METODA PENGUKURAN DAN ANALISIS

PROSES AGROINDUSTRI

KROMATOGRAFI

DENI SUBARA
• Apa itu Kromatografi
• Prinsip Kromatografi
• JENIS KROMATOGRAFI
 Reaksi kimia

A+B•C
Apakah semua reaktan diubah menjadi produk?
Prinsip Kromatografi
Persyaratan
PRINSIP
PRINSIP Pemisahan Komponen Berbeda
• Pemisahan komponen yang terjadi karena perbedaan afiniti
(kekuatan adesi) dari berbagai komponen analit terhadap phasa
bergerak dan phasa diam.

• Afiniti yang berkaitan dengan: adsorpsi dan solubility.

PRINSIP Pemisahan Komponen Berbeda
• Adsorpsi • kemampuan dari komponen berikatan (melekat)
dengan phasa diam (fase diam) mis: silika.

• Kelarutan • kemampuan dari komponen untuk bercampur atau

terlarut kedalam fasa bergerak (mobile phase).
AFINITAS

• Kenapa senyawa berbeda (senyawa) berbeda afiniti?

• POLARITAS
 Dasar-dasar Kromatografi
• Berdasarkan afinitas yang berbeda untuk fase diam dan bergerak
• Silica gel: kutub, permukaan tertutup air
- Senyawa
• Kutub: _______ afinitas untuk piring, perjalanan _______
• Nonpolar: _______ afinitas untuk pelat, perjalanan ______

- Mengembangkan pelarut

• Kutub: afinitas lebih tinggi untuk pelat, bergerak lebih lambat, menggeser senyawa lebih
banyak (perjalanan gabungan __________)

• Nonpolar: afinitas lebih rendah untuk pelat, bergerak lebih cepat, menggeser senyawa lebih
sedikit (perjalanan senyawa ________)
KASUS

Dua campuran molekul A dan B.

A adalah Protein dan B adalah Lipid.
Kolom kromatografi dikemas dengan silika (kutub). Fase
gerak adalah heksana (non polar).

Apa yang terjadi jika campuran A dan B ditampilkan pada

kolom kromatografi ?.
KASUS
Jenis
Fase Normal • jika fasa diam nya adalah polar (hidropilik)

Fase terbalik • jika fasa diamnya adalah non-polar

(hidrophobik)
JENIS KROMATOGRAFI
 Jenis Kromatografi
• Kromatografi cair - memisahkan sampel cairan dengan pelarut cair
(fase gerak) dan kolom terdiri dari manik-manik padat (fase diam)

• Kromatografi Gas - memisahkan sampel yang diuapkan dengan gas pembawa

(fase gerak) dan kolom
terdiri dari manik-manik cair atau padat (diam
tahap)

• Kromatografi Kertas - memisahkan cairan kering sampel dengan cairan

pelarut (fase gerak) dan a strip kertas (fase diam)

• Kromatografi Lapis Tipis - memisahkan cairan kering sampel dengan a

pelarut cair (fase gerak) dan alumina piring dilapisi dengan lapisan tipis
kaca atau silika gel (fase diam)
 TAHAP STATIONARY

Jenis kromatografi Bahan

Kromatografi kertas Kertas saring, selulosa
(KK = kertas kromatografi)
Kromatografi Lapis Tipis Gel silika, alumina, poliamida
(KLN = Kromatografi lapisan nipis)

Kromatografi gas Squalene, apezion, carbowax M.

(GC)
Cairan Kinerja Tinggi C-8, C-18, Licosorb, Silikon
Kromatografi
(KCPT = kromatografi cecair prestasi
tinggi)
 TAHAP SELULER
Jenis kromatografi Pelarut

Kromatografi kertas Udara, alkohol

(KK = kertas kromatografi)
Kromatografi Lapis Tipis Hexane, minyak bumi eter, alkohol.
(KLN = Kromatografi lapisan nipis)

