TERJEMAHAN

PROTEIN SEBAGAI PRODUK

INTRODUCTION TO BIOTECHNOLOGY BY THIEMAN-PALLADINO

THIRD EDITION PEARSON

Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Biologi Modern

Oleh:

Dina Chamidah/190341964012

Dosen Pengampu:

Prof. Dr. agr. Mohamad. Amin, S.Pd., M.Si.

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI (S3)

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
2020

520
 PROTEIN SEBAGAI PRODUK

Setelah menyelesaikan bab ini, Anda harus dapat:

■ Jelaskan penggunaan beberapa enzim yang diproduksi secara bioteknologi dalam industri.

■ Berikan tiga contoh aplikasi medis protein.

■ Sebutkan produk-produk rumah tangga umum yang mungkin termasuk protein yang

diproduksi sebagai bahan.

■ Diskusikan kelebihan dan kekurangan sumber ekspresi protein bakteri, jamur, tanaman, dan

hewan.

■ Jelaskan mengapa Escherichia coli sering digunakan untuk produksi protein, dan jelaskan

batasan E. coli.

■ Jelaskan mengapa glikosilasi protein dapat menentukan pilihan sistem ekspresi protein.

■ Jelaskan skema umum untuk pemurnian protein dari protein seperti hemoglobin.

■ Jelaskan bagaimana protein target dipisahkan dari protein sel lain yang diberikan urutan

pemurnian tertentu.

■ Diskusikan manfaat untuk dapat memprediksi struktur protein dari urutan DNA (proteomik).
PERAMALAN MASA DEPAN

Obat-obatan yang diproduksi secara bioteknologi (atau obat-obatan) semuanya adalah

protein. Sampai saat ini, kimiawi dari molekul protein murni mendikte metode pemberian obat

(injeksi, penyerapan, konsumsi, atau cara lain). Sayangnya, metode pengiriman ini dapat

menyebabkan efek samping sistemik dan autoimun yang serius. Interferon alfa-2b, secara

tradisional diberikan melalui injeksi dan disetujui untuk pengobatan melanoma, hepatitis C, dan

kondisi yang disebabkan oleh human papillomavirus (HPV), adalah contoh yang baik dari obat

dengan metode pengiriman tradisional yang bermasalah. Baru-baru ini, untuk mengatasi masalah

ini, perusahaan Helix BioPharma telah mengembangkan nanovesikel multilamellar (partikel

submikroskopi berlapis-lapis yang dapat dengan mudah diasimilasi oleh tubuh) yang

memungkinkan pelepasan protein terkontrol yang diaplikasikan pada krim kulit. Pengiriman

topikal ini disesuaikan dengan molekul hidrofilik besar seperti interferon alfa-2b, yang

membantu menghindari efek samping serius yang disebabkan oleh metode pengiriman yang

lebih tradisional. Di masa depan, desain metode pengiriman yang disesuaikan dengan kimiawi

biomolekul protein mungkin sama pentingnya dengan penemuan biomolekul itu sendiri.

Hutan hujan tropis, jangkauan terdalam samudera, mendidih geyser di Taman Nasional

Yellowstone, dan kerangka paus ini berada di perbatasan pencarian ilmiah untuk protein. Protein

adalah molekul besar yang dibutuhkan untuk struktur, fungsi, dan pengaturan sel hidup. Setiap

molekul protein memiliki fungsi unik dalam reaksi biokimia yang menopang kehidupan. Ketika

para peneliti mengeksplorasi protein yang terjadi di alam, mereka membuka rahasia yang

mengatur pertumbuhan, kecepatan penguraian kimia, dan perlindungan dari penyakit.

 Aplikasi protein sama banyaknya dengan protein itu sendiri. Pertimbangkan kerangka

paus: selama proses dekomposisi alami, tulang sering dijajah oleh bakteri, beberapa di antaranya

telah berevolusi terutama untuk mencerna residu lemak yang tersisa pada mereka. Protein yang

diproduksi bakteri untuk memecah lemak diadaptasi ke perairan dingin di laut dalam. Para

peneliti mengakui bahwa zat dengan kemampuan untuk melarutkan lemak pada suhu dingin akan

menjadi zat tambahan yang bagus untuk deterjen cucian komersial.

Bahkan setelah protein ditemukan di alam dan aplikasi dicocokkan dengan

karakteristiknya, banyak kecerdikan diperlukan untuk menghasilkan protein dengan kualitas dan

kuantitas yang diperlukan. Sebagai contoh, jika kita berencana untuk memproduksi secara

massal deterjen air dingin yang baru, kita tidak dapat mengandalkan kerangka ikan paus; alih-

alih, kita harus menemukan sumber protein lain yang dibutuhkan. Untungnya, bioteknologi

memfasilitasi produksi hampir semua protein. Kami fokus pada proses-proses produksi dalam

bab ini.

Pada tahun 2000, National Institutes of Health meluncurkan Protein Structure Initiative

(PSI), upaya 10 tahun, $ 600 juta untuk mengidentifikasi struktur protein manusia. PSI adalah

upaya universitas dan industri federal yang bertujuan mengurangi biaya dan mengurangi waktu

yang diperlukan untuk menentukan struktur protein tiga dimensi. Tujuan awal PSI adalah untuk

membuat struktur protein paling mudah diperoleh dari pengetahuan tentang urutan DNA yang

sesuai. Dalam fase saat ini, yang dimulai pada 2010, para peneliti menggunakan penentuan

struktur throughput tinggi, yang berhasil dikembangkan selama fase awal PSI, untuk

mempelajari berbagai masalah biologis dan biomedis yang penting.

 Upaya besar ini untuk lebih memahami struktur protein membantu para peneliti

memahami fungsinya. Lebih dari 1.200 superfamili (kelompok struktur protein terkait) protein

telah diidentifikasi sejauh ini, dan hubungan antara sekuens asam amino protein dengan

strukturnya sekarang dipahami dengan baik. Basis data publik yang merupakan bagian dari

inisiatif saat ini memiliki lebih dari 33.000 urutan protein. Tujuan dari inisiatif ini adalah untuk

dapat memodelkan struktur protein yang tidak diketahui berdasarkan perbandingan struktural

dengan yang disimpan dalam database. Sebagai contoh, Proyek Genom Manusia menghasilkan 3

miliar pasangan basa urutan DNA manusia, tetapi diperkirakan 100.000 protein yang dihasilkan

dari DNA ini akan sulit ditentukan tanpa upaya para ilmuwan yang didukung oleh inisiatif

pemerintah utama seperti ini.

Kami mulai dengan survei cepat tentang banyak aplikasi protein di berbagai industri.

