TUGAS BIOMOLEKULER

ERENA HAJAR KARTIKA

1982311001

PENDEKATAN BARU UNTUK EDITING COMBINING GENOM ESCHERICHIA

COLI KLONING IN VIVO DAN PENYISIPAN KROMOSOM TARGET PANJANG
YANG DITARGETKAN

ABSTRAK

Meskipun terdapat banyak pendekatan manipulasi genetik, terutama untuk Escherichia

coli, teknik baru dan peningkatan fleksibilitas dalam penerapan teknik yang ada diperlukan untuk
mencapai tujuan baru. Pendekatan yang paling banyak digunakan untuk pengeditan kromosom
didasarkan pada rekombinasi homolog yang spesifik dengan bakteriofage dan mediatedRed /
RecET. Dalam penelitian ini, teknik-teknik ini dikombinasikan untuk mengembangkan
pendekatan baru untuk kloning in vivo dan menargetkan penyisipan kromosom jangka panjang.
Pendekatan ini memungkinkan kloning DNA fragmen DNA yang dimediasi langsung dengan
panjang 10 kb atau lebih besar dari kromosom E. coli ke dalam vektor plasmid pGL2, yang
membawa ori pSC101, situs ϕ80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda
dikurung oleh situs λ-attL / attR. Dalam plasmid rekombinan berbasis pGL2, asal replikasi dapat
dihilangkan secara in vitro melalui hidrolisis oleh SceI endonuklease dan resirkularisasi oleh
DNA ligase. DNA rekombinan ori-kurang sirkuler yang dihasilkan dapat digunakan untuk
penyisipan yang ditargetkan dari urutan kloning ke dalam kromosom di lokasi yang dipilih
melalui ϕ80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda80 rekombinasi yang dimediasi integrase-fag spesifik menggunakan pendekatan Dual-
In / Out (Minaeva et al., 2008) . Pada tahap akhir pengeditan kromosom, penanda CmR dapat
dikeluarkan dari kromosom karena ekspresi gen λint / xis. Khususnya, fragmen yang diinginkan
dapat dimasukkan sebagai beberapa salinan dalam kromosom dengan menggabungkan insersi di
situs yang berbeda dalam satu strain menggunakan teknik transduksi umum P1 (Moore, 2011).
Pendekatan yang dikembangkan berguna untuk pembangunan strain rekombinan tanpa plasmid,
tanpa penanda untuk tujuan fundamental dan industri.
Pendahuluan
Sejumlah pendekatan rekayasa genom skala kromosom,termasuk perakitan kembali seluruh
genom atau bagian penting mereka, telah dikembangkan. Kemajuan luar biasa baru-baru ini
dalam strategi pengeditan genom yang berlaku untuk tujuan penelitian dan tugas bioteknologi
industri di E. coli telah dirangkum dalam sejumlah ulasan (Bradley et al., 2015; Ceroni et al.,
2015; Kelwick et al., 2014 ). E. coli adalah salah satu mikroorganisme yang paling banyak
dipelajari, dan keragaman tugas-tugas rekayasa metabolik mengharuskan penciptaan alat genetik
yang berlipat ganda. Pengetahuan tentang fungsi struktur biologis alami telah memberikan dasar
untuk rekayasa genom melalui biologi sintetis untuk membangun perangkat sintetis non-alami
(Zucca et al., 2013), organel buatan (Choi dan Montemagno, 2005), dan lokasi sistem enzim di
jalur yang sama pada perancah struktural tunggal (Dueber et al., 2009; Fu et al., 2014), di antara
aplikasi lain. Oleh karena itu, kemampuan untuk mengkloning fragmen kromosom besar secara
tepat dan memasukkannya langsung ke lokus spesifik dalam banyak salinan adalah kebutuhan
berulang. Untuk mencapai tujuan ini, berbagai teknik telah dikembangkan, seperti yang diulas,
(Karas et al., 2015; Madyagol et al., 2011).
Dalam karya ini, kami mengusulkan pendekatan untuk kloning in vivo diikuti oleh
penyisipan tepat yang ditargetkan dari beberapa salinan fragmen long-length DNA dalam
kromosom E. coli. Teknik ini akan memfasilitasi konstruksi regangan rekombinan tanpa plasmid,
tanpa penanda untuk tujuan fundamental dan industri.
Metode kuat yang digunakan secara luas untuk modifikasi genom E. coli adalah rekayasa
melalui rekombinasi atau rekombinasi edRed / RecET (Datsenko dan Wanner, 2000; Murphy,
1998; Swingle et al., 2010; Yu et al., 2000; Zhang et al. , 1998). Dalam pendekatan ini, sebuah
fragmen DNA linier diapit oleh urutan homolog ke wilayah yang diminati dalam kromosom E.
coli dimasukkan ke wilayah ini dengan mengeksploitasi aktivitas tiga protein (Exo, Taruhan dan
Gam) dari sistem rekombinasi merah fag age atau aktivitas dua protein (RecE dan RecT) dari
profage Rac cryptic pada strain sbcA E. coli. Fragmen DNA linear untai ganda biasanya
disintesis melalui PCR, dan sekuens homolog mengapit (panjang 30-50 nt) diperkenalkan oleh
primer oligonukleotida yang digunakan. Dalam praktiknya, metode ini cocok untuk integrasi
intrachromosomal λRed-dependen dari fragmen PCR yang agak pendek hingga sekitar 3 kb
panjangnya. Metode ini juga berguna untuk memasukkan beberapa salinan fragmen DNA yang
diinginkan ke dalam kromosom tetapi dibatasi oleh ukuran insersi. Efisiensi dan akurasi
