TERJEMAHAN JURNAL

Potensi Osteogenik Biosilika pada Sel Mirip Osteoblas Manusia

(SaOS-2)
Matthias Wiens •Xiaohong Wang, Ute Schlobmacher, Ingo Lieberwirth, Gunnar Glasser, Hiroshi Ushijima,
Heinz C, Schröder, dan Werner EG Müller

ABSTRAK
Biosilica merupakan polimer alami yang disintesis oleh enzim poriferan silikat dari substrat
monomerik silikat. Biosilica merangsang aktivitas mineralisasi dan ekspresi gen sel SaOS-2. Untuk
mempelajari efeknya pada pembentukan hidroksiapatit (HA), sel SaOS-2 ditumbuhkan pada substrat
yang dimodifikasi silikatin / biosilika (irisan tulang, penutup penutup berlapis Ca-P, penutup kaca).
Pertumbuhan substrat ini memicu pembentukan nodul HA, yang diatur dalam susunan membujur
atau bintik berbentuk bola. Ukuran nodul di atas 1 m terdiri dari nanoroda HA seperti prisma yang
tidak teratur, dibentuk oleh agregat dari tiga sampai delapan sel SaOS-2. Selain itu, pertumbuhan
pada substrat yang dimodifikasi silikatin / biosilika meningkat [3 Penggabungan H] dT ke dalam DNA,
menunjukkan peningkatan sel proliferasi. Akibatnya, bioassay berbasis in vitro ditetapkan untuk
menentukan rasio antara [3 Penggabungan H] dT dan pembentukan HA. Rasio ini secara signifikan
lebih tinggi untuk sel yang tumbuh pada substrat yang dimodifikasi silikatin / biosilika dibandingkan
untuk sel pada kaca penutup yang dilapisi Ca-P atau slip kaca biasa. Karenanya, kami mengusulkan
bahwa rasio parameter yang ditentukan secara in vitrodeterminasi mencerminkan efek osteogenik
dari substrat yang berbeda pada sel pembentuk tulang. Akhirnya, analisis qRTPCR menunjukkan
bahwa pertumbuhan sel SaOS-2 pada matriks silikatin / biosilika diatur lebih tinggi. BMP2 (tulang
morfogenetik protein 2, penginduksi pembentukan tulang) ekspresi. Sebaliknya, (ekspresi asam
fosfatase yang resisten tartrat, modulator resorpsi tulang) tetap tidak terpengaruh. Kami
menyimpulkan bahwa biosilica menunjukkan osteogenisitas yang nyata secara in vitro, yang
membuat bahan ini memenuhi syarat untuk studi penggantian tulang juga in vivo.

PENDAHULUAN

Sejak studi penting Carlisle [1] dan Schwarz dan Milne [2], efek silikon (Si) dan silikat pada
pembentukan tulang dan perbaikan tulang telah terbukti. Para penulis ini melaporkan bahwa
defisiensi Si menghasilkan pembentukan tulang yang abnormal, sedangkan suplementasi nutrisi
dengan komponen anorganik meningkatkan pembentukan tulang. Si dan asam ortosilikat [Si (OH)4]
dapat membentuk senyawa '' organosilicon '' secara in vivo karena kemampuan Si untuk membentuk
senyawa kompleks dalam keadaan lima dan enam terkoordinasi dengan alkil diol [3, 4]. Si dan asam
silikat memasuki metabolisme hewan melalui saluran pencernaan dan diekskresikan melalui ginjal
[ditinjau dalam 5]. Jika 31 Silikat berlabel Si, pelacak radio untuk studi Si di biosystems, disuntikkan
ke tikus, akumulasi tertinggi terlihat di tulang, kulit, dan otot tetapi tidak di otak [6] dan hanya pada
tingkat yang sangat rendah di jaringan lunak [5]. Dalam jaringan lunak, Si dikomplekskan menjadi
glikosaminoglikan, poliuronida, atau polisakarida dan protein pengikat asam silikat [7]. Berdasarkan
data ini, kebutuhan nutrisi Si telah diusulkan untuk pembentukan tulang dan tulang rawan
glikosaminoglikan selama perkembangan jaringan embrionik mesenkim dan tahap awal kalsifikasi [8,
9]. Namun, karena penyerapannya yang rendah di usus dan kegunaan yang terbatas dalam
metabolisme perantara, mineral silikon memiliki kepentingan nutrisi yang kecil [10].

Di antara hewan multiseluler (Metazoa), spons mengandung silika adalah unik karena
kerangka mereka tidak terdiri dari biominerals berbasis kalsium tetapi dari polimer anorganik
bersilika — poli (silikat) [ditinjau di 11, 12]. Dalam spons, poli (silikat) dihasilkan secara enzimatis
oleh enzim silikatin [13, 14] dan, karenanya, telah disebut '' biosilica '' (silika biogenous). Karena
biosilika adalah amorf, ia berbeda dari bentuk kristal silika [15], yang dikenal sebagai
menyebabkangangguan imunohistopatologi dan respons otomatis, yang imunmengarah ke ''
silikonosis / silikosis '' [ditinjau di 16]. Selain itu, biosilika berbeda dari senyawa silikon organik
karena senyawa silikon organik mengandung ikatan karbon-silikon, yang tidak terjadi secara alami.
Organosilicons biasanya digunakan di klinik sebagai implan (payudara), dan telah disarankan bahwa
mereka berkontribusi pada etiologi penyakit rematik [ditinjau di17].

