ULANGAN TENGAH SEMESTER

MIKOLOGI

DISUSUN OLEH:

NAMA: PRIVITA MAULIDYA

NIM: F1071171031

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIKAN MATEMATIKAN & ILMU PENGETAHUAN ALAM
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS TANJUNGPURA
PONTIANAK
2019
A. Identitas Jurnal
1. Judul Jurnal:
Determination of cyclopeptide toxins in Amanita subpallidorosea and
Amanita virosa by high-performance liquid chromatography coupled
with high-resolution mass spectrometry
2. Nama Jurnal: Toxicon Journal
3. No./ Hal.: 133/26-32
4. Tahun: 2017
B. Resume
Spesies Lethal Amanita adalah kelompok jamur yang mengandung
cyclopeptide yang diklasifikasikan dalam sekte Amanita. Phalloideae, yang mana
bertanggung jawab atas lebih dari 90% dari semua keracunan jamur fatal di
seluruh dunia. Spesies Amanita yang mematikan yang telah menyebabkan fa-
talities sejak tahun 2000 di Cina termasuk A. Fuliginea, A. exitialis, A.
Subjunquillea, A. Pallidorosea, A. rimosa , dan A. Subpallidorosea. Racun
siklopeptida dari spesies Amanita diklasifikasikan menjadi tiga kelompok besar:
amatoxin, phallotoxins, dan virotoxins. Amatoksin adalah octapeptides bisiklik,
phallotoxins adalah biseptik heptapeptida, dan virotoksin adalah peptida
monosiklik. Amatoksin menghambat RNA polimerase II yang tergantung-DNA,
sedangkan phallotoxins dan virotoxins menstimulasi polimerisasi G-actin dan
stabilisasi filamen F-actin. Amatoksin dan phallotoxins pertama kali diisolasi dari
Amanita phalloides. Kuantitatif dan analisis kualitatif amatoxin dan phallotoxins
di berbagai jamur yang mengandung cyclopeptide dari Eropa, Amerika Utara, dan
Asia Timur telah dicapai dengan berbagai metode kromatografi atau kromatografi
cair yang digabungkan dengan analisis spektrometri massa (LC-MS). Namun,
virotoxins awalnya ditemukan di A. virosa dan tampaknya terbatas pada spesies
itu saja. Dalam penelitian kami sebelumnya, tujuh siklopeptida yang dikonfirmasi
diidentifikasi oleh LC-MS pada sepuluh spesies Amanita yang mematikan dari
Asia Timur, Eropa, dan Amerika Utara. Dari jumlah tersebut, viroidin terdeteksi
hanya pada A. Virosa.
A.subpallidorosea adalah sekte Amanita mematikan yang baru. Spesies
Phalloideae yang telah menyebabkan dua kematian di provinsi Guizhou, Cina
barat daya pada tahun 2014. Dalam proses deteksi toksin, ditemukan bahwa A.
subpallidorosea mengandung virotoxins. Maka dari itu, tujuan dari penelitian ini
adalah untuk mengidentifikasi racun cyclopeptide pada A. subpallidorosea dan A.
virosa dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi yang digabungkan
dengan spektrometri massa resolusi tinggi (HPLC-HRMS) dan untuk memperoleh
konsentrasi amatoxin, phallotoxins., dan virotox-in di A. subpallidorosea dan A.
virosa berdasarkan profil HPLCnya.
Adapun metode yang dilakukan yaitu pengumpulan jamur dan kondisi
sampel, identifikasi jamur dan analisis filogenetik berdasarkan urutan ITS,
ekstraksi racun siklopeptida, analisis HPLC, analisis HPLC-HRM, sampel standar
dan analisis kuantitatif racun siklepteptida. Sehingga hasil yang didapatkan yaitu
pada Identifikasi jamur dan analisis filogenetik berdasarkan urutan ITS,
didapatkan berdasarkan urutan ITS sangat menunjukkan bahwa A.
subpallidorosea dan A. virosa membentuk clade. Hasil ini konsisten dengan hasil
filogeni yang sebelumnya disimpulkan dari kumpulan data gabungan (nrLSU,
rpb2, ef1-a, dan b-tubulin) dan sekuens ITS. Pohon filogenetik yang dihasilkan
dari analisis kemungkinan maksimum berdasarkan urutan ITS. Hanya
kemungkinan bootstraps maksimum dan probabilitas posterior Bayesian lebih dari
50% dan 0,90, yang dilaporkan di cabang-cabang. Pada Identifikasi racun
cyclopeptide berdasarkan HPLC-HRMS, hasil yang didapatkan yaitu terdapat 15
senyawa yang menyajikan puncak pada gambar yangdisajikan dan dapat
dibedakan dengan jelas Puncak 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 12, dan 13 menghadirkan massa
yang tepat sesuai dengan b-amanitin, a-amanitin, phallisin, amanullin, phallisacin,
phallacidin, alaviroidin, viroisin, dan viroidin, masing-masing. Di antara itu,
Puncak 8 dan 9 memiliki waktu elusi yang sama puncak 10 dan 11 menyajikan
massa yang sama dengan yang sesuai dengan phalloidin. Puncak 11 memiliki
waktu elusi yang sama dengan waktu phalloidin standar. Oleh karena itu dapat
disimpulkan bahwa puncak 11 adalah phalloidin, sedangkan puncak 10
kemungkinan merupakan analog dari phalloidin, yang kami sebut "phalloidin II".
Puncak 14 dan 15 menghasilkan massa yang akurat, tetapi tidak ada senyawa
yang diketahui yang dilaporkan. Pada Konsentrasi racun siklopeptida dalam A.
subpallidorosea dan A. Virosa, isi utama amatoxin (a-AMA dan b-AMA) dan
phallotoxin (PSC, PCD, dan PHD) dari A. subpallidorosea dan A. Virosa
menunjukkan bahwa sampel A. subpallidorosea mengandung tiga racun utama (a-
AMA, b-AMA, dan PHD), dan memiliki total kandungan toksin mulai dari 7,72
hingga 8,88 mg g 1 berat kering. Untuk A. virosa, satu sampel mengandung empat
racun utama (a-AMA, PSC, PCD, dan PHD), sementara yang lain hanya
mengandung dua racun utama (a-AMA dan PHD). Jumlah total toksin berkisar
dari 3,06 hingga 5,48 mg g 1 berat kering.Kadar a-AMA dan total racun dari A.
virosa yang diuji diperkirakan masing-masing 1,13-2,88 dan 3,06-5,48 mg g 1
berat kering (Tabel 3), sebanding dengan nilai yang dilaporkan sebelumnya (1,34-
1. 60 dan 4.14-6.09 mg g 1 berat kering masing-masing) Isi relatif dari 10 racun
cyclopeptide lainnya dalam spesies A. subpallidorosea dan A. Virosa. Hasilnya
menunjukkan bahwa sembilan racun hadir dalam A. subpallidorosea dan hanya
enam racun yang ada dalam A. virosa. Jumlah racun ini dalam A. subpallidorosea
lebih tinggi dari pada A. virosa. Selain itu, kandungan relatif dari masing-masing
toksin berbeda dalam sampel situs pengumpulan yang berbeda.
Sehingga, dapat ditarik kesimpulan bahwa dari hasil penelitian tiga belas
siklopeptida diidentifikasi dari A. subpallidorosea dan A. virosa dengan
kromatografi cair kinerja tinggi ditambah dengan spektrometri massa resolusi
tinggi dan virotoxins yang sebelumnya tampaknya dibatasi untuk A. virosa
dilaporkan dalam A. subpallidorosea. Profil racun siklopeptida konsisten dengan
hubungan filogenetik molekuler.
 Toxicon 133 (2017) 26-32