Kemudian kita melihat sifat struktur protein, memberikan perhatian khusus pada proses pelipatan

protein. Dengan itu sebagai dasar, kami mempelajari beberapa detail pemrosesan protein,

dimulai dengan metode pengekspresian protein. Kami kemudian belajar bagaimana protein yang

diekspresikan dimurnikan dan memeriksa proses yang digunakan untuk menganalisis dan

memverifikasi produk akhir. Meskipun tidak ada satu metode terbaik untuk memproses protein,

beberapa teknik yang bermanfaat secara umum tersedia. Dalam bab ini, kita melihat teknik-

teknik tersebut, dengan mengingat bahwa kekhasan pemrosesan protein bervariasi dari kasus ke

kasus.
1. PROTEIN SEBAGAI PRODUK BIOTEKNOLOGI

Penggunaan protein dalam proses pembuatan adalah teknologi yang telah teruji oleh

waktu. Misalnya, dua upaya pengolahan makanan tertua tergantung pada protein: pembuatan bir

dan pembuatan anggur. Fermentasi tidak tergantung hanya pada enzim yang diproduksi ragi

tetapi juga pada yang lain ditambahkan langsung ke batch. Pembuatan keju adalah industri

pengolahan makanan lain yang selalu menggunakan protein dan, berkat bioteknologi, sumber

protein yang sekarang digunakan adalah dari bakteri yang direkayasa daripada perut anak sapi

yang awalnya menyediakan enzim pembuat keju (Gambar 1).

Gambar 1. Produksi Keju Casein, bahan utama dalam keju, adalah hasil dari konversi kimiawi
yang bergantung pada chymosin. Enzim ini telah diperoleh dari dinding lambung anak sapi yang
tidak disembuhkan selama berabad-abad. Saat ini 80 persen dari chymosin yang diproduksi
diproduksi (dan dimurnikan) dari sel yang dimodifikasi secara genetik. John E. Smith,
Bioteknologi, Edisi Ketiga, 1996, © J. E. Smith 1981, 1988, © Cambridge University Press
1996, direproduksi dengan izin dari Cambridge University Press dan penulisnya).
Meskipun nilai protein dalam manufaktur telah lama terbukti, kami tidak dapat

melanjutkan pengetahuan ini sampai tahun 1970-an, ketika teknologi DNA rekombinan pertama

kali dikembangkan dan memungkinkan untuk menghasilkan protein spesifik sesuai permintaan.
Sejak saat itu, produksi protein telah menjadi kekuatan pendorong di belakang pengembangan

produk baru di berbagai industri.

Industri lain juga mendapat manfaat dari ketersediaan protein bioengineer. Banyak dari

aplikasi ini bergantung pada kekuatan sekelompok protein yang disebut enzim untuk

mempercepat reaksi kimia. Enzim melayani berbagai tujuan, seperti membuat deterjen bekerja

lebih baik, meningkatkan aliran minyak dalam operasi pengeboran, dan membersihkan lensa

kontak. Enzim digunakan dalam manufaktur untuk memecah molekul besar, proses yang disebut

depolimerisasi. Enzim ini termasuk glikosidase (karbohidrat) seperti amilase, yang memecah

pati; protease, yang memecah protein lain; dan lipase, yang memecah lemak (Tabel 1). Enzim

seperti itu (seperti chymosin, untuk keju) digunakan dalam produksi makanan dan minuman dan

untuk pemrosesan massal dalam industri (lihat Gambar 1).

Hormon, yang membawa pesan kimiawi, dan antibodi, yang melindungi organisme dari

penyakit, adalah dua kelompok protein lain yang diproduksi secara komersial, terutama untuk

industri medis. Hormon juga memiliki kegunaan pertanian. Misalnya, hormon dapat merangsang

rooting stek tanaman dan mendorong pertumbuhan hewan daging yang lebih cepat.

TABEL 1. BEBERAPA ENZIM DAN APLIKASINYA DALAM INDUSTRI

Enzim Peanfaatannya
Amilase Mencerna pati dalam fermentasi dan proses
Protease Mencerna protein untuk detergen, daging/kulit, keju,
pembuatan bir/baking, alat-alat perncernaan
hewan/manusia
Lipase Mencerna lemak dalam kehidupan sehari-hari dan produksi
minyak sayur
Pektinase Mencerna ensim dalam jus/bubur buah
Laktase Mencerna gula susu
Glukosa isomerase Memproduksi syrup tinggi fruktosa
Selulase/ Memproduksi makanan ternak, jus buah, pembuatan bir
 Hemiselulase
Penisilin acilase Memproduksi penisilin

Obat Biotek dan Aplikasi Medis Lainnya

Protein bioteknologi telah merevolusi industri perawatan kesehatan dan farmasi dalam

beberapa dekade terakhir. Banyak penyakit, dari kondisi umum seperti diabetes hingga penyakit

langka seperti penyakit Gaucher, dapat diobati dengan mengganti protein yang hilang. Dalam

kasus diabetes, protein yang hilang adalah hormon insulin. Insulin dulu harus dipanen dari babi

dan sapi. Ini kurang ideal karena tubuh manusia sering menolak protein asing ini. Para peneliti

mengatasi masalah dengan beralih ke sumber yang tidak mungkin: bakteri E. coli. Dengan

memasukkan gen manusia ke dalam E. coli, mereka menciptakan pabrik insulin mikroskopis.

(Kami melihat penggunaan luar biasa dari organisme hasil rekayasa genetika sebagai sumber

protein lebih dekat nanti dalam bab ini.) Badan Pengawas Obat dan Makanan AS (FDA)

menyetujui insulin baru ini pada tahun 1982, menjadikannya obat DNA rekombinan pertama.

Kemampuan untuk menghasilkan pasokan insulin manusia yang berlimpah telah meningkatkan

kesehatan dan kehidupan jutaan orang. (Tabel 2 mencantumkan beberapa produk farmasi

berbasis protein lainnya).

Tabel 2.
Beberapa Produk Farmasi Berbasis Protein
(sebagian besar produk merupakan protein rekombinan)

Protein Pemanfaatan
Eritropoetin Penanganan anemia
Interleukin 1,2,3,4 Penanganan kanker, AIDS: radiasi atau
induksi obat tekanan sumsum tulang
Antibodi monoklonal Pengobatan kanker, rheumatoid artritis,
digunakan untuk tujuan diagnosis
Interferon (α, β, ϒ, termasuk Pengobatan kanker, alergi, asma,
konsensus) artritis, dan penyakit infeksi
 Protein
Colony Stimulating Factor
Faktor Pembekuan Darah
Faktor Petumbuhan Manusia
Faktor Pertumbuhan Epidermal
Insulin
Faktor pertumbuhan mirip insulin
Faktor jaringan plasminogen
Faktor nekrosis tumor
Vaksin
Pemanfaatan
Pengobatan kanker, penghitungan sel
darah rendah, membantu kemoterapi,
terapi AIDS
Pengobatan hemofili, dan penyakit yang
berkaitan dengan gangguan pembekuan
darah
Pengobatan gangguan pertumbuhan
pada anak
Pengobatan luka, bisul kulit, kanker
Pengobatan diabetes tipe 1 dan 2
Pengobatan diabetes melitus tipe 1
Pengobatan pasca serangan jantung,
stroke
Pengobatan kanker
Vaksinasi melawan hepatitis B, malaria,
herpes

