Laporan Praktikum Mata Kuliah Biologi sel dan molekuler

“TEKNIK AMPLIFIKASI ASAM NUKLEAT SECARA RT PCR”

Disusun Oleh :

ELISABETH AMADEA RATU

NIM : 711345319009

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MANADO

DIII TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

2020
 Judul : Deteksi SARS-COV2 dengan Realtime PCR

Tujuan :

1. PCR atau polymerase chain reaction adalah pemeriksaan laboratorium untuk mendeteksi
keberadaan material genetik dari sel, bakteri, atau virus.
2. PCR juga digunakan untuk mendiagnosis penyakit COVID-19, yaitu dengan mendeteksi
material genetik virus Corona

Prinsip :
Prinsip dasar PCR adalah proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan
ekstensi/ elongasi oleh enzim DNA polimerase. PCR dimulai dengan cetakan DNA dalam
jumlah yang sedikit (nanogram= ng), kemudian setelah mengalami beberapa siklus amplifikasi,
jumlah copy DNA akan menjadi jutaan kali lipat.

Dasar Teori :

RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) adalah teknik yang digunakan untuk
mengendalikan DNA target dari suatu organisme yang bertujuan untuk mengetahui kualitas
DNA target. Selain itu, alat ini juga dapat melihat kualitas DNA secara relative, ekspresi gen
(kuantifikasi mRNA), deteksi keberadaan DNA target, menentukan jenis SNP (Single
Nucleotide Polymorphism), Menentukan kurva Tm (Melting Curve), dan melakukan screening
High Resolution Melting (HRM). Instrumen Real-Time PCR bekerja berdasarkan prinsip PCR.
Namun berbeda dengan instrument PCR konvensional, dengan RT-PCR, kita dapat mengamati
proses penggandaan DNA target secara real-time dari satu PCR ke siklus selanjutnya tanpa
perlu melakukan elektroforesis (agarose) untuk melihat hasilnya.

Masalah utama dalam analisis gen adalah sulitnya mendapatkan molekul DNA spesifik
yang menjadi target, terutama dari mamalia, dalam jumlah yang memadai untuk
dideteksi/dikuantisasi. Sebelum ditemukan teknologi PCR, untuk memperbanyak
(memfotokopi) molekul DNA para peneliti harus menunggu hasil kloning selama berhari- hari.
Dengan menggunakan teknik PCR, proses fotokopi DNA tersebut hanya memerlukan waktu
beberapa jam saja.Dengan penemuan ini, dunia genetika molekuler seperti mendapatkan
anugerah baru. Bagaimana tidak, dengan teknik PCR penelitian-penelitian dalam bidang
biokimia atau biologi molekuler yang berhubungan dengan gen (DNA) dapat dilakukan secara
lebih cepat dan efisien.Kesederhanaan dan tingginya tingkat keberhasilan amplifikasi fragmen
DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin berkembang dan semakin luas
penggunaannya.Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekuler
karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. (Yuwono, 2010).
Sebagai ilustrasi teknik amplifikasi DNA dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang relatif
singkat, seperti yang disajikan pada Gambar 8.1 di atas.

Masalah utama dalam analisis gen adalah sulitnya mendapatkan molekul DNA spesifik
yang menjadi target, terutama dari mamalia, dalam jumlah yang memadai untuk
dideteksi/dikuantisasi. Sebelum ditemukan teknologi PCR, untuk memperbanyak
(memfotokopi) molekul DNA para peneliti harus menunggu hasil kloning selama berhari- hari.
Dengan menggunakan teknik PCR, proses fotokopi DNA tersebut hanya memerlukan waktu
beberapa jam saja.Dengan penemuan ini, dunia genetika molekuler seperti mendapatkan
anugerah baru. Bagaimana tidak, dengan teknik PCR penelitian-penelitian dalam bidang
biokimia atau biologi molekuler yang berhubungan dengan gen (DNA) dapat dilakukan secara
lebih cepat dan efisien.Kesederhanaan dan tingginya tingkat keberhasilan amplifikasi fragmen
DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin berkembang dan semakin luas
penggunaannya.Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekuler
karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. (Yuwono, 2010).
Sebagai ilustrasi teknik amplifikasi DNA dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang relatif
singkat, seperti yang disajikan pada Gambar 8.1 di atas.