Penentuan Racun Cyclopeptide pada Amanita Subpallidorosea dan Amanita

Virosa dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Digabungkan dengan
Spektrometri Massa Resolusi Tinggi

Jiahui Wei1, Jianfeng Wu2, Jia Chen a, Bidong Wu 4, Zhengmi He 5, Ping Zhang 6,
Haijiao Li 7, Chengye Sun 8, Chang Liu 9, Zuohong Chen 10, Jianwei Xie11

ABSTRAK

Amanita subpallidorosea adalah jenis Amanita mematikan yang baru

ditemukan. Spesies Phalloideae ditemukan di Cina yang dikelompokkan dengan
Amanita virosa dalam clade yang sama berdasarkan analisis filogenetik
molekuler. Namun, kandungan racun cyclopeptide dari jamur mematikan ini
masih kurang diteliti. Dalam penelitian ini, racun cyclo-peptide pada A.
subpallidorosea dilaporkan untuk pertama kalinya dan komposisi cyclopeptide
spesies A. subpallidorosea dan A. virosa dianalisis secara sistematis. Tiga belas
siklopeptida dan dua senyawa yang tidak diketahui diidentifikasi atau diamati dari
dua jamur mematikan ini dengan kromatografi cair kinerja tinggi ditambah
dengan spektrometri massa resolusi tinggi. Dari siklopeptida yang diketahui,
virotoxins alaviroidin, viroisin, dan viroidin, yang sebelumnya dianggap terbatas
pada A. virosa, diidentifikasi dalam A. subpallidorosea. Komposisi cyclopeptide
menunjukkan bahwa ada keragaman dalam jenis dan kadar amatoxin,
phallotoxins, dan virotoxins antara spesies A. subpallidorosea dan A. virosa, dan
bahwa jumlah total racun dalam A. subpallidorosea yang diuji secara signifikan
lebih tinggi daripada di menguji A. virosa. Lebih lanjut, konsistensi racun
siklopeptida dengan hubungan filogenetik molekuler ditunjukkan.

Kata kunci: Amanita, Amatoxins, Phallotoxins, Virotoxins

1. PENGANTAR
Spesies Lethal Amanita adalah kelompok jamur yang mengandung
cyclopeptide yang diklasifikasikan dalam sekte Amanita. Phalloideae (Fr.) Quel,
yang terdiri dari sekitar 50 anggota di seluruh dunia (Cai et al., 2014, 2016).
Spesies ini bertanggung jawab atas lebih dari 90% dari semua keracunan jamur
fatal di seluruh dunia (Karlson-Stiber dan Persson, 2003; Berger dan Guss, 2005;
Chen et al., 2014). Di Eropa dan Amerika Utara, spesies Amanita yang
mematikan termasuk A. phalloides, A. verna, A. virosa, A. ocreata, A.
bisporigera, A. suballiacea, A. ten-uifolia, dan A. phalloides var. alba, yang
semuanya telah menyebabkan kematian manusia (Enjalbert et al., 2002; Karlson-
Stiber dan Persson, 2003;Kaya et al., 2013).
 Spesies Amanita yang mematikan yang telah menyebabkan fa-talities
sejak tahun 2000 di Cina termasuk A. fuliginea Hongo (Chen et al., 2014), A.
exitialis Zhu L. Yang & TH Li (Yang dan Li, 2001; Chen et al., 2014), A.
subjunquillea var. alba Zhu L. Yang (Chen et al., 2014), A. pallidorosea P. Zhang
& Zhu L. Yang (Cao et al., 2011), A. rimosa P. Zhang & Zhu L. Yang (Jiang et al.
, 2016; Tang et al., 2016), dan A. subpallidorosea Hai J. Li (Li et al., 2015).
Racun siklopeptida dari spesies Amanita diklasifikasikan menjadi tiga
kelompok besar: amatoxin, phallotoxins, dan virotoxins. Amatoksin adalah
octapeptides bisiklik, phallotoxins adalah biseptik heptapeptida, dan virotoksin
adalah peptida monosiklik (Wieland, 1986; Clarke et al., 2012). Amatoksin
menghambat RNA polimerase II yang tergantung-DNA, sedangkan phallotoxins
dan virotoxins menstimulasi polimerisasi G-actin dan stabilisasi filamen F-actin
(Wieland, 1986).
Amatoksin dan phallotoxins pertama kali diisolasi dari Amanita phalloides
(Wieland, 1986). Sejak itu, kuantitatif dan
analisis kualitatif amatoxin dan phallotoxins di berbagai jamur yang mengandung
cyclopeptide dari Eropa, Amerika Utara, dan Asia Timur telah dicapai dengan
berbagai metode kromatografi atau kromatografi cair yang digabungkan dengan
analisis spektrometri massa (LC-MS) (Enjalbert et al., 1992, 1993 ; Sgambelluri
et al., 2014; Kaya et al., 2013; Hu et al., 2012; Jansson et al., 2012; Garcia et al.,
2015; Ahmed et al., 2010). Namun, virotoxins awalnya ditemukan di A. virosa
dan tampaknya terbatas pada spesies itu saja (Faulstich et al., 1980; Wieland,
1986; Jansson et al., 2012). Dalam penelitian kami sebelumnya, tujuh siklopeptida
yang dikonfirmasi diidentifikasi oleh LC-MS pada sepuluh spesies Amanita yang
mematikan dari Asia Timur, Eropa, dan Amerika Utara. Dari jumlah tersebut,
viroidin terdeteksi hanya pada A. virosa (Tang et al., 2016).
A. subpallidorosea adalah sekte Amanita mematikan yang baru. Spesies
Phalloideae yang telah menyebabkan dua kematian di provinsi Guizhou, Cina
barat daya pada tahun 2014 (Li et al., 2015). Anehnya, dalam proses deteksi
toksin, kami menemukan bahwa A. subpallidorosea mengandung virotoxins.
Akibatnya, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi racun
cyclopeptide di A. subpallidorosea dan A. virosa dengan menggunakan
kromatografi cair kinerja tinggi yang digabungkan dengan spektrometri massa
resolusi tinggi (HPLC-HRMS) dan untuk memperoleh konsentrasi amatoxin,
phallotoxins. , dan virotox-in di A. subpallidorosea dan A. virosa berdasarkan
profil HPLC mereka.