transformasi dan integrasi menurun secara signifikan dengan meningkatnya ukuran fragmen.
Hambatan paling penting dalam memperkenalkan salinan tambahan dari fragmen DNA
yang besar adalah adanya fragmen yang identik dalam kromosom, yang dapat menyebabkan
rekombinasi antara berbagai daerah homolog besar di lokasi yang tidak diinginkan. Untuk
meningkatkan efisiensi pengenalan fragmen panjang, Kuhlman dan Cox (2010) menyarankan
menggunakan protokol dua langkah yang melibatkan penyisipan double-strand break oleh
pembatasan I-SceI di lokasi rekombinasi yang diinginkan dalam kromosom. Metode ini
memungkinkan pengenalan fragmen DNA hingga 7 kb tetapi agak rumit.
Pendekatan yang didasarkan pada rekombinasi spesifik lokasi lebih tepat untuk penyisipan
multipel spesifik DNA yang banyak lokus. Sistem rekombinasi spesifik sites berasal dari
coliphage yang berbeda dan mengeksploitasi rekombinasi antara attP dan situs nativeattB yang
sesuai (Gu et al., 2015; Haldimann dan Wanner, 2001) atau urutan rekombogenik yang
disisipkan secara artifisial (Sabri et al., 2013; Huang et al., 1997). Metode-metode ini melibatkan
penggunaan vektor CRIM khusus (replikasi kondisional, integrasi dan modular) yang berisi situs
attP spesifik untuk integrasi dan fungsi dalam kombinasi dengan plasmid pembantu untuk
ekspresi fag integrase. Replikasi bersyarat dicapai dengan menggunakan vektor yang
membutuhkan protein-trans-acting (dikodekan oleh gen pir) dan memungkinkan replikasi hanya
dalam host pir +. Pendekatan yang kuat yang disebut strategi Dual In / Out dikembangkan
berdasarkan teknik ini dengan menggabungkan rekombinasi spesifik fag dan Red / RecET yang
dimediasi (Minaeva et al., 2008). Strategi Dual In / Out digunakan untuk memperkenalkan
banyak salinan fragmen DNA besar ke lokus kromosom tertentu. Langkah awal adalah pra-
kloning dari fragmen yang diinginkan ke dalam vektor yang berisi situs ϕ80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda80-att untuk integrasi
ϕ80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda80 yang dimediasi, biasanya dengan amplifikasi PCR. Namun, seiring meningkatnya panjang
fragmen, masalah amplifikasi in vitro yang andal dan bebas kesalahan muncul. Kloning segmen
kromosom besar sangat berguna untuk genetik fungsional uji coba karena, dalam kasus ini,
wilayah pengaturan dan seluruh struktur operasi dari insert tetap tidak berubah. Kloning fragmen
besar juga sangat penting untuk keperluan rekayasa metabolisme karena gen / operon yang
menarik dapat dieksploitasi sambil mempertahankan regulasi asli untuk memastikan sintesis
terkoordinasi komponen dalam sistem komposit, mis., Kompleks multi-enzim besar. Terlepas
dari keuntungan teknik PCR baru-baru ini yang menggunakan polimerase termostabil kesetiaan
tinggi dengan prosesivitas yang ditingkatkan (Cho et al., 2014; Elshawadfy et al., 2014),
menghasilkan produk PCR bebas kesalahan yang panjang (lebih dari 10 kb) dalam jumlah yang
cukup tetap sulit. , dan verifikasi urutan pada tahap terakhir dari prosedur kloning diperlukan.
Sebagai pendekatan alternatif, metodologi kloning bebas PCR in vitro yang melibatkan berbagai
teknik pembatasan spesifik telah dikembangkan (Ublinskaya et al., 2012; Yamamoto et al., 2005,
2006). Secara khusus, strategi ini memberikan peluang untuk menghindari kesalahan turunan
PCR dalam penyisipan fragmen DNA yang besar dengan mengapit fragmen DNA kromosom
dengan pengakuan ISceI melalui insersi bertarget yang digerakkan oleh -Red dan kloning
selanjutnya dari fragmen kromosom yang dihasilkan I-SceI yang dihasilkan ke dalam suatu
Vektor kloning linier I-SceI (Ublinskaya et al., 2012). Enzim I-SceI mengenali sekuens unik
dengan panjang 18 bp (Monteilhet et al., 1990) yang tidak ada dalam kromosom E. coli dan
dapat diperkenalkan dengan sengaja untuk mengapit sekuens yang diinginkan. Tekniknya
sederhana tetapi bertingkat dan agak memakan waktu.
Metode kloning in vivo yang kurang melelahkan dan lebih efisien dengan menggabungkan
kembali (ditinjau dalam (Sharan et al., 2009)) tampaknya menjadi pendekatan yang lebih
nyaman untuk fragmen besar. Teknik ini terdiri dari beberapa langkah. Yang pertama adalah
amplifikasi PCR dari vektor plasmid yang mencakup asal replikasi, situs att80-attP dan gen
marker menggunakan primer di mana ujung 5′ berisi lengan pendek homolog dengan DNA target
yang akan dikloning. Pada langkah kedua, produk PCR yang diperoleh, termasuk vektor linier,
ditransformasikan menjadi E. coli yang mengandung daerah genom yang dibutuhkan dan fag λ
yang diekspresikan gen yang mengkode protein yang bertanggung jawab untuk rekombinasi