Kromatografi gas Dia, Ar, N 2

(GC)
Cairan Kinerja Tinggi Sikloheksana, n-heksana, karbon
Kromatografi tetraklorida, etanol, metanol, udara
(KCPT = kromatografi cecair
prestasi tinggi)
CARA MEMILIH METODE
1. POLARITAS SAMPEL
2. SOLUBILITAS DAN VOLATILITAS SAMPEL
3. RESOLUSI DIPERLUKAN
4. KONSENTRASI ANALYTE
5. BATAS DETEKSI
6. SIFAT FISIKA DAN KIMIA SAMPEL.
JENIS KROMATOGRAFI

Kromatografi Lapis Tipis

 TLC (Kromatografi Lapis Tipis)
• Kromatografi lapis tipis
• Fase diam
• Fase seluler
Pemisahan DAN Karakterisasi
 Uji Pemahaman Anda
• Bintik mana yang mewakili senyawa
yang lebih kutub?

• Apa yang akan terjadi pada setiap titik

jika pelarut yang kurang polar
digunakan?
 Karakterisasi Kuantitatif
• Faktor retensi
• Jarak tempuh /
jarak depan pelarut
• Tak bersatuan

• Untuk TLC silika gel,

berdasarkan polaritasnya
senyawa
Harus melaporkan pelarut!
 Efek pelarut pada R f
• Pelarut kutub mengalahkan senyawa,
mendorongnya ke atas pelat
 Memilih Pelarut yang Berkembang

• Sesuaikan pelarut untuk menghasilkan R f

nilai sekitar 0,4

• Campuran umum
- Eter / Hex
- EtOAc / Hex
- CH 2 Cl 2 / metanol
• Ditentukan
secara eksperimental
 Visualisasi
• Kebanyakan senyawa tidak terlihat
pada KLT

• Lampu UV
• Noda
• Ruang yodium
 Penerapan TLC
• Kemurnian
• Identitas
• Kemajuan Reaksi

Kolom 1 adalah senyawa target

Apa yang bisa kita lakukan Anda; kolom 2 adalah pengotor
menentukan tentang yang diharapkan. Apa
identitas dapatkah Anda menentukan
tidak diketahui? tentang reaksi Anda (kolom 3)?
 Masalah umum
• Overspotting
• Underspotting
• Pelarut salah
JENIS KROMATOGRAFI

Kromatografi Kolom
Kromatografi Kolom
• Mirip dengan TLC dalam pemisahan
• Proses persiapan
- Skala 0,1 g hingga 5 g

• Memurnikan sejumlah kecil cairan /

padatan (rekristalisasi kontras)
• Fase gerak: eluen mirip dengan
TLC
• Fase diam: silika gel mirip
dengan TLC
• Kolom terbalik dari KLT, jadi Rf
yang lebih besar untuk a
majemuk artinya keluar
____
 Pertimbangan Praktis
• Mempersiapkan kolom
• Memuat sampel
• Memilih pelarut
• Kapasitas pemisahan
 Pertimbangan Praktis
• Mempersiapkan kolom
• Memuat sampel
• Memilih pelarut
• Kapasitas pemisahan
 Pertimbangan Praktis
• Mempersiapkan kolom Paling umum:
Heksana / etil asetat
• Memuat sampel
CH 2 Cl 2 / metanol
• Memilih pelarut
• Kapasitas pemisahan
 Pertimbangan Praktis
• Mempersiapkan kolom
• Memuat sampel
• Memilih pelarut
• Kapasitas pemisahan
- Pengaruh diameter
- Pengaruh panjang

- Pengaruh kelas silika gel

JENIS KROMATOGRAFI

Kromatografi Flash
 Kromatografi Flash
• Pemisahan lebih cepat

• Pemisahan yang lebih erat

Prinsip kromatografi Flash
• Prinsip kromatografi flash mirip dengan kromatografi
kolom, di mana komponen dipisahkan berdasarkan
adsorpsi diferensial ke fase diam.
• Sampel yang diterapkan dilewatkan dengan menggunakan gas bertekanan yang
membuat proses lebih cepat dan lebih efisien.
• Molekul terikat pada fase diam berdasarkan afinitasnya
sementara sisa pelarut dielusi dengan menggunakan gas
bertekanan yang mempercepat proses.
• Di sini, fasa diam adalah padat, fasa gerak dan larutan elusi
adalah cair, dan gas bertekanan tambahan digunakan.
Langkah-langkah kromatografi Flash

• Kolom dibuat dengan mengambil tabung gelas yang dikeringkan dan dilapisi
dengan lapisan tipis yang seragam pada fase diam (selulosa, silika). Bagian
bawah dan atas kolom dibungkus dengan kapas untuk mencegah gel keluar.

