BAB III

METODOLOGI

3.1. Alat
Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, gelas kimia, beaker glass, rak tabung reaksi, pipet, pipet
mikro, rubber bulb dengan pipet ukur, spatula, gelas arloji, neraca analitik, corong, buret, statif,
kertas saring (bisa juga corong Büchner), penangah, pemanas, oven, vortex mixer, magnetic stirrer
atau pengaduk magnetik, spektrofotometri UV-vis, pH meter, dan tissue.
3.2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah asam amino dan protein berupa glisin, alanin, tirosin, triptofan, asam
glutamat, albumin, kasein, gelatin, dan pepton. Bahan lainnya berupa aquades, larutan etanol, larutan
eter, larutan kloroform, larutan fenol, pereaksi ninhidrin, reagen biuret dan buffer asetat pH 4,6.
Larutan asam yang digunakan berupa larutan HCl 0,1 M, larutan HNO 3 pekat, asam sulfus salisilat
(C7H6O3), asam pikrat (C6H3N3O7), dan asam trikloroasetat (C2HCl3O2). Larutan basa yang digunakan
berupa NaOH 0,1 M. Logam berat yang digunakan berupa timbal (II) asetat [Pb(C 2H3O2)2] dan
CuSO4. Bahan yang digunakan untuk isolasi protein adalah susu segar sebanyak 100 ml.
3.3. Metode Percobaan
3.3.1. Kelarutan Asam Amino
Padatan asam amino yang terdiri dari glisin, alanin, dan asam glutamat ditimbang masing-masing
sebanyak 0,1 gram. Padatan yang telah ditimbang lalu dituang ke dalam tabung reaksi dengan spatula.
Uji kelarutan padatan asam amino dilakukan dengan penggunaan aquades, HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M,
etanol, dan kloroform. Masing-masing larutan ditambahkan sebanyak 1 ml dengan pipet mikro. Larutan
yang telah ditambahkan lima pelarut tersebut kemudian dihomogenkan. Amati kelarutan padatan asam
amino dalam lima pelarut tersebut. Hasil percobaan menunjukkan bahwa glisin dalam aquades larut,
glisin dalam NaOH 0,1 M larut, glisin dalam HCL 0,1 M larut, glisin dalam etanol tidak larut, dan glisin
dalam kloroform tidak larut. Pada asam glutamat dalam aquades tidak larut, asam glutamat dalam NaOH
0,1 M sedikit larut, asam glutamat dalam HCl 0,1 M sedikit larut, asam glutamat dalam etanol tidak larut,
dan asam glutamat dalam kloroform tidak larut. Pada alanin dalam aquades larut, alanin dalam NaOH 0,1
M larut, alanin dalam HCl 0,1 M larut, alanin dalam etanol tidak larut, dan alanin dalam kloroform sedikit
larut.
3.3.2. Uji Ninhidrin
Larutan asam amino yang terdiri dari glisin, tirosin, triptofan, asam glutamat, dan kasein diambil
dengan pipet mikro sebanyak 1 ml dan dituang ke dalam masing-masing tabung reaksi. Tambahkan 1 ml
NaOH dengan pipet mikro ke dalam masing-masing tabung reaksi tersebut untuk menetralkan larutan.
Langkah selanjutnya adalah, pereaksi ninhidrin ditambahkan sebanyak lima tetes dengan pipet pada
masing-masing tabung reaksi dan dihomogenkan. Larutan dimasukkan ke dalam penangah untuk
dipanaskan selama 2 menit. Amati perubahan warna yang terbentuk pada masing-masing larutan dengan
latar belakang bewarna putih. Hasil percobaan menunjukkan bahwa larutan glisin berubah menjadi tidak
bewarna, larutan tirosin berubah menjadi tidak bewarna, larutan triptofan berubah menjadi agak
kekuningan, larutan asam glutamat berubah menjadi tidak bewarna, dan larutan kasein berubah menjadi
tidak bewarna.