merah yang bergantung. Rekombinasi antara fragmen linier dan hasil hostDNA dalam
pembentukan plasmid melingkar yang mengandung fragmen kromosom. Klon yang diinginkan
kemudian dipilih oleh gen resistensi antibiotik yang dikodekan plasmid. Keuntungan penting
dari pendekatan yang cepat dan efisien ini adalah independensi situs restriksi, kemungkinan
penggabungan urutan target dengan gen atau situs restriksi yang tepat, dan, tentu saja, kapasitas
kloning besar yang hanya bergantung pada replika plasmid.
Di antara aspek-aspek dasar krusial dari teknik penyisipan kromosom, pertimbangan
penting lainnya adalah pemilihan metode seleksi integrant yang cocok untuk banyak modifikasi.
Sejumlah marker yang dapat dipilih / dipilih-dipilih dapat digunakan (Blomfield et al., 1991;
DeVito, 2008). Alternatifnya adalah penerapan spidol terpilih “excisable” yang memungkinkan
pengenalan onemodifikasi satu demi satu. Eksisi marker dilakukan menggunakan berbagai
sistem insersi-insisi, misalnya, sistem Cre / loxP yang berasal dari fag P1 (Albert et al., 1995;
Hoess et al., 1986; Lambert et al., 2007), FLP / FRT sistem berasal dari S. cerevisiae (Cregg dan
Madden, 1989), atau sistem Int / Xis dari λ phage (Katashkina et al., 2005; Peredelchuk dan
Bennett, 1997). Dalam karya ini, kami memilih sistem λ Int / Xis fage. Penggunaan tipe lampiran
λ fag tipe dewasa memungkinkan eksisi marker berulang yang tidak diinginkan tanpa
rekombinasi karena struktur spesifik dari situs attachment sambil menghindari penyisipan urutan
yang heterolog untuk E. coli.
Dalam karya ini, kami merancang sistem E. coli inang plasmid yang memungkinkan
kloning in vivo langsung dari fragmen DNA kromosom besar fromany E. strain coli oleh λRed-
rekombinasi antara kromosom donor dan plasmid yang dirancang khusus. Plasmid berisi wilayah
salinan pSC101 nomor salinan rendah yang menyediakan sekitar 5 salinan plasmid per sel. Oleh
karena itu, plasmid ini cocok untuk membawa gen dan kelompok gen untuk ekspresi berlebih
yang mungkin beracun bagi sel bakteri. Plasmid menampung situs attachment khusus fag dari
attP dari ϕ80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda80. Integrasi dilakukan setelah I-SceI memediasi eksisi in vitro dari daerah replonon
dari vektor. I-SceI terpecah dalam urutan target 18-bp non-palindromik untuk menghasilkan
overhang 4-bp 3 ((Colleaux et al., 1986, 1988; Monteilhet et al., 1990). Urutan ini sangat langka
dan muncul dalam urutan nukleotida acak dengan frekuensi 1 per 418 (1011) pasangan basa
(Lippow et al., 2009). Paling penting, situs ini tidak ada dalam genom E. coli; oleh karena itu,
urutan yang dikloning tidak akan mengandung situs ini. Untuk mencapai integrasi yang
ditargetkan dari DNA sirkuler ori-less yang dihasilkan, kromosom bakteri penerima berisi situs
pelengkap komplementer (ϕ80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda80-attB) yang merupakan asli atau buatan yang dimasukkan
sebelumnya ke dalam lokus yang diinginkan. Dengan demikian, fragmen DNA yang dikloning
dapat secara selektif diintegrasikan ke dalam kromosom melalui partisipasi ase80 integrase
spesifik fag (ϕ80-attP dari ph80 phage, dan CmR yang dapat dimaafkan. penanda80-Int). Gen resistansi kloramfenikol yang diapit oleh situs rekombinasi λ-attL dan
λ-attR dari fag λ digunakan sebagai penanda pilihan “excisable”. Fase λ Int / Xis dimediasi gen
themarker memungkinkan prosedur integrasi diulang, meninggalkan urutan bekas luka pendek
(31 nt) di setiap salinan yang dimasukkan. Dengan demikian, teknik pengeditan genom yang
paling penting digabungkan menjadi satu alat. Metode yang dikembangkan memungkinkan
kloning in vivo dari fragmen DNA panjang yang diinginkan dari kromosom E. coli dan
penyisipan berikutnya yang berulang dari fragmen ini ke dalam wilayah genom yang dipilih.
Pendekatan serupa dapat digunakan juga untuk spesies lain di mana teknik rekombinasi λRed
tersedia (organisme tersebut ditinjau, misalnya, dalam Murphy, 2016) setelah optimalisasi teknik
integrasi untuk organisme yang diinginkan. Kegunaan teknik ini dikonfirmasi oleh kloning dan
target integrasi kromosom dari fragmen DNA 10-kb yang menyimpan operon atpIBEFHAGDC
dari E. coli.
Materi Dan Metode
Strain, plasmid dan kondisi pertumbuhan
Semua strain bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 1.
Media berikut digunakan untuk membiakan bakteri: lysogeny broth (LB) (Bertani, 1951); Super
Optimal Broth (SOB); dan kaldu Super Optimal dengan represi katabolit (SOC) (Sambrook dan
Russell, 2001). Ampisilin (P, 100 mg / L) dan kloramfenikol (Cm, 40 mg / L)
digunakan untuk seleksi yang diperlukan.

