Tugas Perkuliahan Teknik dan Aplikasi Bioteknologi (K!

714)

Pertemuan 7: Protein

Materi:

1. Berbagai fungsi protein

2. Tingkatan struktur protein
3. Teknik isolasi, pemurnian, dan karakterisasi protein

Pertanyaan:

1. Jelaskan fungsi protein sebagai sumber energi bagi makhluk hidup dengan menyertakan
contoh produksi energi yang dihasilkan dari protein ketika seseorang mengkonsumsi
makanan kaya akan protein!

Pembahasan:

Energi adalah komponen utama yang dibutuhkan agar manusia dapat terus bergerak dan
beraktivitas menjalankan kewajibannya sehari-hari. Seperti karbohidrat dan lemak, salah satu
fungsi protein yang utama adalah sebagai sumber energi. Melalui reaksi katabolisme, protein
dipecah menjadi asam amino. Asam amino ini bisa digunakan sebagai sumber energi ketika
tubuh membutuhkannya. Energi yang dihasilkan dari proses katabolisme tersebut disimpan
sebagai molekul adenosine triphospate (ATP) yang dapat berperan sebagai sumber energi
dan bahan bakar dalam proses metabolisme.

Di dalam tubuh, protein akan dioksidasi di dalam sel dengan bantuan enzim, ko-enzim
(misalnya vitamin), dan hormon. Prosesnya memerlukan oksigen dan hasil yang diperoleh
berupaa karbodioksida,air, dan energi (ATP dan panas).

Protein O→2 CO2 + H2O + Energi (ATP + Panas)

Dalam hal kelebihan asupan, protein mirip dengan karbohidrat. Jika anda
mengonsumsi lebih banayak protein daripada yang dibutuhkan tubuh untuk perawatan
jaringan dan fungsi penting lainnya, maka tubuh akan mengalihkan kelebihan protein itu
dalam bentuk lemak dan akan menjadi sumber energi cadangan untuk tubuh.

https://www.brilio.net/kesehatan/9-fungsi-protein-bagi-tubuh-dan-cara-mudah-
mendapatkannya-1911210.html
https://rubiyat.co.id/2017/11/21/5-fungsi-utama-protein-dalam-tubuh/

https://blog.ruangguru.com/pengertian-sifat-dan-fungsi-protein

https://www.honestdocs.id/fungsi-protein-bagi-tubuh

2. Jelaskan contoh fungsi protein sebagai pembangun struktur,biokatalis, dan hormon!

Pembahasan:

Protein Struktural

Berfungsi untuk mempertahankan struktur dan membangun konstruksi tubuh dari tingkat sel.
Misalnya protein kolagen yang menjadi komponen utama tendon, tulang rawan, dan kulit.
Protein keratin juga berfungsi untuk membentuk struktur kulit, kuku, rambut, dan gigi.
Elastin, fibrin

Protein Hormon

Hormon protein bertugas mengatur tindakan dan fungsi hormon dalam tubuh. Hormon adalah
sekresi yang berperan sebagai pembawa pesan kimia dalam tubuh melalui darah. Setiap
hormon memengaruhi tiap satu sel tertentu untuk mengkoordinasikan proses metabolisme
dalam tubuh. Misalnya organ pankreas yang menghasilkan hormon insulin untuk mengatur
kadar gula dalam darah.

oksitosin adalah hormon yang merangsang kontraksi selama persalinan

Protein Enzim

Golongan protein ini berperan pada biokatalisator dan pada umumnya mempunyai bentuk
globular. Protein enzim ini mempunyai sifat yang khas, karena hanya bekerja pada substrat
tertentu. Yang termasuk golongan ini antara lain: (1) Peroksidase yang mengkatalase
peruraian hidrogen peroksida. (2) Pepsin yang mengkatalisa pemutusan ikatan peptida. (3)
Polinukleotidase yang mengkatalisa hidrolisa polinukleotida.

3. Jelaskan perbedaan struktur protein pada setiap tingkatan strukturnya! Dan berikan
massing-masing 2 contoh protein dari yang terdapat pada makhluk hidup yang mewakili
masing-masing tingkatan protein tersebut!