1. Pengertian PCR
Pemahaman tentang konsep PCR akan sangat baik apabila diawali dengan pengertian terlebih
dahulu. Terdapat beberapa pengertian PCR menurut beberapa referensi. Silakan Anda pelajari
beberapa pengertian PCR dari berbagai ahli, berikut ini:
• sintesis dan amplifikasi enzimatik invitro pada sekuen DNA spesifik. (Bermingham dan
Luettich, 2003).
• suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen
nukleotida tertentu dengan cara invitro. (Yuwono, 2006).
• suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara i n
vitro.(Fatchiyah, dkk., 2012).
 • suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara invitro (Yusuf, 2010).
• suatu metode biomolekuler yang canggih untuk perbanyakan segmen DNA spesifik in
vitro, melalui suatu proses enzimatik dengan menggunakan enzim DNA polymerase dan
primer nukleotida yang akan berhibridisasi dengan bagian DNA dari dua arah yang
berlawanan. (Elza dan Solachuddin, 1998).
• suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus
terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. (Darmo Handoyo dan Ari Rudiretna,
2001).
• teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen spesifik menjadi ribuan sampai
jutaan kopi sekuen DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA. (Dyah
Ayu dan Dharmayanti, 2014).
• cara efektif untuk memperoleh kuantitas urutan nukleotida untaian DNA secara in vitro.
(Hutapea, dkk., 2015).
• salah satu teknik dalam biologi molekuler untuk mengamplifikasi atau menggandakan
sejumlah kecil DNA secara invitro menggunakan sistim enzimatik dan suhu. (Maftuchah,
dkk., 2014).

Beberapa pengertian PCR yang sudah dijelaskan di atas menunjukkan pengertian yang
hampir sama. Apabila digabungkan dari beberapa referensi di atas, intinya adalah PCR
merupakan suatu teknik atau metode atau cara perbanyakan (replikasi/ amplifikasi) fragmen
DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme atau secara invitro, yang melibatkan
beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target
DNA untai gandasampai jutaan kopi fragmen DNA.Teknik amplifikasi DNA menggunakan
PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNAmenjadi ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi
dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi
molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh berbagai
mikroorganisme (virus, bakteri, jamur/fungi, parasit), Genetic profiling in forensic, legal and
bio- diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA
Quantitation pada sel ataupun jaringan.Saudara sekalian, Anda sudah mempelajari tentang
pengertian PCR. Semoga Anda dapat memahami tahap demi tahap dari pembelajaran ini,
 sehingga Anda dapat mencapai kompetensi yang diharapkan. Apabila ada hal-hal yang
belum jelas atau belum Anda pahami, Anda dapat mencatat pertanyaan di buku kerja. Anda
dapat bertanya kepada pembimbing/dosen pengampu pada saat pertemuan tatap muka.
Setelah mempelajari pengertian

PCR, pembelajaran terkait PCR dilanjutkan dengan topik tentang Prinsip Dasar Amplifikasi
PCR. Apakah Anda sudah mengenal atau bahkan sudah memahami tentang Prinsip dasar
Amplifikasi PCR? Bagi yang belum memahami, silakan Anda simak penjelasannya. Bagi
Anda yang sudah memahami materi ini, silahkan anda dapat lanjut mempelajari Bab 9
tentang Teknik Identifikasi Asam Nukleat.

