C.

Tahapan-tahapan Proses Kloning

1. Persiapan rekombinasi DNA
Salah satu teknik
yang digunakan untuk
mengisolasi gen dikenal
sebagai "shot gun". DNA
yang diisolasi dari
organisme tempat gen yang
diinginkan tersebut dibagi
menjadi beberapa segmen
yang sesuai untuk
rekombinasi (dengan
panjang antara 2.000 dan
20.000 pasangan basa)
menggunakan restriksi
endonuklease. Genom
manusia, misalnya, dapat
dibagi menjadi ratusan ribu
keping. Selanjutnya,
fragmen ini dimasukkan ke
dalam vektor (fag) yang
sesuai menggunakan metode
DNA rekombinan. Dengan
cara ini, semua informasi
genetik sel donor dibagi
menjadi fag, yang masing-masing akan menerima bagian genom; beberapa
fragmen ini harus mengandung gen yang dicari.
Fag dengan DNA rekombinan dimasukkan ke dalam bakteri (E. coli),
di mana ia direplikasi. Dapat dipastikan bahwa hanya satu fag yang
menembus setiap bakteri. Bakteri diunggulkan dalam media kultur yang
 cukup diencerkan untuk memungkinkan mereka berkembang biak dan
membentuk koloni yang terpisah. Didistribusikan di petridish, banyak koloni
dapat dengan mudah dikenali. Masing-masing adalah populasi klon, yang
berasal dari sel induk tunggal; oleh karena itu, semua bakteri di suatu koloni
memiliki dan mereplikasi DNA asing yang sama.
Himpunan klon yang didistribusikan di antara semua fragmen DNA
donor merupakan perpustakaan genom. Langkah selanjutnya adalah
mengidentifikasi populasi klon yang mengandung gen yang diinginkan.
Operasi ini disederhanakan dengan memiliki sepotong DNA identik dengan
yang ada dalam gen. Segmen DNA dengan karakteristik tersebut, disebut
salinan DNA dapat digunakan sebagai penyelidikan untuk menemukan
populasi koloni mana yang mengandung gen yang diinginkan
2. Persiapan probe cDNA
Probe DNA
komplementer
(cDNA) dapat
disintesis dari sel-
sel kaya protein
yang dikode oleh
gen yang
diinginkan (mis.,
Untuk gen globin,
sel-sel prekursor eritrosit; untuk gen proinsulin, sel β sel pankreas pulau
Langerhans). Dalam sel-sel ini, ada dominasi mRNA yang mengarahkan
perakitan protein, sehingga lebih mudah untuk mengisolasinya dalam bentuk
murni. Setelah mRNA untuk gen yang diinginkan telah diperoleh, mRNA
digunakan sebagai template untuk mensintesis untai cDNA dengan transkripsi
terbalik. perpustakaan cDNA.
Perpustakaan genom, terutama yang berasal dari eukariota dengan
genom yang sangat besar, tidak efisien untuk menemukan gen tertentu, karena
 sebagian besar dari total DNA adalah DNA bukan kode. Perpustakaan DNA
yang dibuat dari RNA total matang dari sel atau jaringan lebih efektif. MRNA
ini digunakan sebagai templat untuk sintesis salinan DNA dengan
transkriptase terbalik. cDNA yang diperoleh, komplementer atau bagian
nonkode genom lainnya.
Untuk mendapatkan probe cDNA radioaktif, deoksiribonukleosida
trifosfat dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP, dilabeli dengan 32P dalam fosfat
pertama, ditambahkan. Dengan aksi reverse transcriptase, nukleotida ini
dirakit pada panduan mRNA, membentuk untai DNA komplementer yang
darinya DNA untai ganda dapat dibuat, menggunakan DNA polimerase
Ada berbagai metode, selain yang disebutkan sebelumnya yang
digunakan untuk mendapatkan probe cDNA. Memilih prosedur yang paling
cocok membantu dalam persiapan cDNA dari gen apa pun, bahkan jika itu
dalam konsentrasi yang sangat rendah dalam sel.
3. Identifikasi klon yang mengandung gen
Untuk mencapai hal ini, cakram selulosa nitrat diterapkan pada kultur,
sehingga bersentuhan dengan koloni yang terbentuk di atas lempeng. Bagian
dari masing-masing koloni ditransfer ke cakram, meninggalkan cetakan
kultur. Bakteri yang menempel pada selulosa nitrat dilisiskan dan DNA
mereka melekat pada kertas di lokasi koloni asli. Kemudian, DNA
didenaturasi dengan pemanasan. Larutan cDNA (juga didenaturasi) diterapkan
pada cakram. Setelah pendinginan lambat, anil dari untaian komplementer
terjadi. cDNA radioaktif berhibridisasi dengan DNA di atas kertas.
Kelebihan cDNA dihilangkan dengan mencuci cakram selulosa nitrat
dan ditempatkan pada film radiografi. Di tempat-tempat di mana terdapat
DNA hibrid, film tersebut tercetak (autoradiografi), mengidentifikasi koloni
yang mengandung gen yang diinginkan. Setelah diidentifikasi, koloni bakteri
diunggulkan dalam media kultur di mana ia akan berlipat ganda dari sisa
koloni. Gen telah dikloning, sekarang akan ada jutaan sel yang terus
menggandakannya, diisolasi dari sisa genom.
 4. Ekspresi gen hasil cloning
Gen asing yang dimasukkan ke dalam genom organisme inang tidak
selalu dapat diekspresikan. Seringkali ia terus bereplikasi, tetapi tidak
ditranskripsi menjadi mRNA dan, oleh karena itu, protein yang dikodekan
tidak disintesis. Dalam hal ini, gen tersebut diambil dari sel di mana ia
dikloning dan dimasukkan ke dalam vektor lain yang lebih efisien. Jika
penyisipan dilakukan dalam genom inang di lokasi yang dekat dengan
wilayah promotor, gen dapat diekspresikan dan memiliki aktivitas yang
bahkan lebih besar daripada yang ada di sel asalnya.

Daftar Pustaka
Blanco, Antonio dan Blanco, Gustavo. 2017. Medical Biochemistry. London: Elsevier
Inc.