Pembahasan:
Struktur primer
Struktur primer merupakan struktur yang sederhana dengan urutan-urutan asam amino yang
tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi
percabangan rantai. Struktur Primer terbentuk melalui ikatan-ikatan peptida dari asam amino-
asam amino pembentuk protein itu.

Contoh: Polipeptida strand

Struktur sekunder
Struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam
amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Struktur Sekunder terbentuk
melalui ikatan hidrogen yang terjadi antara gugus-gugus amina dengan atom hidrogen pada
rantai samping asam amino, sampai membentuk lipatan-lipatan

Contoh:

alpha helix (α-helix, “puntiran-alfa”), berupa pilinan rantai asam-asam amino  berbentuk
seperti spiral;

beta-sheet (β-sheet, “lempeng-beta”), berupa lembaran-lembaran lebar yang tersusun   dari

sejumlah rantai asam amino yang saling terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H);

beta-turn, (β-turn, “lekukan-beta”); dan gamma-turn, (γ-turn, “lekukan-gamma”).

 Struktu
r tersier
Struktur tersier protein adalah lipatan secara keseluruhan dari rantai polipeptida sehingga
membentuk struktur 3 dimensi tertentu.

Strujtur Tersier terbentuk melalui Interaksi struktur sekunder yang satu dengan struktur
sekunder yang lain lewat ikatan hidrogen, ikatan ion, atau ikatan disulfida (-S-S-),

contohnya terbentuk rantai dobell-heliks.

Struktur kuartener
Struktur kuarterner adalah gambaran dari pengaturan sub-unit atau
promoter protein dalam ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari
sub-unit protein dengan struktur tersier yang akan membentuk protein
kompleks yang fungsional.
contohnya pada hemoglobin, yang pada proteinnya terselip ion Fe3+.

Rubisco
4. Jelaskan dengan menggunakan diagram (disertai gambar) teknik isolasi protein dari
jaringan hewan, jamur, dan bakteri!

Pembahasan:
 Pada isolasi protein, langkah pertama yang harus dilakuakn adalah membuang bagian
dari sel yang bukan protein, sehingga diperoleh protein murni. Secara umum, sel hewan lebih
mudah dalamisolasinya dibandingkan sel bakteri dan jamur.

5. Jelaskan berbagai macam teknik identifikasi/ karakterisasi protein dan prinsip dasar dari
masing-masing teknik!
Pembahasan:

a. Teknik SDS PAGE

SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah

teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang
bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja.[1] Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan
deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif
pada keseluruhan struktur protein.[1] Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat
interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen.[1] Metode SDS-PAGE digunakan untuk
memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler.[2]
Metode ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel bermuatan sama sehingga muatan
tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam gel. [1] Preparasi dilakukan dengan cara
mendenaturasi protein menggunakan SDS dan memutus ikatan disulfida pada struktur protein
menggunakan beta-merkaptoetanol, bila perlu denaturasi didukung dengan memanaskan sampel.
[1]
Selanjutnya gel poliakrilamida dibuat menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan
ketebalan tertentu.[1] Setelah sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik sehingga
komponen yang terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel berdasarkan berat molekulnya.
[1]

Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarna khusus. Beberapa
pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE adalah Commasie Brilliat Blue dan Silver Salt Staining.
[2]
 Commasie Brilliant Blue mengikat protein secara spesifik dengan ikatan kovalen. Silver Salt
Staining memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun membutuhkan proses yang lebih lama. [2]
2.Teknik blot western

Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke
lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi.

Blot Western adalah sebuah metode untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Imunoblot

menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli atau perubahan oleh jarak polipeptida atau
oleh struktur 3-D protein. Protein tersebut dikirim ke membran, di mana mereka dideteksi
menggunakan antibodi untuk menargetkan protein.
Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang
homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan
dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein
berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian
ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian
akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak
protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut. 

Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran.
Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada
membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada
organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi
sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan
pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara
antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya
akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.

