TAMBAHAN

TEORY DAN SOAL

ALMAWATI SITUMORANG
JAWAB
MATERI SDS-PAGE

1
Apa yang dimaksud elektroforesis ?
 Elektroforesis adalah sebuah metode untuk
separasi atau pemisahan sebuah molekul
besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA
dll) dari campuran molekul yang serupa.

ALMAWATI SITUMORANG
 Elektroforesis digunakan untuk memisahkan
komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya
dalam sebuah medan listrik.
 Sebuah arus listrik dilewatkan melalui
medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan.
2
Apa yang dimaksud elektroforesis ?
 Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada
padamakromolekul, misalnya DNA yang
bermuatan negatif.

ALMAWATI SITUMORANG
 Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium (misal
agarosa), maka molekul tersebut akan
bergerak dari muatan negatif menuju muatan
positif.
 Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung
pada rasio muatan terhadap massanya dan
bentuk molekulnya (Yuwono,2008). 3
Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing-
masing!
Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas
dan Elektroforesis Gel.
1. Elektroforesis Kertas:
 merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari

ALMAWATI SITUMORANG
kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan
yang terlarut (terutama ion-ion kompleks)
sebagai fase gerak.
 Pemisahan tersebut terjadi karena adanya
gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung
pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan,
konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH,
viskositas, dan daya absopsi zat terlarut (Boyer, 4
2004).
Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing-
masing! Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis
Kertas dan Elektroforesis Gel.
2. Elektroforesis Gel:
 merupakan elektroforesis yang menggunakan gel
sebagai fasediam untuk memisahkan molekul-

ALMAWATI SITUMORANG
molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita
yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul
dengan panjang yang sama.
 Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan
suatu makro molekul dengan cara memberi gaya
pada makromolekul tersebut untuk melewati
medium berisi gel yang dibantu dengan tenaga
listrik.
5
Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing-
masing! Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis
Kertas dan Elektroforesis Gel.
2. Elektroforesis Gel………..
 Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah

ALMAWATI SITUMORANG
pengaruh medan listrik.
 Media atau gelyang dapat digunakan yaitu agarose
gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid gel
(elektroforesis protein).
 Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran
molekul,konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas
muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer
elektroforesis (Martin, 2006).
6
Apa fungsi SDS pada metode SDS-PAGE?

• SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik,

yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan
negatif dalam range pH yang luas.

ALMAWATI SITUMORANG
• Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE (SDS-
Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk
memberikan muatan negatif pada protein yang akan
dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein,
mempermudah menyamakan kondisi, dan
menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan).

• Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian

stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke
arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik
(Anam, 2009).
7
Apa fungsi akrilamid pada metode SDS-
PAGE?
 Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu
untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada
arus listrik.

ALMAWATI SITUMORANG
 Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan untuk
memisahkan molekul protein yang kecil.
 Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat
mempengaruhi migrasi protein.
 Pada proses pembuatan gel, akrilamid akan
berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen
(Prihanto, 2011).

8
APA TUJUAN ANALISIS PROTEIN DENGAN
METODE ELEKTROFORESIS?
 Tujuan analisis protein dengan metode
elektroforesis yaitu untuk memisahkan protein
berdasarkan berat molekul dengan menggunakan
matriks penyangga akrilamid.

ALMAWATI SITUMORANG
 Selain itu dengan elektroforesis akan diketahui jenis
protein dalam bahan atau sampel yang akan
dianalisis.
 Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan
digunakan sebagai metode pemisahan untuk
menentukan komponen dari protein (Wibowo, 2010).

9
Mengapa protein-protein tersebut dapat
terpisah?
 Protein-protein tersebut dapat terpisah
karena adanya proses separasi pada protein
memisahkan molekul-molekul protein

ALMAWATI SITUMORANG
menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri
atas molekul protein dengan panjang yang
sama.
 Protein dapat terpisah dengan cara memberi
gaya pada protein tersebut untuk melewati
medium berisi gel (poliakrilamid) yang
dibantu dengan adanya listrik. Protein yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium 10

berisi tenaga listrik.

Mengapa protein-protein tersebut
dapat terpisah?
 Molekul-molekul dari protein akan
bermigrasi menuju kutub positif atau

ALMAWATI SITUMORANG
kutub negatif berdasarkan muatan
yang terkandung di dalamnya.
 Pemisahan molekulprotein
berdasarkan pada tingkat migrasi dan
berat molekulnya dalam sebuah
medanlistrik (Wibowo, 2010).
11
BAGAIMANA CARA MENGATUR UKURAN
PORI GEL?
 Cara mengatur ukuran pori gel yaitu bergantung
pada konsentrasi gel akrilamid yang akan
digunakan dan cros-linker (bis).
 Semakin tinggi konsentrasi akrilamid maka

