2.3.

Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Pada pewarnaan Gram ini, reagen
yang digunakan ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodine, alkohol dan safranin. Ketika sediaan
dilarutkan dengan kristal violet lalu kemudian iodin, warna ungu dari larutan kristal violet
ini akan ditahan oleh struktur peptidoglikan bakteri ditambah dengan penahanan oleh larutan
iodin. Kemudian ketika sediaan disirami alkohol yang bisa menghapus zat warna ungu dari
kristal violet tadi, oleh karena pori-pori peptidoglikan yang sempit ditambah dengan adanya
iodin maka zat warna ungu tersebut sulit untuk terhapus oleh alkohol sehingga akan tetap
terlihat berwarna ungu. Sementara oleh karena struktur pori peptidoglikan dari bakteri gram
negatif yang lebih besar, maka akan lebih mudah bagi larutan alkohol untuk menetralisir
atau menghapus zat warna ungu yang ada di peptidoglikan sehingga akan terlihat warna pink
setelah pemberian safranin Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari
kristalv i o l e t   s e h i n g g a   k e t i k a   d i a m a t i   m i k r o s k o p   a k a n   m e n u n j u k k a n   w a r n
a   u n g u sedangkan bakteri Gram negatif tidak dapat mempertahankan warna
ungu dari kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding sel
sehingga akan memperlihatkan warna merah (Pratita, 2012).
Perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram negative menunjukkan
bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri
gram positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan peptidoglikan
yang tebal sedangkan bakteri gram negatif
m e m i l i k i   s t u r k t u r   d i n d i n g   s e l dengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri, 2011).
Pengecatan gram dilakukan pada kultur bakteri umur 24 jam. Terdapat beberapa
langkah dalam melakukan pewarnaan gram, yaitu:
1. Spesimen diusapkan di kaca objek lalu dikeringkan di atas api selama beberapa detik
2. Lalu siram kaca objek dengan larutan kristal violet
3. Bilas dengan air mengalir
4. Tuangkan larutan iodin
5. Bilas dengan air mengalir
6. Tuangkan larutan aseton (30ml) dan alkohol (70ml) selama 10–30 detik
7. Bilas dengan air mengalir
 8. Genangi sediaan dengan basic fuchsin (safranin) selama 10 – 30 detik
9. Bilas lagi dengan air dan keringkan
(Brooks et al., 2010)
2.4. Pengecatan Tahan Asam
Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, yaitu Ziehl-Neelsen, Tan Thiam Hok, dan
Fluorokrom. Metode Ziehl-Neelsen merupakan pilihan yang cukup sederhana dan memberikan
sensitivitas yang cukup tinggi. Pada penggunaan metode ini, stain terhadap bakteri ini akan
menunjukkan warna merah (Azizah, 2018).
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %,
asam alkohol 3 %, dan methylenblue 0,3 %. Pada dasarnya prinsip pewarnaan ini adalah
memanfaatkan panas dan phenol agar bisa menembus lapisan lemak atau lilin yang ada di
dinding sel sehingga lapisan lemak itu akan tertembus dengan zat warna dasar yaitu carbol
fuchsin. Setelah terwarnai dengan carbol fuchsn dan dicuci dengan air mengalir, maka lapisan
lilin yang terbuka akan kembali tertutup karena pendinginan saat dicuci. Sewaktu dituang denan
asam dan alkohol, warna merah dari carbool fuchsin pada BTA tidak akan lepas. BTA
melepaskan warna merah sehingga akan menjadi berwarna pucat dan tidak berwarna. Akhirnya
pada waktu dicat dengan methyleneblue, BTA tidak akan menyerap warna tersebut sedangkan
bakteri yang tidak tahan asam akan mengambil warna biru dari methyleneblue (Azizah, 2018).

Kadar resap pewarna pada sel yang tahan asam adalah rendah dibandingkan dengan sel tak tahan
asam. Hal ini disebabkan karena perbedaan komposisi kimia antara kedua bakteri tersebut.
Bakteri tahan asam mempunyai karbohidrat, alkohol, dan asam lemak yang tersendiri
(Syahrurachman, dkk. 1994).

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: UI Press
Azizah, E.S.N., 2018. Perbandingan Tingkat Kepositifan Antara Pewarnaan Basil Tahan Asam
Konvensional Metode Ziehl-Neelsen Dengan Penambahan Bleach 2 % Untuk Mendiagnosis
Tuberkulosis Pada Spesimen Sputum. Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah, Jakarta
Brooks, GF., Carroll KC, Butel JS, Morse, and all. 2010. Mikrobiologi Kedokteran Jawetz,
Melnick, & Adelberg. Ed. 25. Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta
Fitri, L., Yekki, Y., 2011. Isolasi dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Kitinolitik. Jurnal
Ilmiah Pendidikan Biologi, Vol. 3, No. 2
Pratita, Maria Yuli E., Surya Rosa, P., 2012. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Termofilik dari
Sumber Mata Air Panas di Songgoriti Setelah Dua Hari Inkubasi, Jurnal Teknik Pomits, Vol.1
No. 1