6. Jelaskan teknik dan prinsip dasar kuantifikasi protein

 Pembahasan:

1. Teknik Barford

Metode ini menentukan kadar protein bukan dari ikatan peptidanya namun metode ini mendeteksi suatu
asam amino spesifik yang berada di dalam protein tersebut dan berikatan dengan zat warnanya.

Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk menganalisis kandungan protein di
dalam suatu larutan dengan menggunakan zat warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein.
(Bradford 1976) Zat warna tersebut akan mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang
mengandung protein tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan. Ikatan yang terjadi antara
zat warna Coomassie Blue G-250 dan protein dapat terjadi dikarenakan adanya gaya van der walls
antara keduanya. Gaya van der walls dapat terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat
hidrofobik mengikat bagian dari zat warna Coomassie Blue G-250( penyusun reagen Bradford) yang
bersifat non polar sehingga mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian
hidrofobik protein. Selain itu, antara zat warna dan protein juga terdapat kekuatan ionik yang
memperkuat  ikatan antara keduanya dan membuat zat warna tersebut menjadi stabil. Hal ini lah
yang  digunakan pada metode Bradford untuk menentukan kadar protein di dalam suatu larutan.
Kandungan protein yang berikatan dengan zat warna tersebut dapat diukur dengan menggunakan
instrument spectronic 20 D untuk mengukur nilai absorbansnya pada panjang gelombang kisaran
465-595 nm. Selanjutnya, nilai absorbans tersebut dapat digunakan untuk membuat kurva standar
yang menjadi dasar penentuan konsentrasi dan kadar protein di dalam larutan. (Bradford 1976)

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengukur nilai absorbans larutan yang mengandung protein
berkisar antara 470-650. Hal itu dikarenakan metode Bradford bergantung pada kerja zat
warna Coomassie Blue G-250 yang memiliki empat formasi ion yang berbeda-beda dengan nilai pKa
1,15 ; 1,82 ; dan 12,4. Zat warna yang digunakan pada metode Bradford ini dapat dalam bentuk
anion dan kation.Bentuk kation zat warna ini ialah dye commassie yang berwarna merah dan hijau
dengan nilai absorbansi maksimum berada pada panjang gelombang kisaran 470 nm hingga 650
nm.Bentuk anion zat warna ini ialah commasie yang berwarna biru dengan nilai absorbansi maksimum
berada pada panjang gelombang maksimum 595 nm. Penentuan kadar protein pada suatu larutan
dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anion (commasie blue G-250) yang diukur
dengan panjang gelombang 595 nm.

2. a. Metode Kjeldahl
Penentuan jumlah protein secara empiris yang umum dilakukan adalah dengan menentukan jumlah
nitrogen (N) yang dikandung oleh suatu bahan. Metode tersebut dikembangkan oleh Kjeldahl,
seorang ahli ilmu kimia Denmark pada tahun 1883. Dalam penentuan protein, seharusnya hanya
nitrogen yang berasal dari protein saja yang ditentukan. Akan tetapi hal tersebut sulit dilakukan
karena kandungan senyawa lain memiliki jumlah yang cenderung sedikit. Penentuan jumlah N total ini
dikatakan sebagai representasi jumlah protein yang akan dicari. Kadar protein hasil dari analisis
kadar protein metode Kjeldahl ini dengan demikian sering disebut sebagai kadar protein kasar (crude
protein).
Dasar perhitungan penentuan protein menurut Kjeldahl ini adalah hasil penelitian dan pengamatan
yang menyatakan bahwa umumnya protein alamiah mengandung unsur N rata-rata 16% (dalam
protein murni). Untuk senyawa-senyawa protein tertentu yang telah diketahui kadar unsur N-nya,
maka angka yang lebih tepat dapat dipakai.
Apabila jumlah unsur N dalam bahan telah diketahui (dengan berbagai cara) maka jumlah protein
dapat diperhitungkan dengan:
                              Jumlah N x 100/16 atau
Jumlah N x 6,25
Untuk campuran senyawa-senyawa protein atau yang belum diketahui komposisi unsur-unsur
penyusunnya secara pasti, maka faktor perkalian 6,25 inilah yang dipakai. Sedangkan beberapa jenis
protein telah diketahui faktor perkaliannya.