ALMAWATI SITUMORANG
diameter pori-pori di dalam gel akan semakin kecil,
sebaliknya jika konsentrasi akrilamid rendah
maka diameter pori-pori di dalam gel akan
semakin besar.
 Apabila protein berukuran besar atau memiliki
berat molekul yang besar, maka memerlukan gel
dengan konsentrasi akrilamid yang kecil, dengan
demikian ukuran pori di dalam gel akan
besar(Prihanto, 2011). 12
APA YANG DIMAKSUD DENGAN STACKING
GEL ?
MENGAPA STACKING GEL DIPERLUKAN?
 Stacking gel merupakan salah satu gel yang
digunakan dalam SDS-PAGE.
 Stacking gel merupakan gel pengumpul atau gel

ALMAWATI SITUMORANG
penimbun yang terletak pada bagian atas.
 Stacking gel dibuat dengan campuran antara
akrilamid 30%, Tris HCl 1 M pH 6,8, steril aquades,
SDS 10%, Ammonium Phosphate (APS) 10%, dan
temed (Utami, 2007).
 Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein
karena digunakan untuk mencetak sumuran (well ),
selain itu digunakan untuk menimbun atau
memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit
sebelum protein itu memasuki gel pemisah. 13
APA YANG DIMAKSUD DENGAN STACKING
GEL? MENGAPA STACKING GEL
DIPERLUKAN?
 Stacking gel juga digunakan untuk menahan
sementara agar sampel bermigrasi pada
waktu yang bersamaan.

ALMAWATI SITUMORANG
 Pada saat elekroforesis protein, protein akan
tertarik ke bagian bawah arus listrik.
 Protein yang memiliki berat molekul paling
kecil bergerak cepat sehingga tertarik
sampai bagian bawah gel, sedangkan protein
yang memiliki berat molekul paling besar
akan berada pada bagian atas dari gel
(Utami, 2007).
14
APA FUNGSI PEWARNAAN GEL PADA METODE
ELEKTROFORESIS?
 Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari
metode SDS-PAGE.
 Fungsi pewarnaan gel pada elektroforesis yaitu untuk
membantu memonitor jalannya elektroforesis.

ALMAWATI SITUMORANG
 Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein terdiri
dari commasie blue staining dan silver salt staining.
 Pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat
dianalisa jarak migrasi pita-pita protein terbentuk pada
gel pemisah.
 Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak
yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol.
 Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati
migrasi molekul protein selama elektroforesis (Anam,
2009).
15
PRINSIP ELEKTROFORESIS
 Prinsip yang digunakan pada elektroforesis yaitu
memisahkan protein berdasarkan berat molekul
dengan menggunakan matriks penyangga

ALMAWATI SITUMORANG
akrilamid.
 Protein terseparasi dalam medan listrik
dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan
warna dan pembilasan gel.
 Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan
melihat pita yang terbentuk oleh marker.

16
FAKTOR-FAKTOR YANG BERPENGARUH PADA
PERCOBAAN ELEKTROFORESIS KALI INI
YAITU UKURAN DAN BENTUK MOLEKUL,
KONSENTRASI GEL, PH, SUHU, DAN VOLTAGE.
 Ukuran dan Bentuk Molekul : Semakin besar
ukuran molekul maka pergerakan akan semakin

ALMAWATI SITUMORANG
lambat, bentuk molekul sekunder atau tersier
mempunyai pergerakan yang lebih lambat dari pada
protein primer.
 Konsentrasi Gel : Pada konsentrasi gel yang rendah
maka pergerakan protein lebih cepat dan sebaliknya
pada konsentrasi gel yang lebih tinggi maka
pergerakan protein akan lebih lambat.

17
Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan
Elektroforesis kali ini yaitu ukuran dan bentuk
molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage.
 pH : Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode
elektroforesis protein karena akan mempengaruhi titik
isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi

ALMAWATI SITUMORANG
tingkat dan arah pergerakan protein.
 Suhu : suhu akan mempengaruhi denaturasi protein
dimana pada Elektroforesis digunakan suhu 90-95oC
untuk mendenaturasi protein.
 Voltage : voltage yang digunakan juga mempengaruhi
pergerakan protein dimana dengan voltage yang tinggi
maka pergerakan protein dalam gel elektroforesis akan
lebih cepat, sebaliknya jika voltage yang digunakan
rendah maka pergerakan protein dalam gel akan
lambat.
18
JELASKAN PROSES TERBENTUKNYA PITA!
 Pita terbentuk karena adanya perbedaan
berat molekul.
 Selain itu pita-pita bisa terbentuk atau
nampak disebabkan karena adanya sejumlah
partikel sampel yang tersangkut pada titik-

ALMAWATI SITUMORANG
titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan
listrik pada sampel yang bergerak menuju
katoda.
 Partikel yang memiliki berat molekul sama
akan terakumulasi di titik yang sama,
sehingga membentuk beberapa pita dengan
panjang berbeda yang terpisah berdasarkan
berat molekulnya
19
Apakah kepekatan warna pita berkaitan
dengan konsentrasi protein ?
 Iya, kepekatan warna pita berkaitan dengan
konsentrasi protein.
 Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein
menunjukkan konsentrasi atau banyaknya protein