• Kemudian sampel disiapkan dengan menambahkan campuran ke fase gerak.

Sampel dimasukkan ke dalam kolom dari atas, dan sampel yang dipompa
digunakan untuk melewatkan sampel dengan laju yang konstan.
• Molekul yang terikat pada kolom dipisahkan oleh larutan elusi di mana larutan
dengan polaritas yang sama digunakan (teknik isokratik), atau sampel
berbeda dengan polaritas berbeda digunakan (teknik gradien).
• Pelarut elusi diterapkan dengan tekanan minimum konstan yang diperlukan untuk
memindahkan zat terlarut ke bawah kolom.
• Molekul yang terpisah selanjutnya dapat dianalisis untuk berbagai tujuan
JENIS KROMATOGRAFI

HPLC
HPLC
KROMATOGRAFI

GC

HPLC
Peralatan HPLC dasar
Tidak seperti peralatan GC, banyak sistem HPLC memiliki desain modular - dapat dengan mudah menambahkan 'kotak'
baru untuk mengubah / memperluas kemampuan.
Prinsip HPLC
• Teknik ini didasarkan pada prinsip adsorpsi diferensial di mana
molekul yang berbeda dalam campuran memiliki tingkat interaksi
yang bervariasi dengan penyerap yang ada pada fase diam.
• Molekul yang memiliki afinitas lebih tinggi tetap teradsorpsi untuk waktu yang
lebih lama sehingga mengurangi kecepatan pergerakannya melalui kolom.
• Namun, molekul dengan afinitas yang lebih rendah bergerak dengan gerakan yang
lebih cepat, sehingga memungkinkan molekul untuk dipisahkan dalam fraksi yang
berbeda.

• Proses ini sedikit berbeda dengan kromatografi kolom seperti dalam

kasus ini; pelarut dipaksa di bawah tekanan tinggi hingga 400
atmosfer alih-alih membiarkannya menetes di bawah gravitasi.
Langkah-langkah HPLC

• Kolom dibuat dengan mengambil tabung gelas yang dikeringkan dan

dilapisi dengan lapisan tipis yang seragam pada fase diam (selulosa,
silika).
• Kemudian sampel disiapkan dengan menambahkan campuran ke fase gerak.
Sampel dimasukkan ke dalam kolom dari atas, dan pompa bertekanan tinggi
digunakan untuk melewatkan sampel dengan kecepatan konstan.
• Fase gerak kemudian bergerak ke bawah ke detektor yang mendeteksi
molekul pada panjang gelombang absorbansi tertentu.

• Molekul yang terpisah selanjutnya dapat dianalisis untuk berbagai

tujuan
Kegunaan HPLC

• Kromatografi cair kinerja tinggi digunakan dalam

analisis polutan yang ada dalam sampel lingkungan.
• Hal tersebut dilakukan untuk menjaga kemurnian produk dan pengendalian
kualitas dari berbagai produksi industri.

• Teknik ini juga dapat digunakan untuk memisahkan molekul biologis yang
berbeda seperti protein dan asam nukleat.

• Peningkatan kecepatan teknik ini membuat proses menjadi lebih

cepat dan efektif.
 Analisis kualitatif

Waktu retensi - t R - waktu yang berlalu dari titik injeksi ke puncak maksimum.
T disesuaikan R - t ' R - waktu dari puncak yang tidak ditahan hingga maksimum eluen.
Tahan waktu - t M - waktu yang dibutuhkan untuk fase gerak untuk melintasi kolom.

Indeks retensi Kovat

 Analisis kuantitatif

Ketinggian puncak
Dalam beberapa kasus, tou dapat mengasumsikan bahwa ketinggian puncak sebanding
dengan konsentrasi.
Keuntungan: kesederhanaan, perhitungan cepat
Kekurangan: tinggi lebih bervariasi daripada luas Biasanya
hanya digunakan dengan kolom kapiler.