Protein terapeutik seperti antibodi monoklonal, protein darah, dan enzim yang diproduksi

oleh organisme hidup untuk melawan penyakit juga dapat dianggap sebagai obat biotek. Tidak

seperti obat lain, obat ini tidak diproduksi secara sintetis (misalnya disintesis secara kimia

dengan menambahkan satu senyawa pada suatu waktu) tetapi biasanya diproduksi melalui

fermentasi mikroba atau oleh kultur sel mamalia. Saat ini, ada hampir 400 obat bioteknologi

dalam pipa, dan mayoritas adalah protein. Jika bahkan persentase kecil dari obat ini berhasil, itu

akan secara signifikan menambah sekitar 40 obat biotek yang saat ini digunakan.

Memproduksi obat biotek adalah proses yang rumit dan memakan waktu. Para peneliti

dapat menghabiskan bertahun-tahun hanya mengidentifikasi protein terapeutik yang relevan,

menentukan urutan gennya, dan mengerjakan proses untuk membuat jumlah yang cukup dari

molekul protein menggunakan bioteknologi. Setelah metode ini ditentukan, teknisi dapat

menghasilkan sejumlah besar produk protein dalam bioreaktor, dalam kondisi yang dikontrol

dengan hati-hati, dengan menumbuhkan sel inang yang telah diubah untuk mengandung gen
terapeutik (bioreaktor adalah wadah produksi steril yang dirancang untuk menghasilkan produk

biologis) . Sel-sel dirangsang untuk menghasilkan protein target melalui kondisi kultur yang

tepat yang mencakup keseimbangan suhu, oksigen, keasaman, dan variabel lainnya. Pada waktu

yang tepat, protein diisolasi dari kultur, diuji secara ketat pada setiap langkah pemurnian (yang

akan kita bahas nanti dalam bab ini), dan diformulasikan menjadi produk yang aktif secara

farmasi. Teknisi manufaktur yang memantau bioreaktor harus benar-benar mematuhi peraturan

FDA di semua tahapan prosedur.

 Contoh dramatis lain dari potensi penggunaan protein dalam perawatan kesehatan adalah

dalam perawatan kornea yang rusak. Sebuah studi dari para peneliti di Kanada dan Swedia

menunjukkan bahwa kornea biosintetik dapat membantu regenerasi dan memperbaiki jaringan

mata yang rusak dan meningkatkan penglihatan. Penemuan ini penting karena pendekatan ini

dapat membantu mengembalikan penglihatan kepada jutaan orang yang menunggu donor kornea

manusia untuk transplantasi. Dalam studi tersebut, setiap pasien menjalani operasi dengan satu

mata untuk mengangkat jaringan kornea yang rusak dan menggantinya dengan biosintesis

kornea, yang dibuat dari kolagen manusia rekombinan yang saling terhubung secara sintetis.

Protein tersebut diproduksi dalam sel ragi dan secara kimia saling terkait untuk percobaan. Lebih

dari 2 tahun masa tindak lanjut, para peneliti mengamati bahwa sel-sel dan saraf dari kornea

pasien sendiri telah tumbuh menjadi implan, menghasilkan kornea “regenerasi” yang menyerupai

jaringan normal dan sehat. Kornea biosintetik juga menjadi sensitif terhadap sentuhan.

Penglihatan membaik pada banyak pasien, dan setelah pemasangan lensa kontak, penglihatan

sebanding dengan transplantasi kornea konvensional.

Dengan menggunakan metode baru untuk menyaring molekul yang berhubungan dengan

penyakit dengan cepat, Joshua LaBaer dan rekannya dari Biodesign Institute di Arizona State
University telah mengidentifikasi panel luas 28 prediktor awal, atau protein biomarker, yang

suatu hari nanti dapat membantu dalam diagnosis dini kanker payudara. Penelitian telah

menunjukkan bahwa protein yang diproduksi oleh kanker dapat memicu tubuh untuk

memproduksi antibodi yang tidak ditemukan pada individu sehat. "Autoantibodi" ini dapat

diukur dalam darah dan digunakan untuk mengungkap keberadaan kanker. Dalam studi kanker

payudara, microarrays protein digunakan untuk menampilkan ribuan protein biomarker potensial

yang berbeda pada slide mikroskop tunggal. Setetes darah ditambahkan ke microarray untuk

mencari protein yang dikenali oleh antibodi dari pasien kanker tetapi tidak dari wanita sehat

(lihat bagian 10). Hasil awal mempersempit jumlah calon biomarker potensial dari 5.000 menjadi

761. Akhirnya, 761 protein ini diuji dalam sebuah studi buta untuk menemukan 28 biomarker

protein akhir. Biomarker autoantibodi pada pasien dapat dengan mudah digunakan untuk

mendeteksi banyak kanker lainnya: ovarium, prostat, dan paru-paru.

Pemrosesan Makanan

Anda dapat menemukan banyak contoh penggunaan protein industri di dapur Anda.

Selama beberapa dekade industri pengolahan makanan mengandalkan enzim untuk

meningkatkan makanan bayi, buah kaleng, keju, makanan yang dipanggang, bir, makanan

penutup, dan makanan diet. Perangkat tambahannya cukup bervariasi.

Dalam roti, misalnya, enzim dapat digunakan untuk membuat pati lebih mudah untuk

bertindak, memungkinkan adonan naik lebih cepat. Hasilnya, adonan roti lebih mudah ditangani

dan tekstur akhirnya lebih konsisten.

Tekstil dan Pakaian

Contoh protein industri lainnya ada di lemari Anda. Selama lebih dari satu abad, enzim

telah digunakan dalam industri tekstil untuk memecah pati yang digunakan untuk "mengukur"

(mengeraskan) kain selama proses pembuatan. Enzim juga menggantikan bahan kimia yang

keras dan proses yang digunakan untuk meringankan dan melembutkan kain.

Salah satu contoh menarik dari penggunaan protein oleh tekstil diilustrasikan oleh

penelitian baru-baru ini tentang sutra laba-laba. Serat sutera laba-laba memiliki sifat mekanis

yang menakjubkan: serat ini memiliki kekuatan yang sebanding dengan baja, ketangguhannya

lebih besar dari Kevlar dan kurang padat dibandingkan kapas atau nilon. Namun, laba-laba tidak

memintal sutra yang hampir cukup untuk dipanen untuk digunakan dalam produk industri. Para

peneliti di Jerman baru-baru ini menemukan bahwa subunit protein bertanggung jawab atas sifat

sutera yang menakjubkan. Temuan ini memberikan pemahaman yang lebih jelas tentang sifat

mekanik serat laba-laba sutra dan mungkin berguna untuk desain produk seperti sutra.