Sejauh ini, hanya sedikit analisis dari dugaan efek osteogenik biosilika pada hewan dengan
kerangka berbasis Ca telah dilakukan. Sebelumnya, peningkatan deposisi hidroksiapatit (HA) diamati
pada sel SaOS-2 yang telah ditumbuhkan pada matriks biosilika [18]. Dalam studi yang berbeda,
ekspresi yang diatur oleh biosilika dari protein amelogenin dan enamelin, keduanya terlibat dalam
pembentukan enamel, diselidiki pada sel SaOS-2 [19]. Dalam penelitian ini kami menyelidiki efek
biosilika baik pada proliferasi sel SaOS-2 dan pada pembentukan / morfologi kristal HA. Secara
umum, kedua parameter tersebut dianggap sebagai penanda yang dapat diandalkan dari proses
osteoinduksi yang sedang berlangsung [20, 21]. SaOS-2 (sarcoma osteogenic) adalah garis sel
nontransformed berasal dari sel osteosarcoma primer yang dapat berdiferensiasi [22,23].
Diferensiasi osteoblas membutuhkan ekspresi protein morfogenetik tulang 2 (BMP2) [24-26]. Sitokin
ini, anggota dari faktor pertumbuhan transformasi-b (TGFb) superfamili, menginduksi pembentukan
tulang dan regenerasi dan memainkan peran penting selama perkembangan embrio awal vertebrata
[27]. Asam fosfatase tahan tartrat (.) diekspresikan pada level rendah dalam sel SaOS-2 [28]. . adalah
modulator resorpsi tulang, dan peningkatan ekspresinya dikaitkan dengan osteoporosis,
osteoklastoma, dan penyakit metabolik tulang [29, 30].

Dalam penelitian ini kami menunjukkan bahwa budidaya sel SaOS-2 pada substrat biosilika
merangsang aktivitas osteogenik seperti yang terlihat pada pembentukan dan sel HA yang
ditingkatkan. proliferasi. Secara bersamaan,BMP2 ekspresi ditingkatkan, sedangkan . ekspresi tetap
tidak terpengaruh.

BAHAN DAN METODE

BAHAN

Tetraethoxysilane (TEOS) diperoleh dari SigmaAldrich (Taufkirchen, Jerman), media McCoy dari
Biochrom (Berlin, Jerman), serum janin sapi (FCS) dari Invitrogen (Karlsruhe, Jerman), alizarin red S /
8GX dari Fluka / Sigma -Aldrich (Taufkirchen, Jerman), dan Biocoat Osteologic coverlips berasal dari
Becton Dickinson (Heidelberg, Jerman).

METODE

1) Kultur Sel dengan Penutup atau Irisan Tulang yang Dilapisi Ca – P

Sel SaOS-2 (sel sarkoma osteogenik manusia [31]) dibiakkan dalam media McCoy yang
dilengkapi dengan 15% FCS yang diinaktivasi panas, 2 mM L-glutamin, dan 50 lg / ml
gentamisin dalam 25-cm2fl bertanya atau di piring 24-lubang (Orange Scienti fi que, Braine-
 l'Alleud, Belgia) di tempat yang dilembabkan inkubator pada 37 C dan 5% CO2seperti yang
dijelaskan sebelumnya [19 ].
Untuk percobaan, sel-sel diunggulkan ke penutup selubung Ca-P (BioCoat Osteologic
coverslips) yang telah dirancang untuk membudidayakan sel osteoblas dan osteoklas in vitro
[32 ]. Sebagai alternatif, sel ditanam pada permukaan bagian tulang kelinci femora
(100lketebalan m). Irisan dicuci dengan fosfat buffered saline (PBS) dan diinkubasi dalam 100
mM buffer Tris-HCl (pH 7,4, 6 M guanidine-HCl) selama 72 jam (4 C), seperti yang dijelaskan
[33]. Selanjutnya, mereka berturut-turut diperlakukan dengan 5% hidrogen peroksida (60
menit, 4C) dan 1,2 M HCl (20 menit, 4 C) untuk menghilangkan semua bahan organik [34].
Akhirnya, irisan dicuci dengan PBS selama 12 jam. Secara rutin, 5 9 104 Sel SaOS-2
diunggulkan ke bagian tulang atau penutup tulang Osteologic di 24-well plate, dengan
volume akhir 2,5 ml. Untuk menyelidiki pembentukan HA, sel SaOS-2 diinkubasi dengan
media McCoy yang dilengkapi dengan 15% FCS, 50.lM asam askorbat, 10 nM deksametason,
dan 5 mM b-gliserofosfat, seperti yang dijelaskan [19].

2) Ekspresi Rekombinan Glu-Tagged Silicatein-Sebuah

Pembuatan asam glutamat rekombinan (Glu) bertanda silikat Sebuah dijelaskan baru-baru
ini [35]. Singkatnya, konstruksi pBAD / gIII A digunakan, yang mengkodekan silikat matang (A
A115 ke aa330dari silikatSebuah dari spons Suberites domuncula, Nomor akses NCBI
AC03737.1), diikat dalam bingkai dengan urutan N-terminal, mengkodekan delapan residu
Glu (Glu-tag), dan urutan C-terminal, mengkodekan enam residu-Nya (tag-Nya). Sementara
Glu-tag memberikan afinitas pengikatan ke HA, tag-His diperlukan untuk kromatografi
afinitas logam-amobil dari protein rekombinan. Mengikuti transformasi TOP10Escherichia
coli sel (Invitrogen), ekspresi protein rekombinan diinduksi oleh arabinose (0,2%) selama 24
jam. Selanjutnya, protein diekstraksi dan dimurnikan dengan Ni2? -Kromatografi afinitas
NTA. Untuk menginduksi refolding, protein rekombinan didialisis terhadap 100 volume
buffer refolding (0,7 ML-arginin, 5,0 mM EDTA, 0,1% [v / v] CHAPS, 10 mM glutathione, 1,0
mM glutathione disul fi de, pH 7,2) dan 1.000 volume buffer penyimpanan (1 9 PBS, luwes-
Diterangkan dengan 300 mM NaCl, 70 mM L-arginin, 1,0 mM EDTA, dan 7% [v / v] gliserol,
pH 7,2).