2. BAHAN-BAHAN DAN METODE-METODE

2.1. Pengumpulan jamur dan kondisi sampel
Tiga sampel A. subpallidorosea yang dikumpulkan dari Cina dan dua
sampel A. virosa yang dikumpulkan dari Cina dan Jerman dimasukkan dalam
penelitian ini. Sampel disimpan di Mycological Her-barium Universitas Normal
Hunan (MHHNU) dan Herbarium Crypto-gamic dari Institut Botani Kunming,
Akademi Ilmu Pengetahuan Cina (HKAS). Informasi tentang koleksi dan nomor
aksesi ITS mereka di GenBank diberikan pada Tabel 1 dan Gambar. 1.
Tabel 1
Daftar sampel dianalisis dalam penelitian ini.
Nama ilmiah Spesies no. Asal geografis Waktu pengumpulan ITS GenBank No.

A. subpallidorosea Hai J. Li MHHNU 8617 Sangzhi, Hunan 2015.9.9 KU601411

A. subpallidorosea MHHNU 30709 Dongan, Hunan 2010.9.16 KU601410

A. subpallidorosea LHJ141013-01 Zunyi, Guizhou 2014.10.13 KP691678

A. virosa (Fr.) Bertillon MHHNU 8621 Sangzhi, Hunan 2015.9.9 KY472227

A. virosa HKAS 84859 Germany 2009.9.20 KR862367

Gambar 1. Basidiomata dari spesies Amanita. A. A. subpallidorosea (MHHNU

8617); B. A. subpallidorosea (MHHNU 30709); C. A. subpallidorosea
(LHJ141013-01); D. A. virosa (MHHNU 8621) (foto A, B, dan D oleh Zuohong
Chen; foto C oleh Jianwei Xie).

2.2. Identifikasi jamur dan analisis filogenetik berdasarkan urutan ITS

Semua spesies Amanita diidentifikasi oleh analisis filogenetik morfologis
dan molekuler. Ekstraksi DNA, amplifikasi rantai polimerase (PCR) amplifikasi,
sekuensing, dan penyelarasan sekuens ITS diikuti Zhang et al. (2010) dan Cai et
al. (2014). Pohon filogenetik dihasilkan dengan kedua analisis likeli-kap
maksimum dan Bayesian Inference melakukan pada RAxML 7.2.6 (Stamatakis,
2006) dan MrBayes 3.2.4 (Ronquist dan Huelsenbeck, 2003) masing-masing
dengan parameter yang digunakan dalam Cai et al. (2014), kecuali bahwa
inferensi Bayesian dilakukan untuk 10 juta generasi.

2.3. Ekstraksi racun siklopeptida

Potongan pileus dari ikan mas sampel dipotong dan dikeringkan dengan
berat konstan dan kemudian ditumbuk menggunakan KC-04 semprot. Untuk
setiap sampel, 0,02 g bahan giling ditimbang, dibagikan secara akurat ke masing-
masing tabung reaksi, dan racun peptida diekstraksi dengan 2 mL asam format /
metanol / air (0,5: 50: 49,5, v / v / v). Tabung reaksi kemudian dikocok pada 200
rpm selama 12 jam. Setelah sentrifugasi pada 14.000 rpm selama 10 menit,
supernatan didekantasi dan ditahan sementara residu diekstraksi lagi seperti
dijelaskan di atas. Dua super-natants digabungkan, diuapkan, dan residu
dilarutkan dalam 1 mL air. Larutan ini mengalami degradasi dalam petroleum
eter, diuapkan lagi, dan residunya diuraikan kembali dalam 100 mL metanol 10%
dalam air untuk analisis HPLC. Ekstraksi dilakukan dalam rangkap tiga untuk
setiap sampel dan nilai rata-rata ditentukan.

