PROSEDUR ACUAN PERTAMA PEMURNIAN GENOM DNA TUMBUHAN

Prosedur

 Masukkanlah 35µL larutan buffer ke dalam tube mikrosentrifuse 1,5 ml

 Timbang jaringan tanaman, gunakan 100mg jaringan segar atau beku ;
Gerus bahan satu persatu sesuai dengan metode :
a) Mortal dan pistil
Masukkan 100mg dari jaringan tanaman kedalam nitrogen cair dan gerus dengan
mortal dan pistil
b) Penggilingan
1. Masukkan 100mg jaringan tanaman kedalam botol vial stainless steel.
b0otol vial dan titisan tersebut harus didinginkan terlebih dahulu dengan
nitrogen cair. Pengaturan dari bahan kimia dan gangguannya tergantung
kepada jenis jaringannya.
Segera pindahkan bubuk jaringan kedalam tabung microsentrifuse ukuran 1,5 ml yang berisi
350µl buffer A penghancur selama 10-20 detik untuk mencampurnya secara perlahan.

Catatan :

 Pindahkan jaringan yang sudah digiling ke larutan buffer penghancur secepat

mungkin untuk mencegah degradasi DNA
 Semua bahan yang sudah digiling secara keseluruhan dicampur dengan larutan buffer
penghancur. Degradasi DNA bisa terjadi pada partikel yang dibiarkan kering pada
dinding tabung.
 Jaringan yang sudah digiling bisa digunakan segera dalam protokol isolasi DNA atau
disimpan dalam suhu -70º C sampai digunakan
2. Tambahkan 20 cairan buffer B penghancur dan 20µL Rnase A .Pilihan :
untuk jaringan yang tahan terhadap gangguan mekanik, tambahkan pasir
kaca ke dalam tabung mikrosentrifuse dan vortex selama 1 menit
3. Inkubasi sampel selama 10 menit pada suhu 65ºC, vortex sesekali atau
gunakan water bath pengaduk, goyangkan platformnya atau gunakan
termomixer
4. Tambahkan 130µL dari larutan pengendap dan campurkan dengan cara
membolak balikkan tabung selama 2-3 kali. Inkubasi selama 5 menit
dalam es
5. Sentrifuse selama 5 menit dengan ≥20.000x g (≥ 14.000 rpm)
6. Kumpulkan supernatan ( biasanya 450-550µL) dan pindahkan kedalam
tabung mikrosentriifuse yang bersih ( tidak disediakan) tambahkan 400µL
dari larutan pengikat Gdna tumbuhan dan 400µL dari 96% ethanol dan
campurkan dengan merata.
7. Pindahkan setengah dari campuran yang sudah disiapkan ( 600-700µL)
kedalam kolom spin. Sentrifuse selama 1 menit pada 6000 x g
 (~8000rpm) buang larutan yang mengalir dan gunakan campuran sisa
kedalam kolom yang sama. Sentrifuse selama 1 menit pada 6000x g
(~8000rpm ) PENTING : jangan melebihi gaya spesifik relatif
sentrifuse, Catatan : tutup kantong dengan Genejet kolom pemurni
genom DNA dengan ketat setelah pemakaian.
8. Tambahkan 500µL cairan buffer pencuci I kedalam kolom ( pastikan
etanol sudah ditambahkan ke buffer pencuci I) sentrifuse selama 1 menit
dengan kecepatan 8000x g ( ~ 10.000 rpm) Buang larutan yang mengalir
dan letakkan kolomnya kembali ke tabung koleksi
9. Tambahkan 500µL dari larutan buffer pencuci II kedalam kolom
( pastikan etanol sudah ditambahkan ke larutan buffer pencuci II)
Sentrifuse selama 3 menit pada kecepatan maksimum ≥ 20.000 x g
(≥14.000 rpm) Dianjurkan : kosongkan tabung koleksi. Letakkan kolom
pemurnian kembali ke tabung dan putar ulang kolom selama 1 menit pada
kecepatan ≥ 20.000 x g (≥14.000 rpm) Buang tabung koleksi yang berisi
larutan mengalir dan pindahkan kolom kedalam tabung mikrosentrifuse
1,5ml yang steril ( tidak disediakan)
10. Untuk meng-elusi DNA genom, tambahkan 100µL buffer elusi ketengah
tengah membran kolom. Inkubasi selama 5 menit kedalam suhu ruangan.
Sentrifuse selama 1menit pada kecepatan 8000x g ~ (10.000 rpm)
11. Lakukan langkah elusi kedua menggunakan 100µL larutan buffer elusi.
Kamu bisa melakukan elusi kedua menggunakan tabung elusi yang sama
atau dengan tabung yang berbeda. DNA yang di purifikasi sudah siap
untuk digunakanan dalam penggunaan terakhir atau disimpan pada suhu -
20º C.