3) Sintesis Biosilika dengan Immobilized Glu-Tagged Silicatein

Irisan tulang dan penutup Osteologi berlapis Ca-P diinkubasi dalam pelat 24-sumur dengan
silikat berlabel Glu yang dilipat ulang (370 lg / ml PBS) selama 6 jam (20 C) dalam volume
akhir 2 ml. Kemudian, pelat dicuci dengan buffer Tris-HCl 50 mM (pH 7,4, 150 mM NaCl).
Pengikatan silikatin rekombinan dinilai dengan imunodeksi, menggunakan antibodi
antisilikat poliklonal (PoAb-aSilic [36], tidak ditampilkan). Kemudian irisan dan penutup
diinkubasi selama 6 jam (20 C) dengan larutan 200lM ortosilikat (TEOS yang telah dihidrolisis
sebelumnya [5 mMTEOS dicampurkan dalam Mrati 1: 3 dengan 1 mMHCl selama 30 menit
dan kemudian dinetralkan]) dalam 50 mM Tris-HCl (pH 7,4). Volume terakhir adalah 300ll /
baik. Menggunakan prosedur ini, 57± 11 lg biosilika di tes dengan irisan tulang (53 ± 14 lg
biosilika dalam pengujian dengan penutup penutup) disintesis di setiap sumur dari pelat 24
sumur, sebagaimana ditentukan oleh Kit Uji Kolorimetri Uji Silikon [13, 14]. Sebagai controls,
baik potongan tulang yang tidak dilapisi, penutup yang dilapisi Ca-P tanpa enzim yang
diimobilisasi, atau penutup kaca biasa (12 mm; Alat Biosains, San Diego, CA) digunakan.

4) Mineralisasi oleh SaOS-2 Sel In Vitro

 Sel SaOS-2 (5 9 104) diunggulkan pada kaca penutup Ca-P silikatin / biosilikako, penutup
penutup Ca-P yang tidak dilapisi, atau penutup penutup kaca biasa. Untuk menginduksi
mineralisasi, sel diinkubasi hingga 7 hari dalam media McCoy (mengandung 15% FCS, 50lM
asam askorbat, 10 nM deksametason, dan 5 mM b-gliserofosfat) [18]. Selanjutnya, sel-sel
diperbaiki dan diwarnai dengan 10% alizarin red S, seperti yang dijelaskan [18]. Untuk
menentukan secara kuantitatif jumlah alizarin merah S terikat ke HA, prosedur dijelaskan
oleh Gregory et al. [37] diterapkan. Singkatnya, slip dengan sel SaOS-2 direndam dalam asam
asetat. Kemudian, sel dihapus secara mekanis dan menjadi pelet. Setelah itu, supernatan
ditambah dengan amonium hidroksida untuk menetralkan asam dan massa jenis optik
terbaca pada 405 nm. Tahi lalat alizarin merah S ditentukan setelah menghasilkan kurva
kalibrasi. Nilai dinormalisasi ke jumlah total DNA yang telah diukur dalam kultur paralel,
menggunakan pendekatan PicoGreen [18]. DNA timus betis digunakan sebagai standar.

5) Proliferasi Sel SaOS-2 / [3H] Uji Penggabungan Deoxythymidine

Sejalan dengan uji mineralisasi / pewarnaan alizarin merah S, [3H] deoksitimidin ([3H] dT)
penggabungan assay digunakan untuk menentukan sintesis DNA dari sel SaOS-2, mengikuti
prosedur yang dijelaskan [38]. Jadi, 59 104 sel / sumur ditanam selama 1–7 hari di atas
penutup yang tidak dilapisi atau dilapisi biosilika di pelat 24 sumur di media McCoy
(mengandung 15% FCS, 50 lM asam askorbat, 10 nM deksametason, dan 5 mM b-
gliserofosfat) di 37 C / 5% CO2 dalam suasana lembab. Kemudian, 50ll dari [3H] dT (2.56 lCi
[64.720 Bq / ml) ditambahkan. Setelah 12 jam inkubasi dan langkah pembekuan berikutnya
pada -70 C, DNA berlabel radiolabel dipanen ke atas alas penyaring serat kaca dengan Cell
Harvester otomatis (Inotech Biosystems International, Lansing, MI). Akhirnya, penggabungan
[3H] dT menjadi DNA diukur dengan Scintillation Counter (Perkin-Elmer, Rodgau, Jerman).

6) Memindai Mikroskopi Elektron dan Spektroskopi Sinar-X Dispersif Energi

Untuk pemindaian mikroskop elektron (SEM), SU 8000 (Hitachi High-Technologies Europe,
Krefeld, Jerman) digunakan pada tegangan rendah (\ 1 kV, analisis permukaan organik dekat
permukaan) serta pada tegangan yang lebih tinggi ([1 kV) , analisis struktur morfologi
anorganik). Untuk pengamatan SEM, mode perlambatan berkas digunakan untuk
meningkatkan pemindaian [39]. Studi dilakukan dengan '' detektor atas, '' menyediakan
deteksi sinyal elektron sekunder yang sangat efisien. Selanjutnya, SEM digabungkan ke
detektor XFlash 5010, detektor sinar-X yang beroperasi sesuai dengan prinsip ruang
penyimpangan silikon. Oleh karena itu, sistem ini memungkinkan analisis unsur dan
karakterisasi kimia berbasis energi-dispersif sinar-X (EDX) secara simultan. Untuk SEM, mode
perlambatan berkas digunakan untuk meningkatkan pemindaian [39]. Spektrum energi
Bremsstrahlen diberikan di bawah spektrum elemen.