3.3.3. Uji Xanthoprotein
Tambahkan 0,5 ml larutan asam amino yang terdiri dari glisin, tirosin, dan triptofan dengan pipet
ke dalam masing-masing tabung reaksi. Siapkan larutan fenol dan tambahkan dengan pipet mikro ke
dalam masing-masing tabung reaksi sebagai larutan pembanding. Masing-masing larutan kemudian
ditambahkan 0,5 ml HNO3 pekat melalui dinding-dinding tabung reaksi pada lemari asam-basa. Amati
perubahan warna yang terjadi pada masing-masing larutan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa glisin
tidak mengalami perubahan warna atau tidak bewarna, larutan tirosin berubah warna menjadi agak sedikit
kekuningan, dan larutan triptofan menunjukkan perubahan warna menjadi kuning. Langkah selanjutnya
adalah ditambahkan larutan NaOH sebanyak 1 ml, sebagai larutan pemberi suasana basa pada masing-
masing larutan uji. Homogenkan masing-masing larutan tersebut. Amati perubahan warna yang terjadi,
larutan fenol diperlukan sebagai larutan pembanding. Hasil percobaan menunjukkan bahwa larutan glisin
dan tirosin tidak bewarna sedangkan larutan triptofan berubah warna menjadi jingga.
3.3.4. Uji Biuret
Siapkan larutan kasein, gelatin, dan pepton sebanyak 2 ml pada masing-masing tabung reaksi.
Tambahkan Cu2SO4 sebanyak 2 ml dengan pipet ukur yang dihubungkan dengan rubber bulb
pada masing-masing tabung reaksi. Larutan yang telah ditambahkan Cu 2SO4 kemudian
dihomogenkan. Amati perubahan warna yang terjadi pada masing-masing larutan dengan latar
belakang warna putih. Hasil percobaan menunjukkan bahwa larutan gelatin berubah warna
menjadi biru bening, larutan kasein berubah warna menjadi biru keruh, larutan pepton berubah
warna menjadi biru agak keruh. Langkah selanjutnya adalah ditambahkan NaOH sebanyak 2 ml
dengan pipet ukur yang dihubungkan dengan rubber bulb pada masing-masing tabung reaksi.
Larutan yang telah ditambahkan kemudian dihomogenkan. Amati perubahan warna yang terjadi
pada masing-masing tabung reaksi dengan latar belakang bewarna putih. Hasil percobaan
menunjukkan bahwa larutan gelatin berubah warna menjadi biru keunguan, larutan kasein
berubah warna menjadi biru sedikit keunguan, dan larutan pepton berubah warna menjadi biru
keunguan.
3.3.5. Uji Denaturasi Protein oleh Panas dan pH Ekstrem
Tambahkan larutan protein yang terdiri dari albumin, kasein, gelatin, dan pepton sebanyak 5 ml
pada masing-masing tabung reaksi. Letakkan keempat larutan tersebut ke dalam lemari asam-
basa. Larutan HNO3 pekat ditambahkan sebanyak 0,5 ml dengan pipet mikro ke setiap tabung
reaksi. Amati perubahan yang terjadi pada setiap larutan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa
larutan albumin menghasilkan banyak endapan, larutan kasein menghasilkan sedikit endapan,
larutan gelatin bewarna bening tanpa ada endapan, dan larutan pepton bewarna agak sedikit keruh
tanpa ada endapan. Langkah selanjutnya adalah ditambahkan larutan NaOH sebanyak 0,5 ml
dengan pipet mikro pada masing-masing tabung reaksi. Pindahkan larutan tersebut ke dalam
lemari asam-basa kembali. Tambahkan larutan HCl sebanyak 0,5 ml ke setiap tabung reaksi dan
tambahkan juga larutan HNO 3 sebanyak 0,5 ml pada tabung reaksi dengan larutan protein yang
sama. Larutan tersebut kemudian dipindahkan ke dalam penangah untuk dipanaskan selama ± 10
menit. Amati hasil uji pH ekstrem pada penambahan NaOH. Hasil percobaan menunjukkan
bahwa larutan pepton berubah menjadi tidak keruh, larutan kasein berubah menjadi tidak keruh,
larutan albumin berubah menjadi sedikit keruh, dan larutan gelatin berubah menjadi bening.