Pemindahan gen laba-laba sutra ke organisme inang yang dapat menghasilkan jumlah protein

yang dibutuhkan telah selesai dan informasi struktural baru harus mengarah pada produk baru

segera.

KAMU MEMUTUSKAN

Menguji Produk Terbaik: Siapa yang Harus Membayar?

Diperlukan sekitar $ 800 juta untuk membawa obat ke pasar. Termasuk dalam biaya ini adalah

harga obat yang diteliti yang tidak disetujui karena reaksi yang merugikan atau ketidakefektifan.

Biasanya, proses pemurnian telah dikembangkan dan produk dalam uji coba manusia ketika ini

terjadi. Meskipun harga obat sering tinggi, banyak orang tidak menyadari bahwa harga ini
mencerminkan, sebagian, biaya penelitian pada produk yang tidak disetujui. Jika kami juga

menambahkan kemampuan untuk menentukan obat mana yang terbaik untuk setiap pasien

(pharmacogenetics) dengan biaya membawa obat ke pasar, biaya naik lebih tinggi. Karena

perusahaan bioteknologi seharusnya menghasilkan untung bagi pemegang sahamnya, lebih

menguntungkan bagi perusahaan untuk meminta semua orang membeli obat mereka, bahkan jika

obat itu tidak sepenuhnya cocok untuk setiap individu. Menurut Anda apa solusi terbaik: harga

lebih tinggi dan obat-obatan yang lebih baik, atau harga lebih rendah dan obat-obatan yang tidak

selalu berfungsi dan bahkan mungkin memiliki efek samping negatif? Kamu putuskan.

Detergent

Seperti ditulis pada bagian awal, ketika komposisi enzimatis ditambahkan ke dalam

detergen maka akan bekerja lebih baik dalam membersihkan dan bersifat biodgradable.

Detergen-detergen laundry mengambil keuntungan peran spesifik dari protease, lipase, dan

amilase untuk menguraikan noda dalam air dingin. Jika Anda melihat label beberapa penghilang

noda laundry, Anda akan melihat daftar enzim pada bagian pertama dan kadang-kadang hanya

komposisi zat aktifnya saja.

Bioremidiasi: Mengatasi Polusi dengan Protein

Guna mengurangi jumlah polutan yang dihasilkan dari proses industri, protein dapat

digunakan untuk membersihkan limbah berbahaya. Limbah organik beberapa bidang tanah,

rumah, dan bisnis merupakan sebuah ancaman terhadap lingkungan yang terus tumbuh,

khususnya ekosistem akuatik. Enzim dapat digunakan untuk menguraikan beberapa limbah

organik sebelum menyebabkan kerusakan.

 Penerapan baru lain yang menjanjikan untuk protein adalah dalam netralisasi polutan

logam berat seperti cadmium dan merkuri. Komponen-komponen berbahaya ini dapat tetap

bertahan di dalam lingkungan, menyebabkan ancaman kerugian terhadap organisme melalui

rantai makanan. Logam-logam ini tahan terhadap pemecahan enzimatik tetapi bukan berarti

protein tidak dapat digunakan untuk menetralisasinya. Beberapa mikroorganisme mempunyai

sebuah pelindung lengket metallothionin yaitu protein yang secara nyata menangkap logam

berat. Dalam kasus ini, polutan tidak dibongkar atau dicerna tetapi membuatnya bahayanya

berkurang secara sederhana. Ketika logam beracun diikat oleh bakteri akan kehilangan

kemungkinan untuk diserap oleh tumbuhan atau hewan.

Para peneliti saat ini menggunakan kekuatan rekayasa genetika untuk membuat

peralatan biologi baru yang lebih baik untuk melawan dan merusakkan substansi beracun. Oleh

karena proses penelitian ini kadang bergantung pada pertukaran gen secara acak di dalam bakteri

enzim yang dihasilkan dengan mengatur/menata gen dapat menjadi lebih atau kurang reaktif dari

pada enzim sejenis yang dihasilkan secara alami. Dalam sebuah penginderaan, ilmuwan

mempercepat proses mutasi acak dan evolusi dalam harapan penemuan baru yaitu protein

pemakan polusi yang lebih efisien.

2. STRUKTUR PROTEIN

Ribosom adalah pabrik yang menghasilkan protein. Untuk memahami proses

mengekspresikan dan memanen protein, kita harus melihat lebih dekat pada struktur molekul

protein.
 Protein adalah molekul kompleks yang dibangun dari rantai asam amino. Seperti semua

molekul, protein memiliki bobot molekul spesifik. Mereka juga memiliki muatan listrik yang

menyebabkan mereka berinteraksi dengan molekul lain. Kemampuan untuk berinteraksi ini

adalah kunci aktivitas biologis protein. Perhatikan, misalnya, cara struktur kimia dan muatan

listrik asam amino dapat memengaruhi interaksinya dengan air: Molekul akan bersifat hidrofilik

(penyuka air, tertarik pada molekul air) atau hidrofob (membenci air, seolah-olah molekul air

dan asam amino saling tolak).

Pengaturan Struktural

Protein mampu empat tingkat pengaturan struktural. Ini adalah struktur protein primer,

sekunder, tersier, dan kuaterner (lihat Gambar 2). Susunan yang tepat dari suatu protein

tergantung pada urutan kimiawi spesifik dari asam amino dan jenis-jenis kelompok samping

yang ada.
Gambar 2. Empat Tingkat Struktur Protein Lipatan protein yang tepat diperlukan untuk
kemampuan fungsional penuh. Metode pemurnian harus menjamin bahwa lipatan yang tepat
dipertahankan.

Struktur primer

Ke-20 asam amino yang biasa terjadi adalah blok penyusun protein. Sepuluh hingga 10.000 asam

amino dapat dihubungkan bersama dengan cara head-to-tail untuk membentuk urutan protein.

Urutan di mana asam amino dihubungkan bersama di ribosom dikenal sebagai struktur primer.

Mengubah asam amino tunggal dalam urutan dapat berarti protein kehilangan semua fungsinya.

Penyakit genetik seringkali merupakan hasil dari mutasi protein ini.

Struktur sekunder

Struktur protein sekunder terjadi ketika rantai asam amino melipat atau memuntir pada

titik-titik tertentu, membentuk bentuk baru karena terbentuknya ikatan hidrogen antara asam

amino hidrofobik. Bentuk paling umum, heliks alfa dan lembaran beta, dijelaskan pada bagian

pelipatan protein. Dalam pengaturan alfa-helix, asam amino membentuk spiral tangan kanan.