7) Analisis RT-PCR Kuantitatif Waktu Nyata

Sel SaOS-2 dipindahkan ke dalam pelat 24-sumur baik pada kaca penutup berlapis silikat /
biosilika atau Ca-P yang tidak dilapisi atau pada penutup kaca. Setelah inkubasi di media
McCoy (ditambah dengan 15% FCS, 50lM askorbat asam, deksametason 10 nM, dan 5 mM b-
gliserofos-phate) selama 1–7 hari, sel dipanen dan total RNA diekstraksi seperti yang
dijelaskan [40]. Untuk menghilangkan kemungkinan kontaminasi DNA, sampel (5lg)
diperlakukan dengan 1 U DNAse dalam buffer RT (Promega, Mannheim, Jerman). CDNA
untai pertama disintesis menggunakan M-MLV reverse transcriptase (RT) (Promega). Setiap
reaksi (40ll) berisi sekitar 5 lg dari total RNA, 0,5 mM dNTPs, 100 pmol oligo (dT)18, dan 400
U RT masuk Buffer RT. Setelah inkubasi (42 C selama 1 jam), RT itu tidak aktif (65 C, 15
 menit). Eksperimen kuantitatif real-time PCR (qPCR) dilakukan di iCycler (BioRad, Hercules,
CA), menggunakan pengenceran serial 1/10 dalam rangkap tiga, seperti yang dijelaskan [41,
42]. Kemudian, masing-masing campuran reaksi diencerkan sesuai kebutuhan dan
pengenceran yang sesuai digunakan sebagai template untuk 30-ll pengujian qPCR. Reaksi
tersebut mengandung campuran master Absolute Blue SYBR Green (ABgene, Hamburg,
Jerman) dan 5 pmol dari masing-masing primer. Semua reaksi dijalankan dengan denaturasi
awal pada 95 C selama 3 menit, diikuti oleh 40 siklus, masing-masing dengan 95 C selama 20
detik, 58 C selama 20 detik, 72 C selama 20 detik, dan 80 C selama 20 detik. Data fluoresensi
dikumpulkan pada langkah 80OC. Primer berikut digunakan untuk amplifikasi: untuk gen
housekeepingGAPDH (gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase, nomor aksesi GenBank
NM_002046.3),

HASIL DAN PEMBAHASAN

1) Pelapisan HA Tulang dengan Silicatein / Biosilica

Bone HA diinkubasi secara berurutan dengan rekombinan Glu-tag silikatin-Sebuah dan 200
lM ortosilikat. Sampel HA tulang yang tidak dimodifikasi menampilkan permukaan
terstruktur mikro dan nanopori (Gbr.1A, B). Namun, setelah imobilisasi silikat bertanda Glu-
Sebuah dan inkubasi selanjutnya dengan ortosilikat, lapisan halus biosilika skala nano
terbentuk pada permukaan HA (ketebalan 50–150 nm, Gambar. 1C, D). Analisis EDX dari HA
yang dilapisi menunjukkan sinyal yang kuat dari Si dan O, yang berasal dari lapisan biosilika,
sedangkan sinyal yang lebih lemah dari Ca dan P disebabkan oleh HA tulang (Gbr.1E,
spektrum direkam dalam mode profil-spot). Secara berbeda, spektrum EDX dari bahan
tulang yang tidak dilapisi tidak memiliki puncak Si (tidak diperlihatkan).

Gambar 1 Pelapisan HA tulang dengan biosilika: analisis SEM.A, B HA tulang yang tidak
dilapisi dengan mikro dan struktur nano di permukaannya (b). C, D Silikat dengan label-
lemSebuah diimobilisasi pada tulang HA dan kemudian diinkubasi dengan ortosilikat. Proses
 ini menghasilkan lapisan permukaan biosilika yang halus (bs). E Spektrum EDX yang diambil
dari area berlapis biosilika D (kemas), menunjukkan puncak dominan untuk Si dan O.
Spektrum yang berasal dari Bremsstrahlen diberi warna abu-abu. SEBUAH-D 5 Kv

2) Pertumbuhan Sel SaOS-2 pada Matriks Bersalut Silikat / Biosilika

Sel SaOS-2 ditumbuhkan pada bagian tulang HA yang telah dilapisi dengan silikatin / biosilika
atau tetap tidak dilapisi (kontrol). Untuk merangsang mineralisasi, sel dibudidayakan dalam
media yang mengandung asam askorbat, deksametason, dan b-gliserofosfat, menurut
Müller et al. [19]. Setelah 5 hari, sel kontrol menunjukkan hanya beberapa tanda
mineralisasi, yaitu, kadang-kadang kelompok batang HA kecil, kira-kira berukuran 20-50 nm
(Gbr.2 SEBUAH). Sebaliknya, sel yang tumbuh pada HA berlapis silikat / biosilika sering
menunjukkan kelompok batang dan nodul HA (Gbr.2C, D). Nodul [1 lberukuran m muncul
dari kelompok sel, terdiri dari tiga sampai delapan sel tunggal (Gbr. 2B). Kadang-kadang,
nodul HA diatur dalam susunan longitudinal (Gbr.2E) atau bintik-bintik bola (Gbr. 2F).