Amati hasil uji pH ekstrem pada penambahan HNO 3. Hasil percobaan menunjukkan larutan
albumin berubah menjadi kuning, larutan kasein berubah menjadi sedikit kuning, larutan gelatin
berubah menjadi bening, dan larutan pepton berubah menjadi sedikit kuning. hasil uji pH ekstrem
pada penambahan HCl. Hasil percobaan menunjukkan bahwa larutan gelatin berubah warna
menjadi bening, larutan kasein berubah warna menjadi bening, larutan albumin berubah warna
menjadi keruh, dan larutan pepton berubah warna menjadi sedikit keruh.
3.3.6. Pengendapan Protein dengan Logam Berat
Siapkan larutan protein yang terdiri dari albumin, gelatin, kasein dan pepton sebanyak 2 ml
dengan pipet pada masing-masing tabung reaksi. Tambahkan logam berat timbal (II) asetat
[Pb(C2H3O2)2] sebanyak lima tetes dengan pipet. Homogenkan larutan tersebut. Amati perubahan
yang terjadi pada setiap larutan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa larutan albumin berubah
menjadi sangat keruh, larutan gelatin berubah menjadi tidak keruh, larutan kasein berubah
menjadi keruh, dan larutan pepton berubah menjadi sedikit keruh. Langkah selanjutnya dilakukan
uji penambahan logam berat CuSO 4 sebanyak 5 tetes dengan pipet pada masing-masing tabung
reaksi yang berisi larutan protein yang sama seperti sebelumnya. Setiap larutan tersebut
dihomogenkan. Amati perubahan yang terjadi pada setiap larutan. Hasil percobaan menunjukkan
bahwa larutan albumin berubah menjadi keruh, larutan gelatin berubah menjadi bening, larutan
kasein berubah menjadi biru tua bening, dan larutan pepton berubah menjadi biru muda bening.
3.3.7. Pengendapan Protein oleh Asam
Siapkan larutan protein yang terdiri dari albumin, kasein, gelatin, dan pepton sebanyak 2 ml pada
masing-masing tabung reaksi. Uji pengendapan protein oleh asam dilakukan dengan tiga larutan
asam yang berbeda yaitu asam sulfus salisilat (C 7H6O3), asam pikrat (C6H3N3O7), dan asam
trikloroasetat (C2HCl3O2). Tambahkan ketiga larutan asam tersebut sebanyak lima tetes dengan
pipet ke setiap tabung reaksi. Homogenkan masing-masing larutan setelah ditambahkan larutan
asam. Amati perubahan yang terjadi pada larutan. Hasil percobaan dengan penambahan asam
sulfus salisilat (C7H6O3) menunjukkan bahwa larutan albumin berubah menjadi bewarna putih
dan terdapat endapan, larutan kasein berubah menjadi bewarna putih dan terdapat endapan,
larutan gelatin berubah menjadi bewarna bening dan tidak terdapat endapan, dan larutan pepton
berubah menjadi bewarna keruh dan terdapat sedikit endapan. Hasil percobaan dengan
penambahan asam pikrat (C6H3N3O7) menunjukkan bahwa larutan albumin berubah menjadi
bewarna kuning dan terdapat endapan, larutan kasein berubah menjadi bewarna kuning dan tidak
terdapat endapan, larutan gelatin berubah menjadi bewarna kuning dan terdapat sedikit endapan,
dan larutan pepton berubah menjadi bewarna kuning dan terdapat sedikit endapan. Hasil
percobaan dengan penambahan asam trikloroasetat (C 2HCl3O2) menunjukkan bahwa larutan
albumin berubah menjadi bewarna putih dan terdapat endapan, larutan kasein berubah menjadi
bewarna putih dan terdapat endapan, larutan gelatin berubah menjadi bewarna bening dan
terdapat sedikit endapan, dan larutan pepton berubah menjadi bewarna keruh dan terdapat sedikit
endapan.