Ikatan hidrogen menstabilkan struktur, menghubungkan atom nitrogen asam amino dengan atom

oksigen asam amino lain. Karena hubungan terjadi secara berkala, rantai spiral terbentuk. Dalam

struktur beta-sheet, ikatan hidrogen juga menghubungkan atom nitrogen dan oksigen; namun,

karena atom-atom tersebut termasuk rantai asam amino yang berjalan berdampingan, pada

dasarnya lembaran datar terbentuk. Lembaran dapat berupa “paralel” (jika semua rantai berjalan

dalam arah yang sama) atau “antiparalel” (dalam hal ini rantai berganti arah). Salah satu elemen

mendasar dari struktur protein, giliran beta, terjadi ketika rantai tunggal loop kembali pada

dirinya sendiri untuk membentuk lembaran beta antiparalel. Baik struktur alpha-helix dan beta-

sheet ada karena mereka adalah struktur paling stabil yang dapat diasumsikan oleh protein.

Struktur tersier

Struktur protein tersier adalah polipeptida tiga dimensi (molekul besar terdiri dari banyak

molekul serupa yang lebih kecil) yang terbentuk ketika struktur sekunder saling berhubungan.

Ikatan yang menyatukan struktur tersier terjadi antara asam amino yang mampu membentuk

ikatan kovalen sekunder (seperti sistein, yang dapat membentuk ikatan disulfida dengan sistein

lain yang berdekatan, yang menghubungkan protein secara silang menjadi bentuk yang unik).

Ada kelompok sisi SH dari sistein yang dapat saling silang membentuk jembatan disulfida.)

Struktur tersier dari suatu protein menentukan fungsinya, seperti mengikat reseptor seluler atau
mengkatalisasi reaksi kimia. Tidak peduli apa struktur sekunder dan tersier yang diambil protein,

penting untuk diingat bahwa struktur itu rapuh. Ikatan hidrogen dapat dipecah dengan mudah,

merusak protein yang berharga. Siapa pun yang memanaskan telur telah menyadari bahwa

protein telur cairan (albumin) dengan cepat berubah bentuk (putih telur) karena ikatan tersier

hidrogen dan ikatan silang dihancurkan oleh panas. Sebagian besar protein yang digunakan di

laboratorium disimpan di es untuk mempertahankan struktur rapuh mereka dan mencegahnya

dari kehancuran oleh panas di laboratorium.

Struktur kuarter

Struktur protein kuarter adalah kompleks tiga dimensi yang unik, bulat, dibangun dari

beberapa polipeptida. Hemoglobin, yang membawa oksigen dalam darah, adalah contoh protein

dengan struktur kuaterner; terdiri dari dua protein tersier yang saling terhubung.

Lipat Protein

Segala sesuatu yang penting tentang struktur protein, fungsinya bergantung pada

pelipatan. Lipat menggambarkan bagaimana untaian asam amino yang berbeda terbentuk;

misalnya, anemia sel sabit dihasilkan dari kesalahan lipatan karena penggantian asam amino

tunggal pada lokasi strategis dalam struktur primer. Jika suatu protein terlipat secara tidak benar,

tidak hanya fungsi protein yang diinginkan akan hilang tetapi juga protein yang gagal melipat

dapat merusak. Misalnya, plak yang terbentuk pada penyakit Alzheimer terakumulasi karena

protein yang gagal melipat tidak dapat dipecah oleh enzim yang ada dalam sel-sel otak.

Terobosan pertama dalam memahami bentuk dasar protein datang pada tahun 1951,

ketika Pauling dan Corey menggambarkan alfa helix dan lembaran beta, yang merupakan
 komponen paling umum dari

struktur protein. Kedua struktur

Glycosylating
sugars dihasilkan dari ikatan hidrogen

yang mengikat rantai asam

amino. Tidak hanya penyakit

Alzheimer tetapi juga cystic

fibrosis, penyakit "sapi gila" (bovine spongiform encephalitis, atau BSE), berbagai bentuk

kanker, dan beberapa serangan jantung semuanya dikaitkan dengan gumpalan protein yang

terlipat secara tidak benar. Karena pelipatan protein terjadi secara alami, mudah untuk melihat

mengapa salah satu tantangan terbesar yang dihadapi bioteknologi adalah memahami dan

mengendalikan pelipatan protein dalam proses pembuatan.

Glikosilasi

Lebih dari 100 modifikasi posttranslasional (seperti glikosilasi) terjadi dalam sel

eukariotik. Dalam glikosilasi, unit karbohidrat (molekul gula) ditambahkan ke lokasi spesifik

pada protein (lihat Gambar 3).

Gambar 3. Struktur Protein Tiga Dimensi dengan Rantai Samping Glikosilasi Glikosilasi terjadi
dalam sel eukariotik dan mungkin memperpanjang umur protein dengan melindunginya dari
mekanisme seluler alami yang menghancurkan protein. Bank Data Protein / RCSB.
Perubahan ini dapat memiliki efek signifikan pada aktivitas protein: ia dapat

meningkatkan kelarutan dan mengarahkan protein ke dalam membran dan memperpanjang masa

aktif molekul dalam suatu organisme.

Glikoprotein dapat digunakan dalam pengobatan penyakit, seperti yang ditemukan oleh

para ilmuwan di Scripps Research Institute (dilaporkan dalam jurnal Blood, edisi 10 Juni 2010).

Penemuan ini merupakan cara baru untuk menargetkan dan menghancurkan sejenis sel kanker.

Glikoprotein dapat dikombinasikan dengan nanopartikel (molekul sintetis kecil) yang dimuat

dengan obat kemoterapi, menghasilkan cara baru untuk menargetkan dan menghancurkan sel

kanker. Dengan menargetkan kanker limfoma B dengan nanopartikel yang bermuatan

kemoterapi, dosis efektif obat ditingkatkan sambil secara bersamaan melindungi jaringan normal

(seperti yang dijelaskan dalam Forecasting the Future di awal bab ini). Jelas bahwa temuan para

ilmuwan Scripps dapat mengarah pada pengembangan terapi obat baru lainnya berdasarkan

glikosilasi untuk mengobati leukemia, limfoma, dan kanker terkait.