3) Struktur Halus Kristal HA dari Sel SaOS-2

Sel SaOS-2 yang dibudidayakan selama 5 hari dalam media yang mengandung asam
askorbat, deksametason, dan b-glycero- fosfat menampilkan permukaan berlobus (Gbr. 3).

Gambar 2 Pembentukan nodul HA oleh sel SaOS-2 pada tulang HA. Sel ditanam di media
McCoy yang dilengkapi dengan FCS, asam askorbat, deksametason, danb-
gliserofosfat.SEBUAHSel kontrol (c) dibudidayakan pada tulang HA yang tidak dirawat.
Setelah 5 hari, beberapa nodul HA terdeteksi.B-F Sel (c) tumbuh di tulang silikat /
biosilicacoated HA membentuk nodul HA (tidak) selama masa inkubasi yang sama (5
hari).BKelompok sel tampaknya berkontribusi pada pembentukan nodul HA. C-F Pembesaran
yang lebih tinggi menunjukkan bahwa nodul tersusun secara longitudinal (E) atau secara
bola (F). SEBUAH-F 0,5 kV
 Gambar 3 Struktur halus dari nodul HA seperti prisma yang tersusun tidak teratur. Sel SaOS-
2 ditanam di media McCoy yang dilengkapi dengan asam askorbat, deksametason, danb-
gliserofosfat selama 5 hari. SEBUAH Permukaan sel (c) tidak dalam proses pembentukan
nodul menunjukkan morfologi berlobus. B Beberapa sel (c, biasanya
tiga hingga delapan) berpartisipasi dalam pembentukan satu bintil (tidak).

C-F Tahapan yang berbeda dari pembentukan nodul HA. C, D Awalnya, sel membungkus
sebagian besar nodul yang tumbuh. E, F Pada tahap selanjutnya, sebagian besar nodul
terbuka dan tonjolan sel telah ditarik kembali. G, H Nodul HA pada perbesaran yang lebih
tinggi, menampilkan organisasi nanorod seperti prisma. SEBUAH-F 0,5 kV; G, H 10 kV nodul
yang dibentuk oleh sel SaOS-2 tetap sebagian tertanam dalam proses sel, yang
mengangkatnya ke atas tubuh seluler (Gbr. 3B). Analisis HR-SEM menunjukkan bahwa
beberapa sel berkontribusi pada pembentukan nodul (Gambar.3C – F). Selain itu, mereka
menunjukkan tonjolan sel, menutupi sebagian besar nodul yang tumbuh (Gbr.3C, D).
Kemudian selama pembentukan nodul, proses sel ditarik kembali dan dilepaskan (sebagian)
nodul (Gambar. 3E, F). Pada perbesaran yang lebih tinggi, nodul dapat dilihat terdiri dari
nanoroda seperti prisma yang tersusun tidak teratur (Gbr.3G, H).

4) Aktivitas Biomineralisasi Sel SaOS-2

Untuk mengukur pembentukan HA, sel SaOS-2 dibudidayakan dalam medium McCoy
(mengandung asam askorbat, deksametason,
 Gambar 4 Pembentukan HA sel SaOS-2 yang dibudidayakan pada kaca penutup Ca-P yang
dilapisi silikatin / biosilika. Sel dibudidayakan selama 1–7 hari dalam medium McCoy
(mengandung asam askorbat, deksametason, dan b-gliserofosfat), seperti yang ditunjukkan
(panel kiri). Diskus di mana sel-sel telah tumbuh selama 1–7 hari diwarnai dengan alizarin
red S (Al-R) untuk menilai sejauh mana pembentukan HA. Panel kanan Sel itu diwarnai
setelah 3 (gambar atas) atau 7 (gambar bawah) budaya hari, divisualisasikan dengan
mikroskop cahaya yang dipantulkan danb-gliserofosfat) selama 1–7 hari pada tutupan Ca-P
yang telah dilapisi dengan silikat / biosilika atau tetap tidak dilapisi (kontrol).

Sebagai kontrol lebih lanjut, sel diunggulkan pada penutup kaca polos. Selanjutnya, HA terbentuk
diwarnai dengan alizarin merah S. Setelah inkubasi sel SaOS-2 pada biosilicacoatedCa-Pcoverslips
selama 1 hari, hanya pewarnaan samar yang terlihat, yang, bagaimanapun, secara progresif
diintensifkan menjadi merah tua selama budidaya berkepanjangan sampai hari ke 7 (Gbr.4, panel
kiri). Pemeriksaan mikroskopis serentak menunjukkan pewarnaan heterogen setelah 3 hari yang
menjadi lebih padat setelah 7 hari (Gbr.4, panel kanan). Selanjutnya, analisis EDX dilakukan untuk
menilai komposisi unsur dari nodul yang dibentuk oleh 2 sel. Mengikuti elektron inspeksi
Osmicroscopic (Ara. 5SEBUAH), dua spektrum direkam, dengan fokus baik di sel sekitar bintil itu
(Gbr. 5B, spektrum 1, kontrol) atau langsung pada satu bintil (Gbr. 5B, spektrum 2). Pada spektrum
sebelumnya, Ca atau P tidak terdeteksi tetapi Si, O, C, Mg, dan Na berasal dari kedua sel dan lapisan
biosilika substrat. Pada spektrum terakhir, puncak tambahan Ca dan P terdeteksi, yang menunjukkan
adanya HA.