3.3.8. Penentuan Kadar Proten menggunakan Reagen Biuret
Siapkan larutan protein yang terdiri dari kasein dengan konsentrasi 1.000, 3.000, 5.000, 8.000,
dan 10.000 ppm sebanyak 1 ml pada masing-masing tabung reaksi. Siapkan juga larutan protein
lainnya berupa gelatin, albumin, kasein, dan pepton sebanyak 1 ml pada masing-masing tabung
reaksi. Tambahkan reagen biuret sebanyak 4 ml dengan rubber bulb yang dipasang di pipet ukur
ke setiap tabung reaksi. Masing-masing larutan diletakkan pada vortex mixer untuk
dihomogenkan larutan pada jumlah kecil sebelum diukur absorbansinya. Larutan yang telah
dihomgenkan dengan vortex mixer didiamkan selama ± 30 menit. Langkah selanjutnya adalah,
setiap larutan uji diukur absrobansinya dengan spektrofotometri UV-vis. Larutan blangko yang
digunakan adalah campuran aquades dan reagen biuret, komposisi larutan sama dengan sampel.
Absrobansi pertama yang diukur adalah larutan kasein dengan konsentrasi 1.000-10.000 ppm
 pada panjang gelombang 540 nm. Langkah pengukuran absorbansi ini juga dilakukan untuk
larutan protein lainnya yaitu pepton, albumin, dan gelatin pada panjang gelombang 540 nm.
3.3.9. Kurva Titrasi Asam-asam Amino
Proses berikutnya dilanjutkan dengan kurva titrasi asam-asam amino. Siapkan larutan protein
berupa asam glutamat, glisin, dan tirosin sebanyak 10 ml. Letakkan larutan protein pada beaker
glass yang nantinya akan dititrasi dengan larutan asam dan basa. Larutan asam yang digunakan
berupa HCl dan larutan basa berupa NaOH. Pengukuran pH dilakukan pada setiap larutan terlebih
dahulu sebelum dititrasi. Alat pH meter distandarisasi terlebih dahulu dengan penggunaan larutan
buffer. Apabila sudah distandarisasi maka dilanjutkan dengan pengukuran pH pada setiap larutan
uji. Pengukuran untuk pH awal dari larutan asam glutamat dilakukan. Sebelum titrasi dilakukan,
kondisikan buret dengan larutan yang akan digunakan. Larutan uji dituangkan secukupnya dalam
buret dan diputar-putar agar seluruh bagian dalam buret dilewati oleh larutan tersebut. Apabila
buret telah dikondisikan maka dipasangkan pada statif. Larutan titran dituangkan pada biuret
dengan bantuan corong. Masing-masing larutan protein dititrasi dengan setiap penambahan 1 ml
larutan titran diukur pH larutan tersebut dengan pH meter. Pengukuran pH meter dilakukan
hingga didapatkan pH yang sesuai dengan larutan. Perlakuan ini dilakukan pada semua sampel
larutan protein yang diujikan. Setiap pengukuran pH meter dilakukan, elektroda dicelupkan pada
aquades hingga menunjukkan pH 7 kemudian dikeringkan dengan tissue. Hal ini menandakan
bahwa pH meter dapat digunakan untuk larutan uji berikutnya.
3.3.10. Isolasi Kasein dari Susu
Siapkan 100 ml susu segar dalam gelas kimia lalu dihangatkan hingga suhunya mencapai 40 oC.
Susu yang telah hangat tersebut ditambahkan dengan buffer asetat pH 4,6 sebanyak 100 ml.