2.4. Analisis HPLC

Siklopeptida dianalisis pada sistem Agilent 1100 HPLC (USA) yang
digabungkan dengan detektor panjang gelombang variabel (VWD). Pemisahan
dilakukan pada kolom Agilent 300 E Extend-C 18 (250 mm 4,6 mm, 5 mm) pada
40 C. Absorbansi eluat dipantau pada 295 nm. Fase gerak terdiri dari (A) 0,02 M
amonium asetat berair yang mengandung 0,05% TFA dan (B) met-anol. Profil
elusi adalah sebagai berikut: (1) 0-40 mnt, 10-50% B;(2) 40-45 mnt, 50-10% B;
Waktu posting: 10 mnt. Laju aliran fase gerak adalah 1 mL min 1 dan volume
injeksi sampel adalah 5 mL. Eluat puncak dikumpulkan untuk analisis MS.

2.5. Analisis HPLC-HRMS

2.5.1. Kondisi HPLC

Waters Acquity UPLC (Waters, USA), CAPCELL PAK C18 (2,1 mm 100
mm, 2,7 mm), F3643 EXP® GUARD CARTRIDGE CORE CORE SORE C18 S-
2,7 (2,1 5 mm, 2,7 mm); fase gerak: (A) 0,01 M amonium asetat berair; (B)
metanol. Elusi gradien: 0-1 mnt, 5% B; 1-20 mnt, 5-50% B; 20-25 mnt, 50-95%
B; 25-27 mnt, 95% B; 27-27.1 mnt, 95e5% B; 27.1-30 mnt, 5% B; laju aliran:
0,25 mL / menit; volume injeksi: 5 mL; suhu kolom: 40 C.
2.5.2. Kondisi HRMS
Waters Xevo G2-QTOF MS / MS dalam mode ionisasi positif
electrospray; suhu sumber: 100 C; mode akuisisi pemindaian penuh; rentang
pemindaian: m / z 50e1000; tegangan kapiler: 3 kV; tegangan sampel kerucut: 30
V; tegangan kerucut ekstraksi: 4 V; aliran kerucut: 50 L / jam; suhu desolvasi:
300 C; gas desolvasi: 600 L / jam; kalibrasi massal: lockspray dengan 556.2771
Da leucine encephalin.

2.6. Sampel standar dan analisis kuantitatif racun siklepteptida

Sampel standar a-amanitin (a-AMA, dibeli dari Merck-Calbiochem,
Merck KGaA, Darmstadt, Jerman), b-amanitin (b-AMA, Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO USA), phallisacin (PSC, Sigma -Aldrich), phallacidin (PCD, Sigma-
Aldrich), dan phalloidin (PHD, Sigma-Aldrich) dilarutkan dalam air suling ganda
hingga konsentrasi 0,1 mg mL 1. Konsentrasi racun ini adalah dihitung
menggunakan area puncak senyawa referensi. Konsentrasi amatoksin,
phallotoxins, dan virotoxins dinyatakan sebagai rata-rata ± SD.
3. HASIL

3.1. Identifikasi jamur dan analisis filogenetik berdasarkan urutan ITS

Spesies A. subpallidorosea dan A. virosa diidentifikasi oleh karakteristik
morfologis, dan identifikasi dikonfirmasi oleh urutan ITS (Tabel 1). Pohon yang
dihasilkan (Gbr. 2) berdasarkan urutan ITS sangat menunjukkan bahwa A.
subpallidorosea dan A. virosa membentuk clade. Hasil ini konsisten dengan hasil
filogeni yang sebelumnya disimpulkan dari kumpulan data gabungan (nrLSU,
rpb2, ef1-a, dan b-tubulin) dan sekuens ITS (Cai et al., 2014, 2016; Li et al.,
2015).
Gambar. 2. Pohon filogenetik yang dihasilkan dari analisis kemungkinan
maksimum berdasarkan urutan ITS. Hanya kemungkinan bootstraps maksimum
dan probabilitas posterior Bayesian lebih dari 50% dan 0,90, yang dilaporkan di
cabang-cabang.

3.2. Identifikasi racun cyclopeptide berdasarkan HPLC-HRMS

Sampel dianalisis menggunakan HPLC-quadrupole time-of-flight (QTOF)
MS / MS. Profil HPLC ditunjukkan pada Gambar. 3 dan informasi QTOF-MS
untuk 15 senyawa yang menyajikan puncak yang dapat dibedakan dengan jelas
ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S1. Hasil identifikasi untuk 15 senyawa
ditunjukkan pada Tabel 2. Puncak 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 12, dan 13 menghadirkan
massa yang tepat sesuai dengan b-amanitin, a-amanitin, phallisin, amanullin,
phallisacin, phallacidin, alaviroidin, viroisin, dan viroidin, masing-masing. Di
antara mereka, Puncak 8 dan 9 memiliki waktu elusi yang sama.
Tabel 2
Massa dan formula senyawa yang tepat dalam penelitian ini.
Massa benar (Da) Massa yang diamati Massa galat Rumus benar Rumus yang diamati
Nomor
Senyawa
puncak

(Clarke et al., 2012) (Da) (ppm) (Clarke et al., 2012) [M þ Hþ]

C H NO S C H NO S
1 b-Amanitin 919.3382 920.3447 [M þ Hþ] 1.5 39 53 9 15 39 54 9 15

C H N O S C H N O S
2 a-Amanitin 918.3542 919.3606 [M þ Hþ] 1.6 39 54 10 14 39 55 10 14

C H N O S C H N O S
3 g-Amanitin 902.3593 903.3696 [M þ Hþ] 2.6 39 54 10 13 39 55 10 13

C H NO S C H NO S
4 Phallisin 804.3112 805.3286 [M þ Hþ] 0.8 35 48 8 12 35 49 8 12

C H N O S C H N O S
5 Amaninamide 902.3593 903.3696 [M þ Hþ] 2.6 39 54 10 13 39 55 10 13

C H N O S C H N O S
6 Amanullin 886.3643 887.3691 [M þ Hþ] 3.5 39 54 10 12 39 55 10 12

C H NO S C H NO S
7 Phallisacin 862.3167 863.3264 [M þ Hþ] 2.0 37 50 8 14 37 51 8 14

C H NO S C H NO S
8 Phallacidin 846.3218 847.3286 [M þ Hþ] 1.3 37 50 8 13 37 51 8 13

C H NO S C H NO S
9 Ala-viroidin 868.3273 869.3367 [M þ Hþ] 1.6 36 52 8 15 36 53 8 15

C H NO S
10 Phalloidin II e 789.3232 [M þ Hþ] e e 35 49 8 11

C H NO S C H NO S
11 Phalloidin 788.3163 789.3232 [M þ Hþ] 1.3 35 48 8 11 35 49 8 11

C H NO S C H NO S
12 Viroisin 912.3535 913.3608 [M þ Hþ] 0.7 38 56 8 16 38 57 8 16

13 Viroidin 896.3586 897.3683 [M þ Hþ] 2.0

C H NO S
38 56 8 15
C H NO S
38 57 8 15
 14 Unknown I e 915.3796 [M þ Hþ] e e C38H59N8O16Sa

15 Unknown II e 817.3523 [M þ Hþ] e e C37H53N8O11Sa

catatan:
a
Berarti formula yang diberikan adalah formula yang diusulkan.