Prinsip dasar PCR adalah proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan
ekstensi/ elongasi oleh enzim DNA polimerase. PCR dimulai dengan cetakan DNA dalam
jumlah yang sedikit (nanogram= ng), kemudian setelah mengalami beberapa siklus
amplifikasi, jumlah copy DNA akan menjadi jutaan kali lipat. (Maftuchah, 2014). Sepasang
primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’
menuju ujung-3’ untai DNA target dan akan mengamplifikasi urutan yang diinginkan. Dasar
siklus PCR umumnya terdiri dari 30-35 siklus meliputi denaturasi (95°C) selama 30 detik,
annealing (55–60°C) selama 30 detik dan ekstensi (72°C), waktu tergantung panjang
pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi. Peningkatan jumlah
siklus PCR di atas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif. Bagaimanakah gambaran
siklus dasar PCR? Perhatikan profil temperatur (suhu) yangdigunakan pada PCR pada
Gambar 8.3 A dan siklus dasar PCR seperti terlihat pada Gambar

8.3 B.

Observasi video

Video 1
Berbicara tentang prinsip PCR waktu nyata teknik bagaimana cara melakukannya dan segala
sesuatu yang berhubungan saya juga akan berbicara tentang transkripsi terbalik karena ini
digunakan secara luas dalam PCR waktu nyata dan juga data real-time tipe nyata PCR jadi mari
seperti biasa mari kita mulai dengan bertanya apa itu PCR real-time PCR waktu nyata pada
 dasarnya teknik yang dimodifikasi dari PCR jadi apa bedanya seperti yang saya katakan di PCR
video sebelumnya adalah termal pengendara sepeda sehingga melakukan siklus termal dengan
memanaskan dan mendinginkan suhu dalam tiga langkah yaitu Dekorasi DNA kemudian
mendasari

anil dan kemudian perluasan DNA dengan ini tiga langkah mewakili satu siklus satu
PCR siklus dan kemudian setelah setiap siklus kita akan melakukannya dapatkan dua kali lipat
jumlah urutan PCR kita lakukan jika Anda memiliki dua urutan pertama maka kita akan
mendapatkan empat lalu delapan dan seterusnya jadi ini adalah proses penguatan DNA dan
memperkuat DNA tertentu sekuens atau gen sekarang tentu saja di PCR apa yang bisa kita
lakukan adalah mengatur waktu yang kita bisa atur waktu selama 1 jam setengah jam atau
seterusnya dan di akhir proses PCR kita dapat tentu saja kami bisa mendapatkan sampel kami
dan kami dapat mengukur jumlah DNA yang kita miliki akhir dari PCR tapi kita tidak akan
pernah tahu berapa banyak PCR yang kami miliki selama siklus dan ini adalah modifikasi di
PCR waktu nyata karena PCR waktu nyata adalah kombinasi antara PCR dan spektrofluorometer
ii jadi seperti itu

PCR normal tetapi terlibat dengan spektrum untuk emitor bening yang dapat mengukur atau ya
mengukur jumlah DNA di saya sampel selama terus menerus selama Proses PCR atau setelah
setiap siklus jadi saya akan dapatkan perkiraan berapa banyak DNA yang saya miliki setiap
siklus proses PCR saya jadi mari mengatakan ini adalah PCR yang kami miliki dua kali lipat
jumlah urutan DNA setelah masing-masing siklus spektrofluorometer akan mengukur jumlah
DNA dalam sampel saya selama PCR terus menerus dan ini bagaimana cara kerjanya jadi ini
adalah diagram mesin PCR real-time jadi inilah yang kami sebut dengan tube patch-nya terlihat
seperti ini dari luar jadi ini dia ketika kami meletakkan tabung kami biasanya kami gunakan
piring karena kita bisa kita bisa menerapkan PCR real-time ke beberapa sampel sekaligus waktu
sehingga kita dapat menggunakan pelat 96-sumur atau apapun yang terjadi di sini adalah
pengendara sepeda termal seperti PCR biasa ini apa adanya lihat di sini adalah pengendara
sepeda termal normal dan apa yang Anda lihat di sini di ekstra yang merupakan
spektrofluorometer jadi itu jadi thermal cycler mengalami siklus termal normal Anda tahu
ketiganya langkah-langkah siklus termal dan kemudian spektrofluorometer mengukur jadi ini
spektrum ini adalah bagaimana spektrofluorometer bekerja sehingga merangsang a fluorofor
spesifik di dalam sampel dan kemudian lantai untuk EM itu fluorescent atau memancarkan
cahaya dan kami kemudian mendeteksi cahaya yang keluar dari sampel ini jadi begini caranya
spektrofluorometer bekerja sehingga spektrofluorometer tetap berfungsi mengukur jumlah DNA
dalam sampel saya terus menerus selama proses PCR karena ini disebut waktu nyata berikut
adalah cara kerja spektrofotometer pada dasarnya jadi ini adalah sumber cahaya lalu kita punya
cermin yang kita punya monokromator untuk memilih seperti tertentu panjang gelombang maka
cahaya tersebut menyebabkan eksitasi ke fluorophore yang memancarkan cahaya dan kita dapat
mendeteksi di detektor jadi ini spektrofluorometer yang kita