Budidaya batch dilakukan dalam fermentor desk-top MDL menggunakan glass vessel 1-L
dengan volume kerja 0,4 L (B.E. Marubishi, Jepang). Media mengandung 30 g / L glukosa, 5 g /
L (NH4) 2SO4, 3 g / L KH2PO4, 20 mg / L FeSO4 ∗ 7H2O, 20 mg / L MnSO4 ∗ 5H2O, 0,4
mg / L thiamine-HCl, 0,4 g / LMgSO4 * 7H2O dan 0,4 g / L kedelai hidrolisat. Sel-sel
dibudidayakan secara aerobik pada suhu 37 ° C, dan pH medium dipertahankan pada 6,6 dengan
menambahkan pakan amonia-glukosa yang diinkamiasi. Untuk kultur benih, galur E. coli
dibudidayakan semalam pada suhu 37 ° C pada pelat LB yang terdiri dari 1% Bacto tryptone,
0,5% ekstrak ragi Bacto, 1% NaCl, dan 1,5% agar. Sel-sel kemudian diinokulasi ke dalam 40 mL
medium LB, pH 7,0, dalam labu (750 mL) dan diolah selama 4,5 jam pada suhu 37 ° C dengan
putaran putar pada 140 rpm.

Prosedur penanganan DNA

Protokol standar digunakan dalam penelitian ini untuk manipulasi genetik E. coli dan isolasi dan
manipulasi asam nukleat (Sambrook dan Russell, 2001). Enzim restriksi, ligase DNA T4, Taq-
polimerase, dan tangga DNA 1-kb dibeli dari Thermo Scientific Inc. Semua reaksi dilakukan
sesuai dengan instruksi pabrik. Primer dibeli dari "Syntol" (Rusia). Semua primer yang
digunakan dalam pekerjaan ini tercantum pada Tabel 2. Plasmid dan DNA genom diisolasi
menggunakan QIAGEN Plasmid Mini Kits (QIAGEN GmbH, Jerman) dan Bacterial Genomic
DNA Kits (Sigma), masing-masing. Kit Ekstraksi Gel QIAquick (QIAGEN GmbH, Jerman)
digunakan untuk mengisolasi DNA dari agarosa gel.

Konstruksi plasmid
Konstruksi plasmid pMW118-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolλattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolattL-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolcat-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolmod-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolλattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolattR menyimpan penanda kloramfenikol
“excisable”
Plasmid pMW118-λattL-cat-mod-λattR diperoleh sebagai berikut:
Bagian yang mengandung gen kucing dikeluarkan dari pMW118- (λattL-CmR-λattR) oleh
pencernaan EcoRI dan ligasi selanjutnya dari plasmid CmS. Sebuah fragmen DNA yang berisi
versi pendek dari unit ekspresi gen kucing adalah PCR diamplifikasi dari pMW118- (λattL-
CmR-λattR) menggunakan plasmid dengan primer 1 dan 2 (Tabel 2), yang berisi situs restriksi
EcoRI di ujung 5 ′ mereka. Kemudian, produk PCR dan plasmid pMW118-CmS dicerna dengan
EcoRI dan diikat. Kloning dilakukan dalam regangan XL1 Blue, dan klon APR CmR
menyimpan pMW118-λattL-cat-mod-λattR dipilih. Plasmid ini berisi kaset “excisable” λattL-
cat-mod-λattR, di mana bagian struktural gen kucing dari plasmid pBR325 (Bolivar, 1978)
diekspresikan di bawah kontrol transkripsi dari promotor fag T7, PA2, T7, satu salinan yang
memberikan perlawanan terhadap Cm. Kaset ini lebih pendek dari λattL-CmR-λattR di
pMW118- (λattL-CmR- λattR) karena penghapusan sekitar 380 bp sesuai dengan fragmen DNA
EcoRI-BamHI dari pBR322 (Bolivar et al., 1977), konsisten dengan tujuan kami merancang
vektor integratif dengan tulang punggung pendek.
Konstruksi vektor pGL2 yang mengandung attP site attachment spesifik fage dari gen φ80
dan kaset λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolattL-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolcat-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolmod-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolλattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolattR
Untuk kloning, tiga fragmen DNA diperoleh. Replika nomor salinan pSC101 yang rendah
(Nomor Akses GenBank K00042.1) adalah PCR yang diamplifikasi dari pMW118-λattL-CmR-
λattR menggunakan primer 3 dan 4, yang masing-masing berisi situs pembatasan BglII dan NotI.
Fragmen DNA yang mengandung penanda resistensi antibiotik λattL-cat-mod-λattR adalah PCR
yang diamplifikasi dari pMW118-λattL-cat-mod-λattR menggunakan primer 5 dan 6. Primer 4
dan 6 juga mengandung situs restriksi I-SceI untuk mendapatkan I-SceI replika excisable situs
diapit. Situs lampiran attP spesifik ph80 fag adalah PCR diamplifikasi dari pAH162-λattL-
tetAtetR- λattR-2Ter-I-SceI (Ublinskaya et al., 2012) menggunakan primer 7 dan 8. Dua
fragmen terakhir digabungkan dengan tumpang tindih menggunakan PCR menggunakan primer
6 dan 7, yang masing-masing mengandung situs pembatasan NotI dan BglII. Produk PCR
dimurnikan secara gel, dicerna dengan NotI dan BglII dan diikat dengan fragmen yang berisi
replika, yang juga dicerna dengan cara yang sama. Kloning dilakukan dalam regangan XL1 Blue,
dan klon CmR yang menyimpan pGL2 dipilih.
Prosedur cloning
E. coli K-12 MG1655 ditransformasi dengan red helper plasmid pKD46 (April, repA101ts)
untuk kloning in vivo. Prosedur ini dilakukan seperti yang dijelaskan dalam (Datsenko dan
Wanner, 2000). Vektor integratif pGL2 (CmR, repA) digunakan sebagai templat untuk
memperkuat vektor dengan daerah yang homolog dengan sekuensing sisi-atpIBEFHAGDC
menggunakan primer 9 dan 10. Kemudian, 200 ng produk PCR digunakan untuk transformasi
elektron menggunakan MicroPulser Electroporator ( Bio-Rad, AS) dalam kuvet selebar 0,2 cm
sesuai dengan instruksi pabrik. Hari berikutnya, rekombinan yang dipilih sebagai CmR pada 37 °
C dianalisis oleh PCR menggunakan primer 11 dan 12; 50% dari rekombinan menghasilkan
fragmen PCR yang sesuai. Eliminasi plasmid pembantu Merah dilakukan dengan
mempertahankan sel-sel dalam medium nonselektif (Apfree) pada suhu nonpermisif (42 ° C).
Koloni yang dihasilkan dievaluasi untuk sensitivitas ampisilin, dan plasmid pGL2-atp kemudian
dimurnikan dan dianalisis dengan PCR lagi.
Prosedur integrasi
Sebelum integrasi, eksisi in vitro dari plasmid pGL2-atp dilakukan dengan menggunakan
endonuklease S. cerevisiae I-SceI. Setelah pencernaan dan self-ligasi, fragmen DNA sirkuler
bebas ori dihasilkan elektrotransformasi menjadi strain resipien yang mengandung situs buatan
kromosom att80-attB dan helper plasmid pAH123 yang menyimpan gen φ80-integrase-encoding.
Integant dipilih dari antara transforman CmR oleh PCR dengan primer spesifik lokus. Untuk
prosedur restriksi-ligasi-integrasi, sekitar 100 ng plasmid pGL2-atp digunakan pada awalnya
untuk menghasilkan sekitar 200 klon positif yang membawa insersi atp operon yang ditandai
dengan gen kucing di lokus yang mengandung att80-attB.
Untuk mendapatkan strain tanpa penanda, kucing gen marker dikeluarkan dari strain yang
dimiliki kaset ppdD :: cat-atp oleh λInt / Xis - rekombinasi khusus situs menggunakan helper
plasmid pMWts-λInt / Xis sesuai dengan protokol standar (Peredelchuk dan Bennett, 1997) ).
Transfer lebih lanjut dari aroG :: cat-atp construct ke strain CmS dilakukan oleh transduksi P1
seperti yang dijelaskan sebelumnya (Moore, 2011).