Penambahan dengan buffer tersebut dilakukan sambil diaduk dengan magnetic stirrer atau
pengaduk magnetik. Larutan susu yang telah ditambahkan buffer asetat diukur pH nya dengan
penggunaan pH meter hingga pH yang ditunjukkan adalah 4,8. Apabila telah diukur maka
didinginkan pada suhu ruangan selama 4-5 menit. Larutan suspensi yang telah didinginkan
selama 5 menit kemudian didekantasi. Dekantasi berfungsi sebagai proses pemisahan larutan
dengan padatan kasein. Endapan kasein yang diperoleh kemudian disuspensikan kembali dengan
30 ml etanol. Larutan suspensi disaring kembali dengan kertas saring agar padatan dan filtrat
terpisah. Penyaringan juga bisa dilakukan dengan corong Büchner agar proses penyaringan
berlangsung lebih cepat. Padatan kasein yang diperoleh dicuci dengan campuran etanol dan eter
dengan perbandingan 1:1 sebanyak 20 ml. Endapan kembali dicuci dengan 50 ml eter dan
dikeringkan. Pengeringan endapan dilakukan di dalam oven pada suhu 60 oC. Endapan kasein
yang kering ditimbang beratnya pada neraca analitik.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil
4.1.1. Kurva Titrasi Asam Amino
4.1.1.1 Kurva Titrasi Asam Glutamat + HCl
4.1.1.2 Kurva Titrasi Tirosin + HCl
4.1.1.3 Kurva Titrasi Tirosin + NaOH
4.1.2. Penentuan Kadar Protein Secara Biuret
4.1.3. Isolasi Kasein

4.2. Pembahasan
4.2.1. Uji Kelarutan
4.2.1.1. Analisa Prosedur
Padatan asam amino yang terdiri dari glisin, alanin, dan asam glutamat
digunakan sebagai larutan uji kelarutan asam amino. Pada uji ini digunakan aquades,
HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M, etanol, dan kloroform sebagai pelarut untuk mengetahui
kelarutan asam amino tersebut. Neraca analitik digunakan untuk alat ukur padatan
asam amino yang akan diuji, padatan tersebut diletakkan pada gelas arloji. Tabung
reaksi yang disiapkan digunakan sebagai tempat padatan asam amino akan diuji
kelarutannya.
Apabila padatan asam amino telah ditambahkan lima pelarut tersebut maka
dihomogenkan. Homogenisasi ini bertujuan untuk penyeragaman ukuran partikel
sehingga mempertahankan kestabilan dari sebuah campuran.
4.2.1.2. Analisa Hasil
4.2.2. Uji Ninhidrin
4.2.2.1. Analisa Prosedur
Tabung reaksi yang disiapkan digunakan sebagai tempat larutan karbohidrat
diuji, tabung tersebut diletakkan pada rak tabung reaksi. Larutan karbohidrat
yang digunakan untuk pengujian dalam membedakan monosakarida dan
disakarida terdiri dari glukosa, fruktosa, maltosa, laktosa, amilum, dan galaktosa.
Pipet mikro digunakan untuk memasukkan larutan pada tabung reaksi misal
ketika penambahan 2 mL reagen barfoed. Reagen barfoed terdiri dari larutan
yang mengandung kupri sulfat (CuSO4) dan asam asetat glasial (CH 3COOH).
Penambahan reagen barfoed akan menyebabkan terjadi proses reduksi pada ion
logam Cu2+ oleh gula monosakrida pereduksi lebih cepat dibandingkan dengan
disakarida. Oleh karena itu, akan terbentuk endapan Cu 2O bewarna merah bata.
Penangah digunakan sebagai tempat untuk memanaskan larutan ke dalam
pemanas.
Larutan asam amino yang terdiri dari glisin, tirosin, triptofan, asam glutamat, dan
kasein digunakan sebagai larutan uji yang akan ditentukan adanya asam amino bebas
atau tidak dalam larutannya.
 diambil dengan pipet mikro sebanyak 1 ml dan dituang ke dalam masing-masing
tabung reaksi. Tambahkan 1 ml NaOH dengan pipet mikro ke dalam masing-masing
tabung reaksi tersebut untuk menetralkan larutan. Langkah selanjutnya adalah,
pereaksi ninhidrin ditambahkan sebanyak lima tetes dengan pipet pada masing-
masing tabung reaksi dan dihomogenkan. Larutan dimasukkan ke dalam penangah
untuk dipanaskan selama 2 menit. Amati perubahan warna yang terbentuk pada
masing-masing larutan dengan latar belakang bewarna putih. Hasil percobaan
menunjukkan bahwa larutan glisin berubah menjadi tidak bewarna, larutan tirosin
berubah menjadi tidak bewarna, larutan triptofan berubah menjadi agak kekuningan,
larutan asam glutamat berubah menjadi tidak bewarna, dan larutan kasein berubah
menjadi tidak bewarna.

4.2.2.2. Analisa Hasil