Puncak 10 dan 11 menyajikan massa yang sama dengan yang sesuai

dengan phalloidin (lihat Tabel 2). Puncak 11 memiliki waktu elusi yang sama
dengan waktu phalloidin standar. Oleh karena itu kami menyimpulkan bahwa
puncak 11 adalah phalloidin, sedangkan puncak 10 kemungkinan merupakan
analog dari phalloidin, yang kami sebut "phalloidin II" selanjutnya. Spektrum MS
/ MS pada puncak 10, 11 dan referensi standar phalloidin ditunjukkan pada
Gambar Tambahan. S2. Puncak 3 dan 5 menghasilkan ion [M þ Hþ] dari m / z
903.3646, yang dapat berhubungan dengan amaninamide atau g-amanitin,
keduanya memiliki massa 902,3592. Menurut laporan kami sebelumnya (Tang et
al., 2016), puncak 5 diidentifikasi sebagai amani-namide, sehingga puncak 3
diidentifikasi sebagai g-amanitin. Puncak 14 dan 15 menghasilkan massa yang
akurat, tetapi tidak ada senyawa yang diketahui yang dilaporkan. Spektra MS /
MS mereka, dibandingkan dengan phalloidin, referensi standar viroidin,
ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S3.

Tabel 3
Kandungan amatoxin dan phallotoxin utama dalam dua spesies Amanita (mg g1 berat kering).
Amatoxins Phallotoxins
Tot
a-AMA b-AMA Total PSC PCD PHD al

Nama ilmiah dan Spesies no. Total konten

3.5 2.5
A. subpallidorosea MHHNU 8617 3 ± 0.25 1.91 ± 0.15 5.44 0 0 3 ± 0.19 2.53 7.97

4.2 1.5
A. subpallidorosea MHHNU30709 9 ± 0.20 1.92 ± 0.10 6.21 0 0 1 ± 0.02 1.51 7.72

5.1 1.6
A. subpallidorosea LHJ141013-01 0 ± 0.25 2.17 ± 0.10 7.27 0 0 1 ± 0.07 1.61 8.88

2.8 2.6
A. virosa MHHNU 8621 8 ± 0.002 0 2.88 0 0 0 ± 0.003 2.60 5.48

1.1 0.4
A. virosa HKAS 84859 3 ± 0.003 0 1.13 0.44 ± 0.003 1.02 ± 0.004 7 ± 0.002 1.93 3.06

Gambar. 3. Profil HPLC racun cyclopeptide diekstraksi dari spesies A.

 Tabel 4
Isi relatif dari racun siklopeptida lain dalam dua spesies Amanita (% berat
kering)a.

Scientific name and Amatoxins Phallotoxins Virotoxins Unknown

Species no.

g-AMA Amanullin Amaninamide Phallisin Phalloidin II Ala-viroidin Viroidin Viroisin 817.3523 915.3796

[M þ Hþ] [M þ Hþ]

A. subpallidorosea 45.8 ± 0.04 17.7 ± 0.43 0 9.0 ± 0.20 22.9 ± 0.02 60.3 ± 0.23 75.3 ± 0.13 112.7 ± 0.13 7.4 ± 0.21 7.5 ± 0.05

MHHNU 8617

A. subpallidorosea 5.3 ± 0.63 14.9 ± 0.33 0 17.5 ± 0.07 58.7 ± 0.20 43.0 ± 0.25 65.1 ± 0.11 97.1 ± 0.50 3.5 ± 0.30 4.5 ± 0.30

MHHNU30709

A. subpallidorosea 26.8 ± 0.02 10.9 ± 0.11 0 11.7 ± 0.06 7.0 ± 0.10 50.9 ± 0.02 101.5 ± 0.05 26.9 ± 0.02 3.0 ± 0.01 9.6 ± 0.02

LHJ141013-01

A. virosa MHHNU 8621 0 0 25.2 ± 0.37 2.6 ± 0.02 44.2 ± 0.04 0 80.2 ± 0.10 0 8.4 ± 0.01 16.9 ± 0.04

A. virosa HKAS 84859 0 0 24.3 ± 0.11 5.1 ± 0.08 44.7 ± 0.36 0 5.0 ± 0.03 0 4.4 ± 0.04 11.3 ± 0.04

Kandungan relatif dari masing-masing toksin dihitung dengan menggunakan

daerah puncak masing-masing toksin dibandingkan dengan a-amatoxin sebagai
senyawa referensi. Kandungan relatif% berat kering dinyatakan sebagai rata-rata
± SD.

