eluen (juga disebut pelarut, cairan pengelusi, cairan pengembang, cairan penghantar)
pada kromatografi kertas biasanya merupakan campuran dua komponen atau lebih.
Yang berlaku sebagai fase mobil selanjutnya adalah bagian campuran yang kurang
polar. Zat atau campuran yang diperiksa dilarutkan dalam pelarut yang sesuai,
kemudian diteteskan pada kertas dengan bantuan pipet kapiler. Titik penetesan kira-
kira 2 cm dari tepi bawah kertas (pada elusi menaik) atau pada jarak yang sesuai,
sehingga letak titik itu beberapa cm dibawah eluennya (pada elusi menurun).

Elusi dilakukan setelah eluen ditempatkan dalam bejana yang sesuai. Bejana itu
kemudian dipenuhkan dengan uap eluennya dengan cara menutupnya dan
mendiamkannya selama beberapa jam. Penjenuhan akan lebih baik dengan cara
meletakkan kertas saring yang dibasahi oleh eluen pada dinding dalam bejana. Ujung
kertas dicelupkan ke dalam eluen, dengan menjaga agar zat yang diperiksa tidak
terendam. Kertas hendaknya tidak menyentuh dinding bejana. Jarak elusi normal
pada elusi menaik adalah 1,5 cm, pada elusi menurun jarak itu sangat bervariasi.