Untuk mengukur pembentukan HA, sel yang diwarnai dengan alizarin merah dipanen dan pewarna
dilepaskan. Setelah pengukuran spektroskopi densitas optik, jumlah alizarin merah S yang terikat ke
sel dinormalisasi dengan jumlah total DNA untuk memungkinkan perbandingan antara kultur dan uji.
Sampel yang selnya telah ditumbuhkan pada kaca penutup kaca polos hanya menunjukkan jumlah
yang rendah
Gambar 5 Analisis SEM dan EDX dari nodul HA dari sel SaOS-2. Sel ditanam dalam media mineralisasi
selama 7 hari di atas kaca penutup Ca-P yang dilapisi silikatin / biosilika. Kemudian satu spesimen
diinspeksi dengan SEM ( SEBUAH). Dalam gambar ini, dua area yang dianalisis oleh EDX ditunjukkan
dengan lingkaran. Spektrum 1, luas sel; spektrum 2, bintil (tidak).

B Analisis EDX yang sesuai. Spektrum 1, spektrum sel; spektrum 2, spektrum bintil.Area abu-abu
mewakili spektrum berasal dari Bremsstrahlen dari HA (Gbr. 6SEBUAH). Pada hari ke-1 jumlah
alizarin merah S yang terikat serendah 0,06 nmol /lg DNA dan meningkat menjadi 0,26 nmoles /lg
DNA setelah 7 hari. Demikian pula, setelah pertumbuhan SaOS-2 pada penutup penutup Ca-P, 0,07
nmol /l g DNA dihitung setelah hari pertama. Namun, setelah 7 hari, 0,32 nmol /lg DNA terdeteksi
(Gbr. 6B). Lebih lanjut lebih lanjut, sel-sel yang tumbuh pada penutup penutup Ca-P yang dilapisi
silikatin / biosilika memunculkan peningkatan yang lebih tinggi, dari 0,08 nmol /lg DNA (hari 1)
sampai 0,42 nmoles /lg DNA (hari 7) (Gbr. 6C).
Gambar 6 Korelasi antara aktivitas proliferasi dan pembentukan HA sel SaOS-2 yang dibudidayakan
pada matriks yang berbeda. Sel dibudidayakan dalam medium McCoy (mengandung asam askorbat,
deksametason, dan b-gliserofosfat) pada penutup kaca (SEBUAH), penutup Ca – P tidak dilapisi slip
(B), atau kaca penutup Ca – P berlapis silikatin / biosilika (C) untuk 1–7 hari.

Dalam kultur paralel, proliferasi sel ditentukan oleh [3H] dT penggabungan ke dalam DNA
(ditunjukkan dalam cpm /lg DNA) dan biomineralisasi dengan pewarnaan alizarin merah S pada HA
(diberikan dalam nmol /lg DNA). Nilai mewakili sarana (±SD) dari 10 percobaan terpisah masing-
masing (* P \0,05). Rasio dari dua parameter ([3 Penggabungan H] dT: ikatan S alizarin merah)
dihitung dan diusulkan untuk mencerminkan indeks osteogenik.

5) Penggabungan [3H] dT ke dalam Sel SaOS-2

Sel SaOS-2 diinkubasi pada substrat yang dilapisi atau tidak dilapisi (kaca penutup, penutup penutup
Ca-P yang tidak dilapisi, atau penutup penutup Ca-P yang dilapisi silikatin / biosilika) hingga 7 hari
dalam media yang mengandung asam askorbat, deksametason, dan b-gliserofosfat. Kemudian,
mereka dihadapkan pada [3H] dT selama 12 jam. Akhirnya, DNA radiolabeled dipanen dan
penggabungan [3H] dT ditentukan dalam penghitung kilau. Hitungan dinormalisasi ke jumlah total
DNA. Dalam ketiga pendekatan, tingkat penggabungan awal (setelah 1 hari) rendah (200-400 cpm
/lg DNA). Dalam kasus pendekatan kaca penutup, nilai ini tidak meningkat secara signifikan setelah
7 hari (\ 2.000 cpm /lg DNA, Gambar. 6). Namun, budidaya pada slide Ca-P yang tidak dilapisi
menghasilkan peningkatan yang signifikan [3H] dT penggabungan setelah 7 hari (4.800 cpm /lg DNA,
Gambar. 6B). Selain itu, substrat berlapis silikat / biosilika memunculkan respons yang lebih tinggi
dan lebih cepat (Gbr.6C). Jadi, setelah 3 hari 3.800 cpm /lg DNA dan setelah 5 hari 10.840 cpm /lg
DNA dihitung. Setelah periode itu, penggabungan menurun untuk 8.650 cpm /lg DNA (hari 7).

6) Indeks Osteogenik In Vitro

Indeks osteoinduktif telah didefinisikan oleh Adkisson et al. [20] sebagai rasio antara rate
[3Inkorporasi H] dT ke dalam DNA sel tulang (prekursor) secara in vitro (refleksi dari proliferasi sel)
dan perluasan pembentukan tulang / HA secara in vivo. Indeks berbasis bioassay in vitro / in vivo ini
berkorelasi baik dengan aktivitas osteoinduktif yang terlihat in vivo untuk biomaterial tertentu,
misalnya, matriks tulang terdemineralisasi [20]. Dalam studi ini, sebuah bioassay diperkenalkan
untuk mengukur indeks osteogenik in vitro (jangan disamakan dengan indeks osteoinduktif yang
diukur in vitro / in vivo [ 20]) dengan menghubungkan [3Laju penggabungan H] dT dengan
pembentukan HA sel SaOS-2. Dalam sel yang telah dibudidayakan pada penutup kaca, rasio 0,9
dihitung setelah budidaya selama 7 hari (Gbr.6 SEBUAH). Setelah waktu inkubasi yang sama, rasio
1.7 ditentukan untuk sel-sel yang tumbuh pada penutup penutup Ca-P yang tidak dilapisi (Gbr. 6B).
Sebagai perbandingan, pertumbuhan pada kaca penutup Ca-P yang dilapisi silikatin / biosilika
memunculkan indeks osteogenik yang secara signifikan bergeser ke arah aktivitas proliferatif,
dengan 3.1 (hari ke-3), 4.6 (hari ke-5), dan 3,3 (hari ke-7) (Gbr.6C).