Hasil
Skema umum kloning dan integrasi fragmen DNA kromosom
Sebagai plasmid pengiriman untuk memasukkan fragmen bunga dalam E. coli kromosom, kami
membuat vektor integratif-jumlah salinan yang rendah pGL2. Skema vektor disajikan pada
Gambar. 1, dan detailnya konstruksi dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Vektor ini memiliki
asal replikasi pSC101 nomor salinan rendah, situs φ80-attP, dan gen kucing yang dapat dieksisi λ
sebagai penanda selektif. Wilayah yang bertanggung jawab untuk replikasi diapit oleh situs
pembatasan yang diakui oleh homing endonuclease I-SceI. Asal replikasi ini bersifat universal;
dengan demikian, plasmid dapat dipertahankan pada semua inang E. coli. Eksisi dari titik asal
replikasi oleh aktivitas I-SceI diikuti oleh ligasi diri mengubah pGL2 menjadi fragmen DNA
rekombinan sirkuler; dengan demikian, resistensi kloramfenikol dari transforman diamati pada
hanya integrasi intr80-dimediasi intrachromosomal dari fragmen DNA ini termasuk fragmen
yang diinginkan dan gen penanda yang dapat dipilih, fitur signifikan dari vektor pGL2 sebagai
komponen penting dari alat yang baru dikembangkan ini. Jika yang disebut vektor CRIM
digunakan untuk tujuan yang sama, alih-alih vektor pGL2, kloning in vivo dari fragmen bunga
hanya dapat dilakukan pada strain E. coli khusus yang mengekspresikan protein-trans-aksi yang
dikodekan oleh gen pir . Turunan pGL2 in vitro ori-kurang melingkar yang mengandung pGL2
mengandung situs att80-att yang memungkinkan penggunaan plasmid pembantu khusus yang
mengekspresikan gen φ80-integrase untuk penyisipan fragmen DNA yang ditandai ke dalam
lokasi φ80-attB buatan yang dipilih dan persiapan. pengenalan ke dalam kromosom E. coli
sebagai platform integrasi (lokus target spesifik), seperti yang dijelaskan sebelumnya (Minaeva
et al., 2008).
Gen penanda diapit oleh situs rekombinasi attL dan attR dari fag λ. Dengan demikian, protein λ
fag khusus (Int dan Xis) berfungsi secara serempak dengan seperangkat protein inang, termasuk
IHF dan FIS (untuk ref. Lihat (Numrych et al., 1990) dan dapat mengeluarkan marker dari strain
yang dihasilkan. kromosom untuk memperkenalkan modifikasi lebih lanjut. Skema yang
diusulkan dari kloning dan integrasi fragmen DNA kromosom disajikan pada Gambar. 2.
Langkah pertama, yaitu mengkloning wilayah favorit Anda (YFR), dilakukan melalui
rekombinasi edRed antara kromosom dan linear. Produk PCR yang berisi seluruh rangkaian
pGL2 diapit oleh dua lengan 36-bp dengan homologi ke YFR. Plasmid rekombinan yang
dihasilkan, pGL2-YFR (Gambar 2B), dipotong oleh I-SceI yang dimediasi oleh eksisi in vitro
dari replika, dan self-ligation diikuti oleh penyisipan spesifik dari DNA sirkular yang diperoleh
ke dalam situs kromosom φ80-att yang sesuai dengan keberadaan integr80 integrase fag yang
diekspresikan (Haldimann dan Wanner, 2001; Minaeva et al., 2008), seperti ditunjukkan pada
Gambar. 2C. Akhirnya, th Penanda CmR dikeluarkan dari kromosom bakteri, jika perlu,
menggunakan plasmid penolong khusus pMWts-λInt / Xis yang mengekspresikan gen intint /
xis, diikuti dengan menyembuhkan plasmid penolong replikatif bersyarat pada suhu
nonpermissive (Minaeva et al., 2008 ).
Bukti-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolprinsip: mengkloning operon ATP synthase-λattL-cat-mod-λattR menyimpan penanda kloramfenikolencoding ke vektor pGL2
Untuk mengkonfirmasi pengaruh ekspresi atp operon pada sel pertumbuhan, operon ATP
dikloning di rendah dibangun khusus copy-number integrative vector pGL2 (Gbr. 1). Kami
memperoleh 4 klon yang mengandung plasmid pGL2-atp yang menyimpan gen atpIBEFHAGDC
dengan wilayah pengaturan asli (Gambar 3). Untuk memverifikasi fungsionalitas operon yang
dikloning, plasmid pGL2-atp yang dihasilkan dimasukkan ke dalam strain yang kekurangan ATP
synthase MG1655 RatpI-A. Kemampuan pGL2-atp untuk melengkapi defisiensi ATP synthase
dikonfirmasi oleh pemulihan pertumbuhan sel dari suatu strain yang kekurangan bagian dari atp
operon (Gambar 4).
Integrasi operon ATP ke lokus yang diinginkan
Setelah isolasi dari strain MG1655 / pGL2-atp, rekombinan plasmid pGL2-atp yang membawa