lihat di sini dan ini adalah cara kerjanya jadi ini adalah PCR waktu nyata sebenarnya dalam
waktu nyata PCR ini seperti PCR biasa tetapi kami memang demikian mengukur jumlah DNA
yang kita miliki di dalam sampel terus menerus selama PCR karena ini disebut nyata waktu
sekarang saya akan berbicara tentang bagaimana cara kerjanya bagaimana PCR real-time bekerja
dan saya katakan seperti yang saya katakan sebelumnya di video PCR yang kita butuhkan empat
elemen penting untuk melakukan proses PCR yang pertama kita membutuhkan DNA orang tua
kita membutuhkan DNA tersebut urutan atau gen spesifik yang kita inginkan memperkuat maka
kita membutuhkan isi DNA karena tentu saja karena kita perlu mensintesis DNA jadi kami
membutuhkan dntps

VIDEO 2

Judul :deteksi SARS-COV2 dengan Realtime

PCR Penanganan spesimen

Sensitifitas dan spesifisitas deteksi virus dalam spesimen di pengaruhi

• Jenis pemeriksaan

• Waktu pengambilan spesimen sejak onset

• Kualitas spesimen

• Penanganan spesimen

• Waktu dan pengamblan spesimen hingga pemeriksaan

Jenis spesimen
 • Minimum sampel saluran nafas yang dikumpulka,merupakan spesimen yang di dapat dari
saluran nafas atas dan saluran nafas bawah.
• Jenis spesim Usap nasopharing atau orofaring yang di ambil dengan swab Dacron atau
flocked swab + virus transport medium ( VTM) di kirim pada suhu 4 derajat celcius stabil
salama < 5 hari pada suhu 4 derajat celcius.untuk spurum di masukan pada container steril
pada suhu 4 derajat celcius dan stabil selama <48 jam dalam suhu 4 derajat celcius

Persiapan alat dan bahan

• Viral transport medium (VTM)

• Steril
• Larutan isotonic
• Mengandung antibiotic
• Buffer PH
• Indicator (phenol Red)

Prosedur pengambilan spesimen swab

Yang perlu diperhatikan

• Putuskan tangkai plastic di daerah mulut cryotube agar crytube dapat di tutup dengan rapat
• Crytube kemudian dililit parafilm

• Crytube yang sudah berisi swab di bugkus dengan tissue bersih lalu dimasukan kedalam
plastic klip
• Simpan dalam suhu 4-8 derajat celcius sebelum dikirim.

• Container steril spesimen

• Plastic klip atau plastic pembungkus container siapkan

• Sputum di tamping dalam container steril

Pengiriman spesimen

• Semua spesimen dikemas untuk mencegah kerusakan dan tumpahan

• Spesimen pasien harus dilakukan tatalaksaana sebagai

 UN3373,”substansi biologis,kategori B”,ketik akan di angkut atau investigasi
• System yang digunakan adalah dengan menggunakan tiga lapis (three layer packaging) sesuai
dengan pedoman WHO dan international Air transport Association (IATA)
• Masing-masing spesimen dimasukan kedalam plastic klip berisi tissue sebagai absorban
secara terpisah (per pasien/spesimen)

Molecular tes

• Mendeteksi material atau materi genetic virus

• Sensitive dan spesifik

• Cepat

• Memerlukan tahapan persiapan sampel

• Perlu peralatan kusus

• Memerlukan fasilitas lab khusus BSL 2

• Tahapan.isolasi material genetic (ekstrasi) -> perbanyak materi genetic

(PCR) EKSTRASI RNA

• Mengisolasi asam nukleat dari berbagai material selular didalam spesimen

• Dilakukan di BSL ll

• Menghilangkan material penghambat yang tidak diperlukan dalam reaksi PCR Inaktivasi
virus (lysis buffer)