Area puncak
Ini adalah pendekatan utama untuk membangun hubungan antara puncak dan konsentrasi.
Area ditentukan dari sejumlah besar pengukuran dan detektor biasanya memiliki rentang dinamis yang sangat besar.

Ini menghasilkan pengukuran yang sangat andal.

Masalah utama: Puncaknya adalah Gaussian. Bagaimana kita mengukur luasnya secara akurat?
 Interpretasi kuantitatif
Metode standar eksternal
Persyaratan untuk penggunaan yang benar:
Larutan standar yang mengandung semua eluen yang akan diukur. Eluen
standar harus memiliki konsentrasi yang sama dengan yang tidak diketahui.
Matriks standar dan sampel harus semirip mungkin
Kondisi analisis harus identik - instrumen stabil, ukuran sampel sama

CONTOH
Pelarut fase balik yang umum
Metanol - AC id
Asetonitril - dasar
Tetrahidrofuran - dipol besar
air - penyesuaian polaritas

Semuanya :

Viskositas rendah
Tersedia dalam UV transparan
dengan kemurnian tinggi
Dapat bercampur satu sama lain
 Sistem injeksi
Jika Anda mencoba file injeksi jarum suntik manual - Anda mungkin bekerja dengan tekanan setinggi 5000
psi.
Pendekatan sederhana akan menghentikan aliran dan menyuntikkan secara manual - tidak baik.

Pendekatan yang sangat umum adalah penggunaan katup dan loop pengambilan sampel.
JENIS KROMATOGRAFI

GC
KROMATOGRAFI GAS
Konvensional
1 / 8-1 / 4 '' OD,
Jenis dari
besi tahan karat
atau tabung kaca
Panjangnya 6-20 kaki

Persiapan
1/4 '',> 10 kaki panjangnya

Kapiler
0,1-0,5 mm ID
Panjangnya 10-100 meter

Penuh sesak Kapiler

 Faktor yang perlu dipertimbangkan:

Variasi kelarutan zat terlarut

Perubahan volatiliy zat terlarut
Stabilitas zat terlarut
Perubahan laju alir
Stabilitas fase diam
Harus tetap dalam Tmin / Tmax kolom Faktor-faktor lain
ditemukan secara eksperimental

Program suhu

a = suhu awal dan waktu b =

ramp ( Hai C / menit)
c = waktu dan suhu penahanan akhir

Beberapa GC akan memungkinkan program yang lebih kompleks

Kromatografi Gas
adalah teknik pemisahan di mana molekul dipisahkan
berdasarkan waktu retensinya tergantung pada afinitas
molekul ke fase diam.

Sampel berupa cairan atau gas yang diuapkan di

titik injeksi.
Prinsip kromatografi gas
• Kromatografi gas didasarkan pada prinsip bahwa komponen yang memiliki afinitas
lebih tinggi terhadap fasa diam memiliki waktu retensi lebih tinggi karena memerlukan
waktu lebih lama untuk keluar dari kolom.
• Namun, komponen yang memiliki afinitas lebih tinggi ke fase diam memiliki
waktu retensi yang lebih sedikit saat bergerak bersama fase gerak.
• Fase gerak adalah gas, kebanyakan helium, yang membawa sampel
melalui kolom.
• Sampel setelah diinjeksikan diubah menjadi tahap uap kemudian dilewatkan
melalui detektor untuk menentukan waktu retensi.
• Komponen dikumpulkan secara terpisah saat keluar dari fase
diam pada waktu yang berbeda.
Kegunaan kromatografi gas

• Teknik ini digunakan untuk menghitung konsentrasi bahan

kimia yang berbeda dalam berbagai sampel.
• Ini digunakan dalam analisis polutan udara, tumpahan minyak, dan sampel
lainnya.

• Kromatografi gas juga dapat digunakan dalam ilmu forensik untuk

mengidentifikasi dan mengukur berbagai sampel biologis yang
ditemukan di TKP
Contoh kromatografi gas
• Identifikasi obat pemicu kinerja dalam urin atlet.

• Pemisahan dan kuantifikasi obat padat dalam sampel

tanah dan air.
KESIMPULAN
TERIMA KASIH