7) Ekspresi Diferensial Bergantung pada Substrat BMP2 an . di Sel SaOS-2

Sel SaOS-2 diinkubasi dalam media mineralisasi (media McCoy dengan asam askorbat,
deksametason, b-gliserofosfat) selama 1–7 hari, pada kaca penutup Ca-P yang dilapisi silikatin /
biosilika, penutup penutup Ca-P yang tidak diberi perlakuan, atau penutup kaca. Kemudian, RNA
diekstraksi dan dilakukan analisis qRT-PCR untuk ditentukanBMP2 dan . ekspresi. Ekspresi gen
housekeepingGAPDH duludigunakan sebagai referensi. Tingkat ekspresi masing-masing BMP2 dan
pada hari ke-1, setelah transfer sel ke dalam media mineralisasi, diambil sebagai basis.

Fig. 7 Differential expression of BMP2 and TRAP in SaOS-2 cells grown on different matrices for the
indicated time. qRT-PCR was used to determine expression levels of BMP2, TRAP, and GAPDH
(housekeeping gene, used as reference for normalization). Filled bars represent BMP2 expression of
cells grown on silicatein/biosilicacoated Ca–P coverslips (black bars), on uncoated Ca–P coverslips
(dark gray), or on glass coverslips (light gray). Open bars (white) represent TRAP expression of cells
 that had been cultivated on biosilica-coated Ca–P coverslips. Standard errors of the means are
shown (n = 5 experiments per time point). * P\0.05

KESIMPULAN

Kesimpulannya data yang dirangkum di sini menunjukkan bahwa biosilika mengindusi dan
meningkatkanpembentukan nodul HA dalam SaOS2 secara in vitro. Oleh karena itu, biosilika
mungkin juga merupakan osteogenik in vitro. Dalam konteks ini, pendekatan pertama telah
mengeksplorasi potensi biomedis dari komposit baru yang terdiri dari silikatin dalam matriks yang
dapat dibentuk. Bahan substitusi tulang potensial ini berhasil digunakan untuk mengobati cacat
buatan pada kelinci betina yang menghasilkan pemulihan lengkap HA dan regenerasi tulang.
 PRAKTIK KLINIK BIOLOGI MOLEKULER
RESUME JURNAL

Nama : Lina Rahmawati

NPM : 5117041
Prodi : DIV Teknologi Laboratorium Medik

Judul Osteogenic Potential of Biosilica on Human Osteoblast-Like

(SaOS-2) Cells
Nama Jurnal LABORATORY INVESTIGATIONS
Penulis Matthias Wiens •Xiaohong Wang, Ute Schlobmacher, Ingo Lieberwirth,
Gunnar Glasser, Hiroshi Ushijima, Heinz C, Schröder, dan Werner EG
Müller
Tahun Terbit 2010
Halaman 512-524
Reviewer Lina Rahmawati
Tanggal Review 25 Mei 2021

REVIEW JURNAL
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menunjukkan bahwa budidaya sel SaOS-2
pada substrat biosilika merangsang aktivitas osteogenik seperti yang terlihat
pada pembentukan dan sel HA yang ditingkatkan. proliferasi. Secara
bersamaan,BMP2 ekspresi ditingkatkan, sedangkan . ekspresi tetap tidak
terpengaruh.

Pendahuluan Di antara hewan multiseluler (Metazoa), spons mengandung silika adalah

unik karena kerangka mereka tidak terdiri dari biominerals berbasis kalsium
tetapi dari polimer anorganik bersilika — poli (silikat). Dalam spons, poli
(silikat) dihasilkan secara enzimatis oleh enzim silikatin dan, karenanya,
telah disebut '' biosilica '' (silika biogenous). Karena biosilika adalah amorf,
ia berbeda dari bentuk kristal silika, yang dikenal sebagai
menyebabkangangguan imunohistopatologi dan respons otomatis, yang
imunmengarah ke '' silikonosis / silikosis ''. Selain itu, biosilika berbeda dari
senyawa silikon organik karena senyawa silikon organik mengandung ikatan
karbon-silikon, yang tidak terjadi secara alami. Organosilicons biasanya
digunakan di klinik sebagai implan (payudara), dan telah disarankan bahwa
mereka berkontribusi pada etiologi penyakit rematik.

Sejauh ini, hanya sedikit analisis dari dugaan efek osteogenik biosilika pada
 hewan dengan kerangka berbasis Ca telah dilakukan. Sebelumnya,
peningkatan deposisi hidroksiapatit (HA) diamati pada sel SaOS-2 yang telah
ditumbuhkan pada matriks biosilika. Dalam studi yang berbeda, ekspresi
yang diatur oleh biosilika dari protein amelogenin dan enamelin, keduanya
terlibat dalam pembentukan enamel, diselidiki pada sel SaOS-2. Dalam
penelitian ini kami menyelidiki efek biosilika baik pada proliferasi sel SaOS-
2 dan pada pembentukan / morfologi kristal HA. Secara umum, kedua
parameter tersebut dianggap sebagai penanda yang dapat diandalkan dari
proses osteoinduksi yang sedang berlangsung. SaOS-2 (sarcoma osteogenic)
adalah garis sel nontransformed berasal dari sel osteosarcoma primer yang
dapat berdiferensiasi. Diferensiasi osteoblas membutuhkan ekspresi protein
morfogenetik tulang 2 (BMP2). Sitokin ini, anggota dari faktor pertumbuhan
transformasi-b (TGFb) superfamili, menginduksi pembentukan tulang dan
regenerasi dan memainkan peran penting selama perkembangan embrio awal
vertebrata. Asam fosfatase tahan tartrat diekspresikan pada level rendah
dalam sel SaOS-2 adalah modulator resorpsi tulang, dan peningkatan
ekspresinya dikaitkan dengan osteoporosis, osteoklastoma, dan penyakit
metabolik tulang.