Pra analitik

➢ Persiapan alat dan

bahan Komponen PCR

• Dntp
• Enzim termostabil taq DNA polymerase

• Ion Mg2
• Buffer

• Primer forward

• Primer reverse

• Template DNA

• PCR
• Tube PCR

▪ Tahap PCR

1. Denaturasi ds DNA -> ss DNA 60 detik,90 – 95 derajat celcius

2. Anneling penempelan primer F dan R 30 -> 45,50 – 60 derajat celcius

3. Elongasi perpanjangan untai DNA baru oleh Taq polymerase 1-2 enit,72 derajat

celius Hasil copy DNA 2^n = 34 milyar copy DNA

▪ RT-PCR

• Reverse transcript-polymerase chain reaction

• Amplifikasi DNA dengan templateRNA Terdiri dari 2 tahap

- RT : reverse Transcription -> Cdna synthesis

- PCR : DNA Amplification

Komponen RT-PCR

PCR RT-PCR
 Dntp Dntp
Enzim termostabil Enzim termostabil
Taq DNA Taq DNA
polimerase Ion polimerase Ion
Mg2 Mg2
Buffer Buffer Enzim
reverse
Primer forward
transcriptase
Primer reverse Primer
Template : DNA forward

Primer reverse

Template : RNA

KOMPONEN MASTER MIX Qpcr

Konvensional

• Pcr buffer

• dNTPs

• Enzim reverse transcriptase

• Enzim taq polymerase

• Primer forward

• Primer reverse

Real time

• Pcr buffer

• dNTPs
• Enzim reverse transcriptase

• Enzim taq polymerase

 • Primer forward

• Primer reverse

• Probe

Hasil real time PCR (Qpcr)

Direkan dalam bentuk kurva amplifikasi.hasil akhir berupa nilai Ct yang merupakan perpotongan
antara garis threshold dengan kurva amplifikasi.

Semakin banyak dna copy,semakin awal sinyal terdeteksi ->semakin rendah nilai Ct

Fasilitas laboratorium PCR

Lay out untuk Lab

PCR Pre PR

1. Area reagensia

2. Area proses spesimen PCR

3. Area perbannyakan dan analisa hasil

Alur kerja searah

Setiap area memiliki alat lab,reagen,bahan habis pakai,dan APD masing-masing.Tidak untuk
dipindahkan ke ruangan lain

Alat dan kit PCR

Open system closed system
 Dapat digunakan untuk seluruh reagen Penggunaan terbatas hanya untuk

PCR reagensia yang dibuat oleh manufaktur

yang sama
Optimasi oleh pengguna
Tidak perlu optimsi oleh pengguna
Penggunaan terbuka untuk agen Penggunaan hanya untuk
penyakit yang akan diperiksa reagensia yang tersedia di
manufaktur

Pasca analitik
Kesimpulan
• Real Time Polymerase Chain Reaction atau RT-PCR telah menjadi metode pengujian
utama yang memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi, serta dapat mendeteksi
sampel dalam jumlah yang banyak dan waktu yang singkat
• Beberapa pengertian PCR yang sudah dijelaskan di atas menunjukkan pengertian yang
hampir sama. Apabila digabungkan dari beberapa referensi di atas, intinya adalah PCR
merupakan suatu teknik atau metode atau cara perbanyakan (replikasi/ amplifikasi)
fragmen DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme atau secara invitro,
yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi
duplikasi jumlah target DNA untai gandasampai jutaan kopi fragmen DNA.Teknik
amplifikasi DNA menggunakan PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNAmenjadi
ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa
nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus
PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.
Daftar pustaka :
Buku biologi sel dan molekuler. SC
https://youtu.be/DH7o9Df5_50
https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq
https://lppt.ugm.ac.id/2018/10/09/pelatihan-instrumentasi-rtpcr/