Rekayasa Protein oleh Rangkaian Evolusi Molekuler

Bioteknologi sering bergantung pada rekayasa protein. Kadang-kadang perlu untuk

memperkenalkan perubahan spesifik yang telah ditentukan dalam urutan asam amino. Ini dapat

dilakukan dengan teknologi evolusi molekuler terarah. Perusahaan biotek besar, misalnya,

menginduksi mutasi secara acak ke dalam gen dan kemudian memilih bakteri dengan produk

protein (enzim) yang memiliki aktivitas tertinggi. Dengan cara ini, perusahaan telah mampu
menghasilkan organisme (dan enzim industri) yang mentoleransi konsentrasi sianida lebih dari

1,0 mol (M) per liter, yang terlalu tinggi bagi kebanyakan bakteri untuk bertahan hidup. Tidak

ada lingkungan "alami" yang mengalami sianida pada tingkat ini. Organisme terpilih yang

dihasilkan dapat digunakan untuk memulihkan kontaminasi sianida yang dihasilkan dari

penambangan dan akumulasi limbah industri lainnya. Mutasi yang menghasilkan jenis organisme

ini tidak mungkin terjadi pada peristiwa seleksi alam karena lingkungan alam belum cukup

berubah untuk memilih jenis bakteri yang selamat. Evolusi molekuler terarah mensyaratkan

adanya perubahan spesifik dalam sekuens nukleotida gen tertentu, menghasilkan enzim

metabolik arsenik baru, seperti yang terlihat pada Gambar 4 di halaman berikutnya.

Gen yang baru dimodifikasi tersebut kemudian dapat dimasukkan ke dalam sel inang, di

mana urutan asam amino yang dibutuhkan diproduksi oleh sistem inang. Teknik ini

memungkinkan para peneliti untuk membuat protein dengan perangkat tambahan khusus. Tidak

seperti mutasi yang terjadi secara alami, evolusi molekuler terarah hanya berfokus pada mutasi

yang terjadi pada gen tertentu dan memilih protein terbaik dari gen itu, terlepas dari potensi

manfaat yang mungkin dimilikinya untuk organisme asli. Misalnya, ketika E. coli memproduksi

insulin manusia, tidak ada manfaatnya bagi bakteri. Untuk informasi lebih lanjut tentang evolusi

molekuler terarah, kunjungi situs web Maxygen Corporation di www.maxygen.com.

 Enzim telah dimodifikasi selama jutaan tahun evolusi untuk mengkatalisasi reaksi kimia

tertentu dalam sel. Dalam dekade terakhir, para ilmuwan telah menggunakan evolusi terarah dan

desain rasional (merancang protein agar sesuai dengan permukaan) dengan berbagai tingkat

keberhasilan untuk meningkatkan aktivitas, stabilitas, dan selektivitas enzim asli. Banyak

kemajuan telah dibuat di laboratorium David Baker di University of Washington menggunakan

program desain rasional yang disebut Rosetta. Tim merancang enzim yang tidak ditemukan di
alam dengan memodelkan bagian situs aktif dari enzim dan kemudian menemukan struktur

perancah protein untuk dilampirkan pada bagian tersebut. Setelah menguji 84 konstruk untuk

aktivitas, mereka memilih 50 dan memasukkan urutan DNA mereka ke E. coli untuk ekspresi.

Enzim pilihan terakhir berfungsi, tetapi tidak sebaik enzim asli. Ini mengharuskan mereka untuk

memutasi situs aktif berkali-kali untuk mencapai aktivitas yang lebih baik. Penelitian ini

menunjukkan bahwa hari ketika protein dapat dirancang secara rasional belum datang, tetapi

kemajuan sedang dibuat.

Gambar 4. Teknologi Evolusi Molekul yang Diarahkan

a. Gen yang mengekspresikan protein dapat mengalami peristiwa mutasi, menghasilkan
kelompok beragam urutan gen baru. Organisme dengan gen bermutasi disaring untuk sifat-sifat
unik. Setelah peningkatan fungsi protein, proses dapat diulang sampai fungsi maksimum
diperoleh. Tidak seperti seleksi alam, proses ini berfokus pada sifat-sifat protein, bukan
organisme, dan dapat mencapai perubahan yang mungkin tidak pernah terjadi di alam. Ini
mungkin tidak memiliki keunggulan evolusi, tetapi protein yang dihasilkannya akan memiliki
nilai komersial lebih. b. Para ilmuwan telah menemukan protein yang digunakan oleh bakteri
untuk meningkatkan lipatan protein. Protein "mata-mata" (diperlihatkan) mengurangi kesalahan
lipatan yang biasanya terjadi ketika bakteri menghasilkan protein rekombinan untuk penggunaan
obat atau industri. Tim peneliti menggunakan "evolusi terarah" untuk memilih bakteri secara
berurutan karena kemampuannya melipatgandakan protein yang melindungi mereka melawan
antibiotik.
 
 Selain protein yang diproduksi secara alami dan bermutasi, bioteknologi juga

menciptakan molekul protein yang sama sekali baru. Molekul-molekul ini, dirancang dan

dibangun di laboratorium, menunjukkan bahwa ada kemungkinan untuk menemukan protein

yang dirancang untuk aplikasi spesifik. Pelipatan protein yang salah sering dinyatakan sebagai

penyakit yang disebabkan oleh partikel protein menular, yang disebut prion (Gambar 5), yang

menarik protein sel normal dan menyebabkan perubahan struktur mereka, yang mengarah pada

akumulasi protein tidak berguna yang merusak sel. Prion dapat terjadi pada domba dan kambing

(scrapie) dan sapi (bovine spongiform encephalitis, atau penyakit "sapi gila"). Bentuk manusia

dari penyakit braindestroying ini termasuk kuru dan transformable spongiform encephalitis

(TSE). Semua penyakit ini melibatkan perubahan konformasi protein prekursor prion, protein

yang biasanya ditemukan dalam neuron mamalia sebagai glikoprotein membran.

Ketidakmampuan untuk mendeteksi penyakit sampai hewan yang terinfeksi sakit atau mati

memiliki kontrol yang rumit terhadap penyakit ini. Penelitian bioteknologi telah berupaya untuk

membentuk partikel infeksi sintetis yang dapat dipelajari, yang akan membantu dalam

mengembangkan deteksi dan pengendalian.

Gambar 5.
Prion Adalah Protein yang Tidak Puas. Salah lipatan protein yang terjadi pada gangguan prion
dapat diduplikasi di laboratorium untuk menghasilkan sejumlah besar protein prion, yang
kemudian dapat dipelajari untuk membuat kit diagnostik. Ikuti panah dari kiri saat protein prion
menarik protein normal dan mengubahnya menjadi prion, menghasilkan akumulasi prion di
dalam sel.
3. PRODUKSI PROTEIN

Sekarang, dua hal harus jelas: (1) protein berharga, dan (2) mereka adalah produk yang

kompleks dan rapuh. Dengan poin-poin ini dalam pikiran, kita sekarang meneliti karya

bioteknologi dalam produksi protein.

Memproduksi protein di laboratorium adalah proses yang panjang dan melelahkan, dan

pada setiap tahap ada banyak metode produksi yang dapat dipilih. Kami merujuk pada dua fase

utama yang digunakan dalam memproduksi protein sebagai pemrosesan hulu dan pemrosesan

hilir. Pemrosesan hulu meliputi ekspresi aktual protein dalam sel. Selama pemrosesan hilir,

protein pertama-tama dipisahkan dari bagian lain dari sel dan diisolasi dari protein lain.

