Teknik Laboratorium dalam

Teknologi DNA Rekombinan

Aliyah Purwanti, M.Si.
TEK3452 / Tahun Ajaran 2021/2022
Polymerase Chain Reaction (PCR)
▪ Video : https://www.youtube.com/watch?v=6rgM8_TwGxY
▪ Dikenalkan oleh Ilmuan biokimia : Kary B. Mullis (1983)
▪ Teknik untuk mengamplifikasi segmen spesifik DNA
dalam jumlah jutaan kali dalam waktu singkat
▪ Suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan
suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro 
enzim polimerase
▪ Proses cepat, sampel sedikit
▪ Alat : thermocycler/thermalcycler
▪ Sekali proses penggandaan = 1 siklus PCR
▪ 25-30 siklus
▪ Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA
ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula
Komponen PCR
▪ Sekuen spesifik DNA template
▪ Sebagai cetakan; diisolasi dari sel dengan metode lisis dengan buffer lisis
▪ DNA Polimerase Taq DNA Polymerase
▪ Berperan dalam tahap pemanjangan primer membentuk rantai DNA baru
▪ Diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus, yang hidup di suhu tinggi
▪ Sifat enzim  tahan pada suhu tinggi
▪ Primer (sepasang)
▪ Suatu sekuens oligonukleotida pendek (20-30 pb)
▪ Berfungsi mengawali sintesis rantai DNA
▪ Sekuennya bersifat komplemen dengan DNA template yang akan diperbanyak
▪ Buffer
▪ Menjaga kondisi pH
▪ Buffer yang mengandung MgCl2  menstimulasi aktivitas DNA polimerase
▪ dNTPs
▪ Campuran dGTP, dATP, dCTP, dTTP
▪ Sebagai building block DNA yang diperlukan dalam tahap polimerisasi
Siklus PCR
▪ Denaturasi
▪ Proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas
tunggal DNA yang menjadi cetakan (template)
▪ Pemanasan singkat pada suhu 90-98°C  ikatan hidrogen
antara basa yang komplemen putus
▪ Annealing
▪ Tahap penempelan primer  suhu 50oC – 60oC
▪ Primer akan menuju daerah spesifik yang komplemen
dengan urutan primer  terbentuk ikatan hidrogen
▪ Extension
▪ Reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai  suhu
optimal : 78oC
▪ Primer yang telah menempel tadi akan mengalami
perpanjangan pada sisi ujung 3‟nya  Taq DNA
polymerase
Optimasi PCR

▪ Jenis DNA Polimerase

▪ Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung pada panjang DNA target yang akan
diamplifikasi
▪ Untuk fragmen DNA dengan panjang lebih besar dari tiga kilobasa, memerlukan
jenis polimerase dengan aktivitas tinggi, contoh : enzim Pfu polimerase (diisolasi
dari bakteri Pyrococcus furiosus)

▪ Konsentrasi DNA Polimerase, Buffer & dNTPs

▪ Panjang target DNA < 1 kb  konsentrasi dNTPs sebanyak 100 uM
Panjang target DNA > 1 kb  konsentrasi dNTPs sebanyak 200 uM
▪ Konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 – 1,5 mM
▪ Panjang target DNA < 2 kb  1,25 - 2 unit DNA polimerase/50 uL campuran reaksi
Panjang target DNA > 2 kb  3 unit DNA polimerase/50 uL campuran reaksi
Optimasi PCR
▪ Suhu
▪ Denaturasi  90-95°C
▪ Terlalu tinggi  menurunkan aktivitas DNA polimerase, menurunkan efisiensi
PCR. merusak DNA template
▪ Terlalu rendah  proses denaturasi DNA template tidak sempurna
▪ Annealing  37 - 60°C
▪ Suhu annealing dapat dihitung berdasarkan (Tm–5)°C sampai (Tm+5)°C
▪ Melting temperature (Tm)  temperatur dimana 50% untai ganda DNA terpisah
▪ Extension
▪ Suhu optimum polimerase DNA  72°C

▪ Jenis Buffer
▪ “Low-salt buffer” (pH 8,75)  panjang DNA target antara 0 – 5 kb
▪ “High-salt buffer” (pH 9,2)  panjang DNA target > 5 kb
Optimasi PCR
▪ Waktu
▪ Denaturasi  30 – 90 detik
▪ Terlalu lama  menurunkan aktivitas DNA polimerase, merusak DNA template
▪ Terlalu cepat  proses denaturasi DNA template tidak sempurna
▪ Annealing
▪ Panjang primer 18 – 22 basa  30 detik
▪ Panjang primer > 22 basa  60 detik
▪ Extension
▪ 30 – 60 detik setiap 1kb DNA
Analisis Hasil PCR : Agarose Gel Electrophoresis
Agarose Gel Electrophoresis
Principle Agarose Gel Electrophoresis

https://bento.bio/protocol/biotechnology-101/gel-electrophoresis/
https://ib.bioninja.com.au/standard-
level/topic-3-genetics/35-genetic-
modification-and/gel-
electrophoresis.html
Modifikasi PCR : Real Time PCR

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techqpcr/
PCR Konvensional vs Real Time PCR
PCR Konvensional
Sensitivitas rendah
Presisi rendah
Tidak otomatis
Hasil tidak dalam bentuk angka
Ada tahapan setelah PCR
Deteksi keberadaan DNA
dilakukan pada akhir reaksi
Pengamatan keberadaan DNA
hasil amplifikasi dilakukan di gel
agarosa setelah dilakukan
elektroforesis
Real Time PCR
Sensitivitas tinggi
Presisi tinggi
Otomatis
Data dikumpulkan dalam fase
pertumbuhan eksponensial PCR
Tidak ada tahapan setelah PCR
Pengamatan dapat dilakukan saat
reaksi berlangsung
Keberadaan DNA hasil amplifikasi
dapat diamati pada grafik yang
muncul sebagai hasil akumulasi
fluoresensi dari probe (penanda)
Aplikasi PCR