situs φ80-attP dapat digunakan untuk integrasi ke dalam situs φ80-attB yang dihasilkan secara
buatan dalam genom E. coli di hadapan in80-Int yang diekspresikan (Haldimann dan Wanner,
2001; Minaeva et al. , 2008). Sebelum integrasi, prosedur ori-eksisi dilakukan oleh S. cerevisiae
I-SceI endonuclease. Setelah prosedur pencernaan dan self-ligasi, fragmen DNA melingkar yang
dihasilkan dari pGL2-atp tanpa ori digunakan untuk integrasi ke dalam situs att80-attB yang
diinginkan. Di sini, gen aroG dipilih sebagai lokus integrasi, dan sebuah situs untuk insersi
kromosom φ80-Int-mediated dirancang di lokus ini. Strain tanpa penanda MG1655-R (φ80-attB)
(baik disediakan oleh Dr. N. Minaeva) digunakan sebagai penerima untuk penyisipan φ80-attB
buatan. pMWattphi digunakan sebagai templat untuk amplifikasi PCR fragmen φ80-attB :: KmR
dengan wilayah homolog diintegrasikan ke dalam kromosom MR1655-R (φ80-attB) di lokus
yang diinginkan dengan λRed-rekombinasi. Modifikasi lokus DNA diverifikasi oleh PCR dan
diikuti oleh eksisi marker dari kromosom yang dimediasi λ-Int / Xis. Strain tanpa tanda yang
dihasilkanMG1655 R (φ80- attB) RaroG :: φ80-attB berisi φ80 attachment B untuk φ80-inserted
intermediate kromosom di lokus aroG.
Plasmid helper pAH123 yang menyimpan gen φ80-integrase ditransformasikan menjadi
MG1655 R (φ80-attB) RaroG :: φ80-attB, dan strain yang dihasilkan digunakan sebagai
penerima untuk transformasi oleh fragmen DNA melingkar λattL-cat-λattR-φ80 -attP-atp
menggunakan CmR sebagai penanda selektif. Kami memperoleh sekitar 200 klon positif setelah
integrasi yang dimediasi φ80 menggunakan sekitar 100 ng plasmid pGL2-atp untuk prosedur
pembatasan-ligasi. Keakuratan penyisipan diverifikasi oleh PCR. Semua 8 klon yang diuji
mengandung operon ATP dimasukkan di situs yang dimaksud. Skema penyisipan ke dalam
kromosom disajikan pada Gambar. 5. Transformasi kontrol dari fragmen DNA sirkuler yang
disebutkan di atas ke dalam strain tanpa bantuan plasmid pAH123 mengungkapkan bahwa
frekuensi penyisipan dengan rekombinasi independen adalah setidaknya satu urutan besarnya
lebih rendah dari φ80. Integrasi -Int-mediated. Strain yang dihasilkan, MG1655R (φ80-attB)
RaroG :: λattL-cat-λattR-atp, berisi dua salinan co-oriented dari atp operon, satu di lokus asli dan
satu di lokus aroG; jarak antara salinan ini sekitar 33 sentisom dari peta genetik E. coli. Wilayah
antara dua operon ATP ini mengandung sejumlah gen esensial. Akibatnya, rekombinasi homolog
yang mengarah pada penghapusan daerah ini akan menyebabkan sel tidak dapat diselamatkan,
dan dengan demikian konfigurasi kromosom menjadi stabil. Selain itu, kami melakukan 27
percobaan serupa dengan memperkenalkan salinan tambahan dari berbagai gen dan operon
hingga 13 kbp melalui integrasi pGL2, dan salinan yang dimasukkan mempertahankan lokasi
yang tepat selama budidaya pelat yang dikonfirmasi oleh verifikasi PCR dengan primer
oligonukleotida mengapit insersi. Dalam semua kasus, orientasi salinan dan kebutuhan untuk
membaginya dengan daerah kromosom yang menyimpan gen rumah tangga dipertimbangkan.
Namun demikian, ketidakstabilan genom tergantung-RecA yang diprakarsai oleh multiplikasi
daerah kromosom yang luas tidak dapat dikesampingkan dan harus menjadi subjek penyelidikan
lebih lanjut. Oleh karena itu, kloning dan integrasi ATP menunjukkan manfaat dari pendekatan
yang dikembangkan untuk penyisipan yang ditargetkan dari fragmen DNA spesifik panjang ke
lokus yang diinginkan tanpa pra-amplifikasi oleh PCR. Setelah integrasi dari salinan tambahan
dari atp operon ke dalam aroG locus dari MG1655, efek pada pertumbuhan sel tikus dievaluasi
dengan fermentasi fed-batch. Kultivasi dilakukan dalam kondisi aerasi yang berbeda. Di bawah
pasokan oksigen rendah (kecepatan agitasi 700 rpm), salinan tambahan dari operon atp tidak
memiliki efek positif (Tabel 3, Gambar. 6). Sebaliknya, amplifikasi operasi atp meningkatkan
pertumbuhan MG1655 di bawah pasokan oksigen yang tinggi, yang berhubungan dengan
kecepatan agitasi maksimal 1.300 rpm (Tabel 3, Gambar.6).

