A.

Uji aktivitas penghambatan α-amilase dan α-glukosidase

a. Pengujian aktivitas senyawa uji secara in vitro
i. Uji penghambatan enzim α-amilase
Uji penghambatan enzim α-amilase dilakukan pada tiap-tiap isolat flavonoid herba
sambiloto yang telah diisolasi dan diidentifikasi. Prinsip kerja penghambatan enzim α-
amilase adalah enzim tersebut dapat mengurai pati menjadi maltosa. Maltosa dapat
bereaksi dengan DNS. Hasil reaksi kemudian dapat diukur dengan spektrofotometri
pada panjang gelombang 540 nm.
25 μL larutan isolat flavonoid dimasukkan kedalam mikroplate kemudian
ditambahkan 25 μL larutan α-amilase 0,5 mg/mL dalam buffer fosfat dan diinkubasi
pada suhu 25⁰C selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan larutan pati 0,5% dan
diinkubasi kembali pada suhu 25⁰C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 50 μL larutan DNS kemudian mikroplate diinkubasi dalam air mendidih
selama 5 menit. Jika larutan sudah dalam suhu kamar, pembacaan absorbansi dengan
spektrofotometri dilakukan pada panjang gelombang 540 nm (Apostolidis, 2007).
Komposisi dan volume larutan yang diberikan pada blanko, kontrol negatif, kontrol
positif dan sampel uji isolat flavonoid dapat dilihat pada tabel 1.
No Komposisi Acarbose Isolat 1 Isolat 2 Buffer fosfat Α-amilase pati DNS
1 Blanko
2 Kontrol negatif
3 Kontrol positif (acarbose)
2000
4 Kontrol positif (acarbose)
1000
5 Kontrol positif (acarbose) 500
6 Kontrol positif (acarbose) 250
7 Kontrol positif (acarbose) 125
8 Kontrol positif (acarbose)
62,5
9 Fraksi
10 Kontrol negatif fraksi
11 Isolat 1
12 Kontrol negatif isolat 1
13 Isolat 2
14 Kontrol negatif isolat 2

ii. Uji penghambatan enzim α-glukosidase

Uji penghambatan enzim α-glukosidase dilakukan pada tiap-tiap isolat flavonoid.
Prinsip kerja enzim α-glukosidase adalah substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida
diurai oleh enzim α-glukosidase menjadi produk p-nitrofenil yang berwarna kuning dan
glukosa. P-nitrofenil yang dihasilkan diukur absorbansinya sebagai parameter
penghambatankerja enzim α-glukosidase menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 410 nm.
10 μL larutan isolat flavonoid ditambahkan 25 μL larutan α-glukosidase 0,2 UI/mL
dalam 0,1 M buffer fosfat pH 7 dan 25 μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida sebagai
substrat. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 30 menit. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 100 μL larutan natrium karbonat 0,2 M. Larutan
didinginkan dalam suhu ruang dan dibaca absorbansinya (Mayur et. Al., 2010).
Komposisi dan volume larutan yang diberikan pada blanko, kontrol negatif, kontrol
positif dan sampel uji dapat dilihat pada tabel 2.
No Komposisi Acarbose Isolat 1 Isolat 2 Buffer fosfat α-glukosilase p-nitrofenil-α-D- Na2CO3
glukopiranosida
1 Blanko 40 µL - 20 µL 20 µL
2 Kontrol negatif - 60 µL 40 µL 20 µL 20 µL
3 Kontrol positif (acarbose) 2000 60 µL 40 µL 20 µL 20 µL
4 Kontrol positif (acarbose) 1000 60 µL 40 µL 20 µL 20 µL
5 Kontrol positif (acarbose) 500 60 µL 40 µL 20 µL 20 µL
6 Kontrol positif (acarbose) 250 60 µL 40 µL 20 µL 20 µL
7 Kontrol positif (acarbose) 125 60 µL 40 µL 20 µL 20 µL
8 Kontrol positif (acarbose) 62,5 60 µL 40 µL 20 µL 20 µL
Blanko - 60 µL - 20 µL 20 µL
9 Fraksi (dosis 1-6) 40 µL 20 µL 20 µL
10 Kontrol negatif fraksi Dengan Tanpa enzim 20 µL 20 µL
11 Isolat 1 (dosis 1-6) 40 µL 20 µL 20 µL
12 Kontrol negatif isolat 1 Dengan Tanpa enzim 20 µL 20 µL
13 Isolat 2 (dosis 1-6) 40 µL 20 µL 20 µL
14 Kontrol negatif iIsolat 2 Dengan Tanpa enzim 20 µL 20 µL

Warna