3.3. Konsentrasi racun siklopeptida dalam A. subpallidorosea dan A. Virosa

Isi utama amatoxin (a-AMA dan b-AMA) dan phallotoxin (PSC, PCD,
dan PHD) dari A. subpallidorosea dan A. virosa diberikan pada Tabel 3. Hasilnya
menunjukkan bahwa sampel A. subpallidorosea mengandung tiga racun utama (a-
AMA, b-AMA, dan PHD), dan memiliki total kandungan toksin mulai dari 7,72
hingga 8,88 mg g 1 berat kering. Untuk A. virosa, satu sampel mengandung empat
racun utama (a-AMA, PSC, PCD, dan PHD), sementara yang lain hanya
mengandung dua racun utama (a-AMA dan PHD). Jumlah total toksin berkisar
dari 3,06 hingga 5,48 mg g 1 berat kering. Selain itu, amatoxin, yang merupakan
satu-satunya racun yang bertanggung jawab atas kematian manusia, sangat
bervariasI antara kedua spesies, dengan jumlah amatoksin pada A.
subpallidorosea yang diuji menjadi dua hingga tiga kali lipat lebih banyak
daripada yang ada pada A. virosa yang diuji. Kadar a-AMA dan total racun dari
A. virosa yang diuji diperkirakan masing-masing 1,13-2,88 dan 3,06-5,48 mg g 1
berat kering (Tabel 3), sebanding dengan nilai yang dilaporkan sebelumnya (1,34-
1. 60 dan 4.14-6.09 mg g 1 berat kering masing-masing) (Sgambelluri et al., 2014;
Tang et al., 2016).
Isi relatif dari 10 racun cyclopeptide lainnya dalam spesies A.
subpallidorosea dan A. virosa diberikan pada Tabel 4. Hasilnya menunjukkan
bahwa sembilan racun hadir dalam A. subpallidorosea dan hanya enam racun
yang ada dalam A. virosa. Jumlah racun ini dalam A. subpallidorosea lebih tinggi
dari pada A. virosa. Selain itu, kandungan relatif dari masing-masing toksin
berbeda dalam sampel situs pengumpulan yang berbeda. Sebagai contoh, A.
subpallidorosea MHHNU 8617 dan MHHNU 8617 yang dikumpulkan dari
Provinsi Hunan memiliki kandungan viroisin tertinggi, sedangkan A.
subpallidorosea MHHNU 85407 yang dikumpulkan dari Provinsi Guizhou
memiliki kandungan viroidin tertinggi.

4. DISKUSI
4.1. Keanekaragaman dan spesifisitas racun siklopeptida di Indonesia
A. subpallidorosea
A. subpallidorosea adalah jamur mematikan yang baru-baru ini ditemukan
yang menyebabkan dua kematian di Cina barat daya pada tahun 2014. Morfologis
dan data filogenetik molekuler menunjukkan bahwa jamur merindukan sekte
Amanita. Phalloideae (Li et al., 2015). "Amanita sp. 2 ”dikumpulkan dari Taiwan
di Cai et al. (2014) kemudian diidentifikasi sebagai A. subpallidorosea, dan
spesies ini diperkirakan terutama didistribusikan di daerah subtropis (Cai et al.,
2016). Toksin cyclopeptide pada A. subpallidorosea belum pernah dianalisis.
Dalam tulisan ini, racun siklopeptida dalam dua sampel A. subpallidorosea
dikumpulkan dari Provinsi Hunan (MHHNU8617 dan MHHUN 30709) dan
sampel yang dikumpulkan dari Provinsi Guizhou (LHJ141013-01) dianalisis
untuk pertama kalinya. Hasil menunjukkan bahwa 12 racun telah diidentifikasi
dalam A. subpallidorosea, di mana sembilan racun dikenal sebagai siklopeptida,
satu adalah analog phalloidin ("phalloidin II"), dan dua racun tidak diketahui
berbobot. Yang mengejutkan, dari siklopeptida yang diketahui, alaviroidin,
viroisin, dan viroidin terdeteksi pada A. subpallidorosea.
Virotoxins, yang merupakan peptida monosiklik yang menyerupai
phallotoxins bicyclic baik dalam fitur struktural umum dan aktivitas bio-logis,
awalnya ditemukan di A. virosa dan tampaknya terbatas pada spesies itu saja
(Faulstich et al., 1980; Wieland, 1986). Senyawa dengan konsentrasi yang lebih
tinggi dan massa 848 dalam jamur A. exitialis yang mematikan diidentifikasi
sebagai desoxoviroidin oleh Deng et al. (2011) dan Hu dan Chen (2014). Namun,
identifikasi ini telah terbukti salah, karena massa desox-oviroidin adalah 880
(Tang et al., 2016). Dalam penelitian kami sebelumnya, perbedaan toksin
siklopeptida utama pada sembilan spesies bagian Amanita Phalloideae (enam
spesies dari Asia Timur dan tiga spesies dari Eropa dan Amerika Utara) dianalisis
secara sistematis, dan tujuh siklopeptida diidentifikasi secara pasti dengan
menggunakan LC- Analisis MS. Dari tujuh siklepteptida afirmatif, viroidin
terdeteksi hanya pada A. virosa (Tang et al., 2016). Dalam laporan sebelumnya
(Jansson et al., 2012; Clarke et al., 2012; Sgambelluri et al., 2014; Garcia et al.,
2015), identifikasi racun cyclopeptide pada spesies Amanita dan Lepiota dengan
menggunakan LC-MS ditunjukkan bahwa tidak ada virotoxins pada spesies jamur
ini kecuali A. virosa. Oleh karena itu, sejauh pengetahuan kami, virotoxins belum
terdeteksi pada spesies Amanita mematikan lainnya. Inilah alasan mengapa A.
virosa telah dipilih untuk studi banding dalam makalah ini.
4.2. Konsistensi keberadaan siklopeptida dengan hubungan filogenetik
molekuler
Amanitas mematikan di sekte genus Amanita. Phalloideae dibagi menjadi
sembilan clade utama berdasarkan analisis gen DNA multi-lokus dalam
kombinasi dengan biokimia dan analisis morfologi (Cai et al., 2014). A.
subpallidorosea dan A. virosa dikelompokkan dalam clade yang sama dalam
laporan ini (Cai et al., 2014; Li et al., 2015; Tang et al., 2016), menunjukkan
bahwa kedua spesies memiliki filogenetika yang dekat hubungan. Selain itu,
dendrogram berdasarkan profil kromatografi siklopeptida sangat konsisten dengan
hasil analisis filogenetik berdasarkan pada ITS mereka se-quences (Tang et al.,
2016). Dalam penelitian kami saat ini, lima spesies A. subpallidorosea dan A.
virosa dikelompokkan sesuai dengan analisis filogenetik berdasarkan urutan ITS.
Selain itu, viro-toksin telah terdeteksi pada spesies A. subpallidorosea dan A.
virosa. Hasil ini menunjukkan bahwa pro-file toksin cyclopeptide konsisten
dengan hubungan filogenetik berdasarkan bukti molekuler. Penelitian sebelumnya
telah menunjukkan bahwa racun cyclopeptide jamur Amanita disintesis pada
ribosom dan gen penyandi yang diketahui berada dalam keluarga gen MSDIN
(Hallen et al., 2007). Analisis gen keluarga MSDIN pada beberapa spesies
mematikan bagian Amanita Phalloideae menunjukkan bahwa ada keragaman dan
konsensus yang signifikan dalam gen toksin antara spesies dan mengklarifikasi
bahwa sebagian besar gen diprediksi menyandikan peptida siklik yang tidak
diketahui (Hallen et al., 2007; Li et al., 2014; Pulman et al., 2016). hasil-hasil ini
dapat dengan baik menjelaskan keragaman cyclopeptides, konsistensi profil racun
cyclo-peptide dengan hubungan filogenetik molekuler dan keberadaan racun baru.
Virotoxins, karena kesamaan struktural yang cukup mencolok dengan phallotoxin,
kami memperkirakan bahwa mereka juga dikodekan oleh gen keluarga MSDIN,
penelitian ini sedang dilakukan.
5. KESIMPULAN
Tiga belas siklopeptida diidentifikasi dari A. subpallidorosea dan A.
virosa dengan kromatografi cair kinerja tinggi ditambah dengan spektrometri
massa resolusi tinggi dan virotoxins yang sebelumnya tampaknya dibatasi untuk
A. virosa dilaporkan dalam A. subpallidorosea. Profil racun siklopeptida
konsisten dengan hubungan filogenetik molekuler.