Integrasi berganda dari dua salinan operasi ATP ke dalam kromosom

E. coli
Untuk mengkonfirmasi kemungkinan beberapa integrasi dari fragmen DNA panjang
menggunakan metode yang dijelaskan dalam kombinasi dengan eksisi marker mediated λInt /
Xis dan transduksi P1, kami membuat strain yang memiliki dua salinan tambahan dari operon
atp, di lokus aroG dan di lokus ppdD. Eksperimen meliputi beberapa langkah: (i) integrasi
operon atp ke lokus ppdD dalam mode yang sama seperti yang dijelaskan di atas untuk integrasi
ke dalam lokus aroG, (ii) eksisi gen kucing dengan rekombinasi λInt / Xis-spesifik, (iii)
pengenalan kaset aroG :: cat-atp ke dalam strain marker-less penerima yang dihasilkan MG1655
ppdD :: atp melalui transduksi fag P1 dengan lisat dari strain donor yang menyimpan kaset
aroG :: cat-atp. Pada setiap langkah, insersi ATP operon diverifikasi oleh analisis PCR. Jadi
kami memperoleh strain dengan tiga salinan atp operon: satu di lokus asli dan dua salinan
tambahan di lokus aroG dan ppdD. Ketiga operon tersebut dikoordinasikan, jarak antara salinan
ini adalah 18,5, 14,5 dan 67 centisoma dari peta genetik E. coli. Daerah antara operon atp ini
mengandung gen esensial, yang, secara teori, tidak termasuk penampilan penghapusan bagian
kromosom di antara salinan yang dimasukkan.
Pembahasan
Dalam studi ini, kami mengembangkan pendekatan baru untuk mengkloning fragmen panjang-
panjang ke dalam vektor dan lebih lanjut menargetkan penyisipan dari salinan kedua fragmen ini
ke dalam kromosom E. coli. Seperti ditunjukkan, amplifikasi fragmen DNA hasil kloning dapat
dilanjutkan secara langsung. Untuk tujuan ini, pada awalnya, titik integrasi lain harus dipilih dan
dibangun berdasarkan strain MG1655 R (φ80-attB). Integrasi berbasis φ80 dari fragmen kloning
kemudian dilakukan sesuai dengan prosedur standar dengan pemilihan CmR-integrants of
interest. Akhirnya, transfer salinan baru dari fragmen bertanda kloning ke strain tanpa penanda
yang sudah membawa dua salinan fragmen target dapat dilakukan oleh transduksi umum
berbasis P1 seperti yang dijelaskan sebelumnya (Minaeva et al., 2008). Aspek unik dari metode
yang disajikan adalah kombinasi beberapa solusi dalam satu alat yang memungkinkan kloning
fragmen DNA panjang yang menarik dan, jika perlu, penyisipan / amplifikasi berikutnya dalam
kromosom. Kloning daerah kromosom besar berguna untuk studi genetik dan fisiologi karena
gen dipertahankan di sekitar asli mereka dan dengan demikian mempertahankan sifat pengaturan
tertentu. Fitur ini sangat penting untuk penyelidikan fungsi seluruh kompleks enzim dan mesin
molekuler di mana subunit harus disintesis secara terkoordinasi dan gen yang sesuai sering
disatukan dalam struktur operon.
Pendekatan kami didasarkan pada kloning fragmen kromosom langsung yang dimediasi oleh
λRed-rekombinasi. Berbeda dengan prosedur standar kloning fragmen yang diamplifikasi PCR,
fragmen bunga tidak dikenakan amplifikasi PCR, sehingga menghindari risiko kesalahan yang
dihasilkan PCR dalam fragmen. Langkah pertama melibatkan memperkuat backbone vektor
dengan primer khusus yang mengandung lengan homolog. Akibatnya, untuk mencapai sintesis
yang tepat efisien dan akurat, tulang punggung tersebut diperkecil menjadi ~ 3 kb. Kami memilih
replika pSC101 angka rendah yang dikurung oleh situs pembatasan I-SceI karena alasan berikut.
Pertama, eliminasi replika in vitro, berbeda dengan replikasi bersyarat yang diterapkan secara
luas untuk tujuan yang sama, memastikan bahwa vektor pGL2 kompatibel dengan host E. coli
yang diinginkan tanpa modifikasi khusus. Kedua, replika dengan jumlah rendah lebih cocok
untuk ekspresi gen (operon) yang mengkode produk-produk yang berpotensi toksik, yang mana
oversintesisnya tidak diinginkan. Secara teoritis, ukuran fragmen kloning yang akibatnya dapat
dimasukkan ke dalam kromosom hanya dibatasi oleh kapasitas kloning vektor yang ditentukan
oleh jenis replika plasmid.