ALMAWATI SITUMORANG
yang memiliki berat molekul sama yang berada
pada posisi pita yang sama.
 Semakin tinggi konsentrasi sampel semakin
tebal pita yang terbentuk.
 Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul
bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat
bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik,
molekul dengan muatan dan ukuran yang sama
akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama
atau berdekatan.
20
BAGAIMANA CARA MENGIDENTIFIKASI JENIS PROTEIN
YANG MEMBENTUK PITA PADA GEL ELEKTROFORESIS ?
 Cara mengidentifikasi jenis protein yang membentuk pita
pada gel elektroforesis yaitu dengan membandingkan posisi
pita sampel dengan pita pada jalur marker/standar yang
telah diketahui berat molekulnya.

ALMAWATI SITUMORANG
 Marker atau penanda merupakan campuran molekul dengan
ukuran berbeda-beda yang dapat digunakan untuk
menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan
meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang
paralel dengan sampel.
 Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan
dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.
 Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap
logaritma ukuran molekul.
21
Apakah fungsi penambahan
merkaptoetanol pada persiapan sampel ?
 Fungsi penambahan merkaptoetanol pada
persiapan sampel yaitu untuk mereduksi
ikatan disulfida yang terdapat pada protein

ALMAWATI SITUMORANG
sehingga protein tidak memiliki struktur
tersier maupun sekunder dan akan lebih
mudah untuk dipisahkan dalam analisis
elektroforesis.

22
APAKAH FUNGSI PEMANASAN SAMPEL PROTEIN?
 Fungsi pemanasan sampel protein yaitu untuk
mendenaturasi protein yang akan dianalisis
sehingga protein tidak lagi memiliki struktur tersier
ataupun sekunder.
 Dengan demikian ketika dilakukan proses pemisahan

ALMAWATI SITUMORANG
ukuran protein yang lebih sederhana akan memiliki
pergerakan yang lebih cepat.
 Selain itu pemanasan sampel protein juga berfungsi
untuk mempercepat reaksi (katalis) karena ketika
sampel ditambahkan dengan sampel buffer proses
pemanasan akan mempercepat adanya interaksi dan
reaksi antara keduannya.

23
MENGAPA PH SANGAT BERPENGARUH
PADA METODE ELEKTROFORESIS
PROTEIN ?
 Besarnya pH sangat berpengaruh pada
metode elektroforesis protein karena akan

ALMAWATI SITUMORANG
mempengaruhi titik isoelektrik protein
sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan
arah pergerakan protein.
 Pada titik isolelektrik, protein akan
terdenaturasi sehingga ikatan-ikatan protein
akan terputus dan menghasilkan molekul
yang lebih sederhana sehingga akan
mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan 24
protein.
REAGEN APA YG BERFUNGSI UNTUK
MEMPOLIMERISASI GEL?
 Reagen yang berfungsi untuk mempolimerisasi gel
yaitu APS (Amonium persulfat) dan TEMED
(Tetra Ethyl Methyl Ethilene Diamine).
 APS berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan

ALMAWATI SITUMORANG
akrilamid agar dapat bereaksi dengan poliakrilamid
lain membentuk rantai polimer yang panjang.
 SedangkaN TEMED berfungsi sebagai katalisator
reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel
poliakrilamid sehingga dapat dingunakan dalam
pemisahan protein.

25
Faktor-faktor apa yang mempengaruhi pergerakan
protein dalam gel elektroforesis ?
 Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan
protein dalam gel elektroforesis yaitu ukuran dan
bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, dan voltage.
Semakin besar ukuran molekul maka pergerakan

ALMAWATI SITUMORANG
akan semakin lambat, bentuk molekul sekunder
atau tersier mempunyai pergerakan yang lebih
lambat dari pada protein primer.
 Pada konsentrasi gel yang rendah maka pergerakan
protein lebih cepat dan sebaliknya pada konsentrasi
gel yang lebih tinggi maka pergerakan protein akan
lebih lambat.

26
Faktor-faktor apa yang mempengaruhi
pergerakan protein dalam gel elektroforesis ?
 Besarnya pH sangat berpengaruh pada
metode elektroforesis protein karena akan
mempengaruhi titik isoelektrik protein

ALMAWATI SITUMORANG
sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan
arah pergerakan protein.
 Selain itu voltage yang digunakan juga
mempengaruhi pergerakan protein dimana
dengan voltage yang tinggi maka pergerakan
protein dalam gel elektroforesis akan lebih
cepat, sebaliknya jika voltage yang
digunakan rendah maka pergerakan protein 27

dalam gel akan lambat.

ALMAWATI SITUMORANG
TERIMAKASIH
28