2. Teknik Lowry
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol)
yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan
warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 – 750 nm, tergantung sensitivitas yang
dibutuhkan.  Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk
menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang
dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah.
3. Teknik Biuret

4.    c. Metode Biuret
5. Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO 4 encer. Uji
ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam (-
CONH2) yang berada bersama gugus amida asam yang lain atau gugus yang lain seperti –
CSNH2; – C(NH)NH2; – CH2NH2; – CRHNH2; – CHOHCH2NH2 – CHOHCH2NH2 –
CHNH2CH2OH; – CHNH2CHOH.
6. Dengan demikian uji biuret tidak hanya untuk protein tetapi zat lain seperti biuret atau
malonamida juga memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah-
violet atau biru-violet.
7. Reaksi yang terjadi dapat dituliskan sebagai berikut:

8.
9. Gambar 8. Reaksi positif adanya protein
10. (Sumber: Sudarmadji, dkk., 2007)
11. Intensitas warna tergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Penentuan protein cara
biuret adalah dengan mengukur OD pada panjang gelombang 560-580 nm. Agar dapat
dihitung banyaknya protein dalam bahan maka perlu lebih dahulu dibuat kurva standar yang
melukiskan hubungan antara konsentrasi protein dengan OD pada panjang gelombang
terpilih. Dibandingkan dengan cara Kjeldahl maka biuret lebih baik karena hanya protein atau
senyawa peptida yang bereaksi dengan biuret, kecuali urea.
12.            d. Metode Spektrofotometer UV
13. Reagen yang digunakan pada metode ini yaitu reagen bradford. Kebanyakan protein
mengabsorbsi sinar ultraviolet maximum pada 280 nm. Hal ini tertutama oleh adanya asam
amino tirosin triptophan dan fenilalanin yang ada pada protein tersebut. Pengukuran protein
berdasarkan absorbsi sinar UV adalah cepat, mudah dan  tidak merusak bahan. Untuk
keperluan perhitungan juga diperlukan kurva standar yang melukiskan hubungan antara
konsentrasi protein dengan OD.
14.           e. Metode Turbudimetri atau Kekeruhan
15. Kekeruhan akan terbentuk dalam larutan yang mengandung protein apabila ditambahkan
bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic Acid (TCA), Kalium Ferri Cianida
K4Fe9(CN)6 atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat turbidimeter. Tabel
atau kurva juga harus dibuat terlebih dahulu untuk menunjukkan hubungan antara kekeruhan
dengan kadar protein (dapat ditentukan dengan cara Kjeldahl). Cara ini hanya dapat dipakai
untuk bahan protein yang berupa larutan dan hasilnya biasanya kurang tepat.
16.          f. Metode Pengecatan
17. Beberapa bahan pewarna misalnya Orange G, Orange 12 dan Amido Black dapat
membentuk senyawaan berwarna dengan protein dan menjadi tidak larut. Dengan mengukur
sisa bahan pewarna yang tidak bereaksi dalam larutan (dengan colorimeter), maka jumlah
protein dapat ditentukan dengan cepat. Tentunya tabel atau kurva standar perlu dibuat
terlebih dahulu untuk keperluan ini.
18.           g. Metode Titrasi Formol
19. Larutan dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan formalin akan membentuk
dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak
akan mempengaruhi reaksi antara asam (gugus karboksi) dengan basa NaOH sehingga akhir
titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah PP, akhir titrasi bila tepat
terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik. Titrasi formol
ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang
tepat untuk penetuan protein.
20. Reaksi titrasi formol adalah sebagai berikut:

21.
22. Gambar 9. Reaksi Titrasi Formol
23. (Sumber: Sudarmadji, dkk., 2007)
24.  
25.
7. Lakukan analisis terhadap satu jurnal internasional trend riset protein (Jurnal Q2
maksimal 5 tahun terakhir) dan jelaskan denagn diagram teknik isolasi protein yang
dilakuakn oleh penulis/peneliti tersebut!
8.