Konflik kepentingan
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan.

Kontribusi penulis
Chen ZH dan Xie JW menyusun dan merancang eksperimen; Wei JH, Wu JF,
Chen J, Wu BD, dan Liu C mendeteksi dan menganalisis racun cyclopeptide; He
ZM melakukan sekuens DNA ITS dari semua spesies Amanita; Zhang P, Li HJ,
dan Sun CY menyediakan beberapa bahan Amanita dan mengidentifikasi spesies;
Chen ZH dan Xie JW menulis surat kabar itu. Semua penulis menyetujui
pengajuan akhir. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah final.

Ucapan Terima Kasih

Para penulis sangat berterima kasih kepada Prof. Yang ZL dan Dr. Cai Q (Institut
Botani Kunming, Akademi Ilmu Pengetahuan Cina, China) karena menyediakan
sampel Amanita virosa yang dikumpulkan dari Jerman untuk penelitian ini dan
membangun analisis filogenetik berdasarkan pada urutan ITS. Studi ini didukung
oleh Lembaga Sains Nasional China (Hibah No. 31372118) dan Yayasan Riset
Biro Pendidikan Provinsi Hunan, Cina (Hibah No. 13A059).

Lampiran A. Data tambahan

Data tambahan yang berkaitan dengan artikel ini dapat ditemukan di http: //
dx.doi.org/10.1016/j.toxicon.2017.04.012.