Kemurnian dan kemampuan fungsional kemudian diverifikasi. Akhirnya, cara yang stabil untuk

mengawetkan protein dikembangkan. Pilihan yang dibuat selama pemrosesan hulu dapat

menyederhanakan pemrosesan hilir.

Ekspresi Protein: Pemrosesan Hulu

Kami memulai diskusi terperinci tentang pemrosesan protein dengan melihat keputusan pertama

yang dibuat dalam pemrosesan hulu: memilih sel yang akan digunakan sebagai sumber protein.

Mikroorganisme, jamur, sel tumbuhan, dan sel hewan semuanya memiliki kualitas unik yang

menjadikannya pilihan yang baik dalam keadaan yang tepat.

Bakteri
Bakteri adalah sumber protein yang menarik karena beberapa alasan. Pertama, proses fermentasi

bakteri dipahami dengan baik. Juga, mereka dapat dibudidayakan dalam jumlah besar dalam

waktu singkat. Dalam aplikasi industri, kemampuan ini untuk menghasilkan produk dalam skala

besar seringkali penting. Bakteri juga relatif mudah untuk diubah secara genetik.

Beberapa metode teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk meningkatkan

tingkat produksi protein bakteri. Salah satunya adalah pengenalan salinan tambahan dari gen

yang relevan ke sel inang. Dalam kebanyakan kasus gen yang relevan yang dimasukkan ke

dalam organisme berada di bawah kendali ekspresi oleh promotor transkripsi yang lebih kuat.

Spesies bakteri yang paling umum digunakan untuk menghasilkan protein rekayasa

genetika adalah E. coli. Karena penelitian awal terhadap genetika bakteri berfokus pada E. coli

sebagai sistem model, kami sekarang memahami karakteristik genetik E. coli dengan cukup baik.

 Dalam beberapa kasus, gen asing (dalam bentuk cDNA atau DNA komplementer) untuk produk

protein yang diinginkan melekat langsung ke gen E. coli lengkap atau sebagian. Dalam kasus ini,

E. coli hasil rekayasa genetika menghasilkan protein yang diinginkan, tetapi itu dalam bentuk

protein fusi. Dalam protein fusi, protein target dipadukan ke protein bakteri; Oleh karena itu,

langkah tambahan diperlukan untuk memecah keduanya. Protein bakteri yang menyatu biasanya

merupakan enzim yang akan mengikat substratnya dan dapat melekat pada kolom pemurnian

(lihat deskripsi kolom afinitas, di bawah). Mayoritas protein yang disintesis secara alami oleh E.

coli bersifat intraseluler (di dalam sel). Dalam kebanyakan kasus, protein asing yang dihasilkan

terakumulasi dalam sitoplasma sel dalam bentuk rumpun yang tidak dapat larut yang disebut

badan inklusi, yang harus dimurnikan dari protein sel lain sebelum dapat digunakan.

Ada beberapa keterbatasan dalam penggunaan mikroorganisme dalam produksi protein.

Semua bakteri, termasuk E. coli, adalah prokariotik. Prokariota tidak dapat melakukan proses
tertentu, seperti glikosilasi. Untuk alasan ini, beberapa protein hanya dapat diproduksi oleh sel

eukariotik, seperti yang terlihat pada Tabel 3.

Tabel 3.

Meskipun dimungkinkan untuk melakukan seluruh proses produksi protein dalam labu

kecil di laboratorium, mikroorganisme hasil rekayasa genetika juga dapat tumbuh dalam

fermentor skala besar (anaerob) atau bioreaktor (aerob) (Gambar 6).

Gambar 6. Bioreaktor Kultur sel volume besar umumnya dilakukan dalam sistem tertutup, steril
(steril) sampai produk dipanen. Melalui port steril, pekerja dapat menyesuaikan pH, konsentrasi
gas, dan variabel lain berdasarkan input dari sensor internal. Kantong steril seluas 2.000 liter
dapat digunakan di atas meja goyang sebagai alternatif untuk bioreaktor stainless steel.
Komputer memantau lingkungan dalam bioreaktor, menjaga tingkat oksigen dan suhu

ideal untuk pertumbuhan sel. Pertumbuhan sel dipantau dengan hati-hati, karena ketika fase

pertumbuhan tertinggi, promotor harus diaktifkan untuk merangsang ekspresi gen asing.

Mengaktifkan gen dalam organisme rekombinan membutuhkan waktu yang tepat. Ini harus

dilakukan setelah organisme selesai mensintesis protein alami penting yang diperlukan untuk

metabolisme.

Jamur

Jamur adalah sumber berbagai protein yang digunakan dalam produk yang beragam seperti

pakan ternak dan bir. Protein yang ada secara alami ditemukan dalam beberapa jamur yang

bergizi dan digunakan sebagai makanan Selain protein yang terbentuk secara alami, banyak

spesies jamur adalah inang yang baik untuk protein rekayasa. Tidak seperti bakteri, jamur

eukariotik dan mampu melakukan beberapa modifikasi posttranslasional (seperti melipat protein

manusia dengan benar) dan digunakan untuk sintesis tersebut, seperti diilustrasikan dalam Tabel

4.
 Tabel 4.

Tanaman

Sel-sel tumbuhan juga dapat digunakan untuk ekspresi protein. Faktanya, tanaman adalah

sumber yang berlimpah dari molekul alami yang aktif secara biologis, dan 85 persen dari semua

obat saat ini berasal dari tanaman. Salah satu contoh protein nabati yang diproduksi pada skala

industri adalah enzim papain proteolitik (pengurai protein). Papain, atau sayur pepsin, adalah

protease yang digunakan sebagai agen meattenderizing. Ini mencerna kolagen yang ada di

jaringan ikat dan pembuluh darah yang membuat daging jadi keras. Enzim yang diproduksi oleh

tanaman tidak diragukan lagi juga akan digunakan dalam waktu dekat untuk meningkatkan

produksi obat.

Tanaman dapat dimodifikasi secara genetis untuk menghasilkan protein spesifik yang

tidak terjadi secara alami. Proses ini mendorong pertumbuhan yang cepat dan tingkat reproduksi

pada tanaman, yang bisa menjadi keuntungan tersendiri. Misalnya, tembakau, tanaman pertama

yang direkayasa secara genetika, dapat menghasilkan sejuta biji dari satu tanaman. Sebagai

tanaman non-makanan, itu membuat pilihan yang baik untuk produksi protein biotek. Setelah

materi genetik diintegrasikan, sejuta "pabrik protein nabati" baru dapat mengisi ladang.
 Ada juga kelemahan menggunakan tanaman sebagai penghasil protein. Tidak semua

protein dapat diekspresikan pada tanaman, dan, karena mereka memiliki dinding sel yang keras,

proses ekstraksi protein dari mereka dapat memakan waktu dan sulit. Akhirnya, meskipun sel-sel

tumbuhan sering dapat dengan baik glikosilasi protein, prosesnya sedikit berbeda dari sel hewan.