Namun, kemanjuran kloning yang dimediasi λRed tergantung pada sifat individu dari wilayah
yang dikloning dan bervariasi dalam percobaan kami dari beberapa persen hingga beberapa lusin
persen (kemanjuran kloning dihitung sebagai jumlah klon positif yang dikonfirmasi PCR di
antara klon CmR). Fragmen self-ligated in vivo dapat membentuk plasmid yang stabil dengan
gen themarker dan memberikan resistensi antibiotik tanpa rekombinasi yang diinginkan,
sehingga menghasilkan klon positif palsu. Salah satu kemungkinan untuk perbaikan lebih lanjut
dari metode kloning ini adalah pengenalan marker yang dapat dipilih negatif ke dalam plasmid,
sehingga plasmid tanpa insersi yang diinginkan akan menjadi racun dalam kondisi tertentu.
Namun, untuk vektor saat ini, pengalaman kami terdiri dari 27 gen dan operon yang berhasil
dikloning, menunjukkan bahwa metode ini cepat dan tepat untuk menghasilkan plasmid yang
mengandung fragmen kromosom panjang yang menarik.
Menerapkan sistem yang dimediasi integrase φ80 untuk insersi yang ditargetkan memberikan
peluang untuk memperkenalkan fragmen DNA hasil kloning dari pGL2 di setiap lokasi yang
dipilih dalam kromosom. Situs φ80-attB dapat dihasilkan pada titik seperti yang dijelaskan oleh
(Minaeva et al., 2008). Keuntungan dari rekombinasi spesifik situs dibandingkan rekombinasi
homolog adalah kemungkinan memasukkan beberapa salinan selangkah demi selangkah fragmen
meskipun ada fragmen panjang dalam genom. Memperkenalkan beberapa salinan fragmen DNA
yang diinginkan ke dalam kromosom, akan memungkinkan analisis pengaruh pengelompokan
sekelompok gen (operon) secara keseluruhan sambil mempertahankan regulasi asli sintesis
produk yang sesuai dan menghindari ketidakseimbangan yang serius dari komponen komponen.
struktur kompleks yang dikodekan oleh gen-gen ini. Dalam kasus gen yang mengkode produk
yang berpotensi toksik, metode ini mungkin sangat berguna untuk secara tepat mengontrol
jumlah salinan gen-gen ini dalam kromosom.
Efektivitas proses medi80 yang dimediasi integrase agak tinggi, 1,9 × 10-4 (Haldimann dan
Wanner, 2001). Namun, dalam pendekatan kami, prosedur integrasi terdiri dari beberapa
langkah, dan oleh karena itu kemanjuran prosedur tergantung pada faktor-faktor tambahan.
Sebagai contoh, dalam pendekatan kami, prosedur integrasi memerlukan persiapan awal fragmen
DNA sirkular setelah eliminasi asal plasmid dari replikasi dan ligasi sendiri berikutnya. Untuk
meningkatkan kemanjuran pada tahap ini, langkah tambahan pemurnian gel ori-less sebelum
self-ligasi mungkin disarankan. Jika tidak, frekuensi kemunculan klon yang dimiliki seluruh
plasmid yang mengandung ori mencapai 20% dari jumlah total CmR integr80 Integant yang
dimediasi.
Sebagai percobaan pembuktian konsep, kami melakukan kloning dan integrasi operon ATP.
Kami juga memperkirakan efek dari salinan atp operasi tambahan pada tingkat pertumbuhan sel
di bawah kondisi pasokan oksigen yang berbeda. Struktur dan fungsi E. coli ATP synthase telah
dipelajari secara luas, sebagaimana ditinjau oleh (Weber, 2007). ATP sintase E. coli terdiri dari
delapan polipeptida yang berbeda. Gen atpIBEFHAGDC yang menyandikan sub-unit ini diatur
dalam satu operon. Transkripsi gen-gen ini dan terjemahan diferensial berikutnya memberikan
jumlah yang tepat dari masing-masing subunit ATP sintase untuk perakitan ke dalam kompleks
tema (Lagoni et al., 1993). Themodulasi ekspresi atp operon dengan mengganti promotor asli
oleh promotor lac dan memvariasikan konsentrasi induktor IPTG memiliki efek positif kecil
pada hasil pertumbuhan (Jensen et al., 1993). Efek kecil ini mungkin merupakan konsekuensi
dari rasio subunit yang tidak sesuai dan, akibatnya, perakitan subunit yang tidak efisien. Kloning
dan penyisipan fragmen DNA besar sangat penting dalam studi genetik dan studi tentang efek
fisiologis operon panjang yang mengkode enzim kompleks multisubunit, seperti ATP synthase.
Beberapa salinan dari satu operon dengan mode pengaturan ekspresi asli semua gennya harus
mempertahankan rasio subunit yang tepat dan memungkinkan produksi berlebih kompleks enzim
fungsional. Teknik kami memungkinkan kita untuk memeriksa efek dua salinan operon atp
dalam kromosom E. coli pada pertumbuhan sel. Peningkatan pertumbuhan sel yang signifikan
(5% dari hasil) diamati dalam kondisi aerasi tinggi. Sebaliknya, di bawah aerasi yang lebih
rendah, laju pertumbuhan dan hasil biomassa sel-sel yang mengandung salinan tambahan dari atp
operon berkurang dibandingkan dengan strain tipe liar. Di bawah aerasi yang lebih rendah,
fungsi komponen pemompaan proton dari rantai respirasi, seperti NADH dehydrogenase I dan
bo terminal oxidase, kemungkinan ditekan, sehingga membatasi sintesis ATP oleh ATP synthase
dan mempromosikan hidrolisis ATP oleh ATP synthase. Dengan demikian, pendekatan ini
tampaknya cukup efektif untuk meningkatkan aktivitas kompleks multi-enzim dan mungkin
membantu untuk menjelaskan fitur-fitur mesin molekuler yang rumit. Penggandaan lebih dari
selusin gen dan operon dalam kromosom E. coli dapat dilakukan dengan cara yang serupa
(misalnya, operon tipe liar dan mutan yang mengandung gen cyoABCD,
nUABCEFGHIJKLMN, hisGDCBHAFI, ilvGMED, thrABC, yang panjangnya berkisar dari 4
hingga 13 kb).
Kesimpulan
Dalam karya ini, metode yang didasarkan pada sistem rekombinasi umum yang spesifik yang
dimediasi fag dan spesifik lokasi digabungkan untuk mengembangkan pendekatan baru untuk
pengeditan genom E. coli. Vektor pGL2 yang diperoleh memungkinkan kloning in vivo dari
fragmen DNA panjang (lebih dari 10 kb) melalui rekombinasi λRed dan penyisipan target yang
dimediasi φ80 integrase dari fragmen-fragmen ini ke dalam lokus kromosom yang diinginkan.
Metode ini memungkinkan prosedur penyisipan fragmen DNA diulang dengan mengeksploitasi
sistem integrasi / eksisi fag. Sebagai contoh, kami mengkloning operon E. coli atpIBEFHAGDC
ke vektor pGL2 dan mengkonfirmasi fungsinya. Salinan kedua operon ini diintegrasikan ke
dalam kromosom E. coli, dan duplikasi operon meningkatkan tingkat pertumbuhan sel dan hasil
biomassa pada kondisi pasokan oksigen tinggi. Metode selanjutnya dari penggambaran gen
target kloning menjadi satu kromosom bakteri dijelaskan. Dengan demikian, alat yang
dikembangkan mungkin berguna untuk keperluan rekayasa metabolisme untuk
menyederhanakan pengeditan genom E. coli dan untuk mempertahankan lingkungan genetik
spesifik yang tidak diubah untuk memeriksa regulasi seluruh operon atau kelompok gen.