Dokumen transparansi
Dokumen transparansi yang terkait dengan artikel ini dapat ditemukan online di
http://dx.doi.org/10.1016/j.toxicon.2017.04.012.
REFERENSI
Ahmed, W.H.A., Gonmori, K., Suzuki, M., Watanabe, K., Suzuki, O., 2010.
Simulta-neous analysis of a-amanitin, b-amanitin, and phalloidin in toxic
mushrooms by liquid chromatography coupled to time-of-flight mass
spectrometry. Forensic Toxicol. 28, 69-76. http://dx.doi.org/10.1007/s11419-
009-0089-7.
Berger, K.J., Guss, D.A., 2005. Mycotoxins revisited: Part I. J. Emerg. Med. 28,
53-62. http://dx.doi.org/10.1016/j.jemermed.2004.08.013.
Cai, Q., Cui, Y.Y., Yang, Z.L., 2016. Lethal amanita species in China. Mycologia
108, 993e1009. http://dx.doi.org/10.3852/16-008.
Cai, Q., Tulloss, R.E., Tang, L.P., Tolgor, B., Zhang, P., Chen, Z.H., Yang, Z.L.,
2014. Multi-locus phylogeny of lethal amanitas: implications for species
diversity and his-torical biogeography. BMC Evol. Biol. 14, 143.
http://dx.doi.org/10.1186/1471-2148-14-143.
Cao, R.M., Liu, Z., Zhang, J., Liu, S.Q., Sun, Y.B., Zhang, J., Liu, S.H., Liu, L.Z.,
Cao, X.L., Jia, T.H., 2011. Disposal report of a case of mushroom poisoning
caused by Amanita pallidorosea. J. Shangdong Univ. Health Sci. 49, 160e164
(in Chinese).
Chen, Z.H., Zhang, P., Zhang, Z.G., 2014. Investigation and analysis of 102
mushroom poisoning cases in Southern China from 1994 to 2012. Fungal
Divers 64, 123e131. http://dx.doi.org/10.1007/s13225-013-0260-7.
Clarke, D.B., Lloyd, A.S., Robb, P., 2012. Application of liquid chromatography
coupled to time-of-flight mass spectrometry separation for rapid assessment
of toxins in Amanita mushrooms. Anal. Methods 4, 1298e1309.
http://dx.doi.org/ 10.1039/C2AY05575A.
Deng, W.Q., Li, T.H., Xi, P.G., Gan, L.X., Xiao, Z.D., Jiang, Z.D., 2011. Peptide
toxin components of Amanita exitialis basidiocarps. Mycologia 103,
946e949. http:// dx.doi.org/10.3852/10-319.
Enjalbert, F., Gallion, C., Jehl, F., Monteil, H., Faulstich, H., 1992. Simultaneous
assay for amatoxins and phallotoxins in Amanita phalloides Fr. by high-
performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 598, 227e236.
http://dx.doi.org/ 10.1016/0021-9673(92)85052-U.
Enjalbert, F., Gallion, C., Jehl, F., Mohteil, H., Faulstich, H., 1993. Amatoxins
and phallotoxins in Amanita species: high-performance liquid
chromatographic determination. Mycologia 85, 579e584.
http://dx.doi.org/10.2307/3760504.
Enjalbert, F., Rapior, S., Nouguier-Soule, J., Guillon, S., Amouroux, N., Cabot,
C., 2002. Treatment of amatoxin poisoning: 20-year retrospective analysis. J.
Toxicol.
Clin. Toxicol. 40, 715e757. http://dx.doi.org/10.1081/CLT-120014646.
Faulstich, H., Buku, A., Bodenmuller, H., Dabrowski, J., Wieland, T., 1980.
Virotoxins: actin binding cycle peptides of Amanita virosa mushrooms.
Biochemistry 19, 3334e3343. http://dx.doi.org/10.1021/bi00555a036.
Garcia, J., Oliveira, A., de Pinho, P.G., Freitas, V., Carvalho, A., Baptista, P.,
Pereira, E., de Lourdes Bastos, M., Carvalho, F., 2015. Determination of
amatoxins and phallotoxins in Amanita phalloides mushrooms from
northeastern Portugal by HPLC-DAD-MS. Mycologia 107, 679e687.
http://dx.doi.org/10.3852/14-253.
Hallen, H.E., Luo, H., Scott-Craig, J.S., Walton, J.D., 2007. Gene family
encoding the major toxins of lethal Amanita mushrooms. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 104, 19097e19101. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0707340104.
Hu, J.S., Chen, Z.H., 2014. Isolation and preparation of cyclopeptide toxins by
macroporous adsorptive resins combined with sephadex LH20 column chro-
matography from Amanita exitialis. Mycosystema 33, 549e559. http://
dx.doi.org/10.13346/j.mycosystema.140075 (in Chinese).
Hu, J.S., Zhang, P., Zeng, J., Chen, Z.H., 2012. Determination of amatoxins in
different tissues and development stages of Amanita exitialis. J. Sci. Food
Agric. 92, 2664e2667. http://dx.doi.org/10.1002/jsfa.5685.
Jansson, D., Fredriksson, S.A., Herrmann, A., Nilsson, C., 2012. A concept study
on identification and attribution profiling of chemical threat agents using
liquid chromatography-mass spectrometry applied to Amanita toxins in food.
Forensic Sci. Int. 221, 44e49.
http://dx.doi.org/10.1016/j.forsciint.2012.03.023.
Jiang, D.H., Chen, Z.H., Wang, M.D., Zhang, N., Wang, Y.Y., Hu, M.H., 2016.
Case report of DPMAS combined with plasma exchange and CVVH
treatment in patients caused by Amanita rimosa poisoning. Chin. J. Emerg.
Med. 25, 743e745. http:// dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.1671-
0282.2016.06.012.
Karlson-Stiber, C., Persson, H., 2003. Cytotoxic fungidan overview. Toxicon 42,
339e349. http://dx.doi.org/10.1016/S0041-0101(03)00238-1.
Kaya, E., Yilmaz, I., Sinirlioglu, Z.A., Karahan, S., Bayram, R., Yaykasli, K.O.,
Colakoglu, S., Saritas, A., Severoglu, Z., 2013. Amanitin and phallotoxin
con-centration in Amanita phalloides var. alba mushroom. Toxicon 76,
225e233. http://dx.doi.org/10.1016/j.toxicon.2013.10.008.
Li, H.J., Xie, J.W., Zhang, S., Zhou, Y.J., Ma, P.B., Zhou, J., Sun, C.Y., 2015.
Amanita subpallidorosea, a new lethal fungus from China. Mycol. Prog. 14,
43. http:// dx.doi.org/10.1007/s11557-015-1055-x.
Li, P., Deng, W.Q., Li, T.H., 2014. The molecular diversity of toxin gene families
in lethal Amanita mushrooms. Toxicon 83, 59e68. http://dx.doi.org/10.1016/
j.toxicon.2014.02.020.
Pulman, J.A., Childs, K.L., Sgambelluri, R.M., Walton, J.D., 2016. Expansion and
diversification of the MSDIN family of cyclic peptide genes in the poisonous
agarics Amanita phalloides and A. bisporigera. BMC Genomics 17, 1038. ht
tp:// dx.doi.org/10.1186/s12864-016-3378-7.
Ronquist, F., Huelsenbeck, J.P., 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic
inference under mixed models. Bioinformatics 19, 1572e1574.
http://dx.doi.org/10.1093/ bioinformatics/btg180.
Sgambelluri, R.M., Epis, S., Sassera, D., Luo, H., Angelos, E.R., Walton, J.D.,
2014. Profiling of amatoxins and phallotoxins in the genus Lepiota by liquid
Chro-matography combined with UV absorbance and mass spectrometry.
Toxins (Basel) 6, 2336e2347. http://dx.doi.org/10.3390/toxins6082336.
Stamatakis, A., 2006. RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic
analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics 22,
2688e2690. http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btl446.
Tang, S.S., Zhou, Q., He, Z.M., Luo, T., Zhang, P., Cai, Q., Yang, Z.L., Chen, J.,
Chen, Z.H., 2016. Cyclopeptide toxins of lethal amanitas: compositions,
distribution and phylogenetic implication. Toxicon 120, 78e88.
http://dx.doi.org/10.1016/ j.toxicon.2016.07.018.
Wieland, T., 1986. Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms. Springer, New
York, pp. 1e257.
Yang, Z.L., Li, T.H., 2001. Notes on white amanita of section Phalloideae
(Amanita-ceae) from China. Mycotaxon 78, 439e448.
Zhang, P., Chen, Z.H., Xiao, B., Tolgor, B., Bao, H.Y., Yang, Z.L., 2010. Lethal
amanitas of East Asia characterized by morphological and molecular data.
Fungal Divers 42, 119e133. http://dx.doi.org/10.1007/s13225-010-0018-4.