Dalam penelitian ini kami menunjukkan bahwa budidaya sel SaOS-2 pada
substrat biosilika merangsang aktivitas osteogenik seperti yang terlihat pada
pembentukan dan sel HA yang ditingkatkan. proliferasi. Secara
bersamaan,BMP2 ekspresi ditingkatkan, sedangkan . ekspresi tetap tidak
terpengaruh.

Pembahasan Pembentukan tulang adalah hasil dari biokimiawi yang sangat kompleks
proses yang didorong oleh interaksi yang disetel antara perancah
biodegradable dan sitokin / faktor pertumbuhan. Sedangkan yang pertama
terdiri dari anorganik (HA) dan organik (kolagen dan tulang rawan) elemen
struktural yang rentan ke jalur metabolisme, yang terakhir memberikan
sinyal
diferensiasi sel progenitor (misalnya, osteoblas, osteoklas, atau kondrosit).
Kaskade biologis yang kompleks ini peristiwa dikendalikan oleh morfogen,
seperti BMP, memastikan keseimbangan dinamis / kondisi tunak struktur
organik / anorganik yang ada dan yang baru terbentuk elemen tulang. Itu
adalah tugas dan tantangan rekayasa tulang (jaringan) untuk
mengembangkan biomimetik bahan, cocok untuk regenerasi atau pelapis
tulang dengan potensi osteoinduktif dan osteokonduktif
.
Selama osteoinduksi, sel progenitor berdiferensiasi menjadi osteoblas dan
osteoklas dari sel induk hematopoietik. Sebaliknya, osteokonduksi
menggambarkan proses tulang pertumbuhan di permukaan dengan
mengarahkan sel ke pori-pori atau lainnya struktur permukaan; migrasi ini
dimediasi oleh osteogenic agen yang tergabung dalam matriks.

Biosilica adalah polimer yang tersusun dari nanopartikel dengan diameter

50-70 nm. Partikel sebesar itu mudah diambil oleh sel melalui endositosis.
Namun, hingga saat ini serapan dan kehadirannya hanya silika monomerik
(ortosilikat atau metasilikat) telah terbentuk dipelajari dalam sel eukariotik
(mungkin) karena kendala teknis. Berdasarkan data ini, tampaknya masuk
akal bahwa biosilica mengikat molekul SaOS-2 yang sejauh ini tidak
diketahui membran sel, sangat mungkin melalui ikatan ion / kompleks
interaksi. Dalam spons, biosilika dapat dihidrolisis menjadi ortosilikat /
metasilikat selama pergantian spikula oleh silikase (dalam S. domuncula),
enzim yang terkait dengan anhidrase karbonat di mana-mana. Sejak juga
metazoan karbonat anhidrase memiliki potensi (tereduksi) menjadi
menghidrolisis biosilika dan terjadi secara ekstraseluler, peneliti
mengusulkan degradasi enzimatik ekstraseluler biosilika. Produk degradasi,
ortosilikat, kemudian diambil oleh transporter sel SaOS-2 tertentu. Di S.
domuncula merupakan transporter asam silikat yang berbeda teridentifikasi.
Karena protein ini memiliki urutan yang signifikan kesamaan dengan
kotranspor natrium / bikarbonat (Na/HCO3), itu disebut asam natrium /
bikarbonat-silikat Na/ HCO3 - [Si (OH) 4] —transporter. Sedangkan di
spons silikat digunakan untuk sintesis biosilika intraseluler, dalam diatom
silikat diambil oleh transporter yang berbeda dan disimpan dalam keadaan
empat koordinat sebagai kental silikon, kemungkinan sol silika. Namun, di
kedua sistem, spons dan diatom, silikat merangsang proliferasi sel dan
mengontrol pertumbuhan melalui fase sel. Sedangkan beberapa penelitian
menunjukkan silika secara substansial memodulasi jalur berbeda yang
mengendalikan mamalia biomineralisasi / pembentukan tulang jalur
transduksi sinyal molekuler yang mendasari adalah tidak diketahui.
Ortosilikat diusulkan untuk berinteraksi dengan alkil diol gula dalam formasi
lima dan enam koordinat Kompleks Si oleh karena itu, kami menyarankan
 agar ortosilikat mengikat fosfatidylinositol, komponen dalam sitosol sisi
membran sel eukariotik dan pos pemeriksaan utama molekul, baik dalam
protein kinase C- dan dalam tirosin yang dimediasi jalur transduksi sinyal.

Kesimpulan Kesimpulannya data yang dirangkum di sini menunjukkan bahwa biosilika

mengindusi dan meningkatkanpembentukan nodul HA dalam SaOS2 secara
in vitro. Oleh karena itu, biosilika mungkin juga merupakan osteogenik in
vitro. Dalam konteks ini, pendekatan pertama telah mengeksplorasi potensi
biomedis dari komposit baru yang terdiri dari silikatin dalam matriks yang
dapat dibentuk. Bahan substitusi tulang potensial ini berhasil digunakan
untuk mengobati cacat buatan pada kelinci betina yang menghasilkan
pemulihan lengkap HA dan regenerasi tulang.