Ini mungkin mengesampingkan penggunaan tanaman sebagai biofactories untuk ekspresi

beberapa protein.

Sistem kultur sel mamalia

Kadang-kadang dimungkinkan untuk membiakkan sel-sel hewan, menumbuhkannya dalam

medium sampai tiba waktunya untuk memanen protein. Proses ini menantang karena kebutuhan

nutrisi sel hewan mamalia sangat kompleks. Sel mamalia juga tumbuh relatif lambat, dan

peluang kultur sel mamalia untuk terkontaminasi lebih besar daripada sistem kultur lainnya.

Terlepas dari masalah ini, sel mamalia masih yang terbaik jika bukan satu-satunya pilihan

protein yang akan digunakan pada manusia.

Sistem produksi bioreaktor hewan

Sel dalam kultur bukan satu-satunya pilihan dalam menggunakan sel hewan; kadang-kadang

hewan hidup adalah penghasil protein. Perhatikan, misalnya, teknik yang digunakan untuk

memanen antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal bereaksi terhadap hanya satu target,

menjadikannya berharga dalam aplikasi diagnostik dan terapeutik. Antibodi adalah protein yang

diproduksi sebagai reaksi terhadap antigen (biasanya virus atau bakteri yang menyerang).

Antibodi dapat bergabung dengan dan menetralkan antigen, melindungi organisme. Produksi
antibodi adalah bagian dari respon imun yang membantu makhluk hidup melawan penyakit

menular. Ketika produksi antibodi monoklonal adalah tujuan, tikus disuntik dengan antigen.

Tikus tersebut mengeluarkan antibodi yang diinginkan atau jaringan penghasil antibodi tikus

digabungkan dengan sel-sel kanker (untuk membuatnya abadi). Saat cairan dari tumor itu hasil

dikumpulkan, antibodi monoklonal dapat dimurnikan darinya.

Metode lain dari produksi protein bioreaktor hewan menggunakan susu atau telur dari

hewan transgenik (hewan yang mengandung gen dari organisme lain). Produk hewani ini

mengandung protein dari gen rekombinan yang diperkenalkan dan dapat dimurnikan dari protein

susu atau telur. Pada tahun 2009, FDA menyetujui obat manusia pertama yang diproduksi dari

seekor kambing: ATryn, yang mengobati gangguan pendarahan yang jarang terjadi pada

manusia.

Sistem serangga

Sistem serangga adalah jalan lain untuk menghasilkan protein dari sel-sel hewan. Baculovirus

(virus yang menginfeksi serangga) digunakan sebagai wahana untuk memasukkan DNA,

menyebabkan protein yang diinginkan dihasilkan oleh sel-sel serangga. Namun, ada beberapa

contoh di mana modifikasi protein pasca-translasional sedikit berbeda pada serangga daripada

pada mamalia; oleh karena itu penggunaan sistem ekspresi serangga mungkin memiliki nilai

terbatas. Untuk saat ini, sistem ekspresi serangga terutama digunakan ketika sejumlah kecil

protein diperlukan dalam penelitian.

Metode Pemurnian Protein: Pemrosesan Hilir

Setelah protein diproduksi, proses hilir dimulai (Gambar 7). Pertama, protein harus dipanen. Jika

protein intraseluler, seluruh sel dipanen; jika ekstraseluler, protein diekskresikan ke dalam media

kultur yang dikumpulkan. Namun, memanen hanyalah awal dari proses hilir. Selanjutnya,

pekerjaan yang sebenarnya dimulai: protein harus dimurnikan. Ini adalah proses pemisahan

protein target dari campuran kompleks molekul biologis di mana ia diproduksi.

Gambar 7. Langkah-langkah Dasar dalam Bioproses Pemurnian dapat dilakukan dari bahan
mentah atau dari bioreaktor. Langkah-langkah dalam proses harus dirancang dan seringkali unik
(dan dapat dipatenkan). Dari Protein Bioteknologi, oleh Gary Walsh dan Dennis Headon,
Gambar 3.1, hal. 42. Hak Cipta © 1994, John Wiley & Sons, Limited. Diproduksi ulang dengan
izin.

Kemurnian dalam konteks ini adalah istilah yang relatif. Secara umum, FDA

mensyaratkan bahwa sampel terdiri dari 99,99 persen dari protein target. Memisahkan protein

dari semua konten seluler lainnya tidak mudah, dan mengisolasi protein target dari protein lain
dalam sampel bisa menjadi lebih sulit. Untuk memahami proses pemurnian protein, kami melihat

beberapa langkah yang biasanya diikuti di dalamnya.

Langkah satu: Mempersiapkan ekstrak untuk pemurnian

Sangat membantu untuk mencatat volume relatif dari ekstrak. Seringkali, medium, atau filtrat

kultur, dipanen dari fermentor besar atau bioreaktor cukup untuk mengisi kolam renang, dan

protein target mewakili kurang dari 1 persen dari kolam itu. Bahkan jika protein diekspresikan

dalam skala yang jauh lebih kecil, menemukan protein esensial bisa seperti menemukan jarum di

tumpukan jerami.

Jika protein intraseluler, tugas pertama adalah lisis sel, mengganggu dinding sel untuk

melepaskan protein. Ada banyak metode untuk melakukan ini: pembekuan dan pencairan (yang

mengganggu membran sel dan melepaskan isi sel); deterjen (digunakan untuk melarutkan

dinding sel), dan metode mekanis (ultrasonik atau penggilingan dengan manik-manik kaca

kecil). Mengingat kerapuhan protein, membebaskan mereka dari sel tanpa merendahkannya

sepenuhnya merupakan tantangan. Proses gangguan melepaskan protein yang diminati serta

seluruh konten intraseluler sel.

Setelah sel-sel pecah, alkohol dan garam organik dapat ditambahkan ke dalam campuran.

Keduanya memanfaatkan orientasi hidrofobik protein dengan menarik air dari protein,

menyebabkan mereka menyatu. Agen-agen ini meningkatkan interaksi antara molekul protein

untuk memisahkan mereka dari campuran.

Langkah dua: Menstabilkan protein dalam larutan

 Selanjutnya, protein harus distabilkan. Ingatlah bahwa penting untuk menjaga

bioaktivitas protein dan protein adalah molekul yang relatif rapuh. Sebagai konsekuensinya,

tindakan pencegahan harus diambil untuk melindungi protein selama proses pemurnian.

Mempertahankan suhu rendah sangat penting untuk melindungi protein, sehingga

sebagian besar pemurnian harus terjadi pada suhu rendah. Panaskan serendah suhu kamar

membatasi aktivitas protein. Mempertahankan pH yang tepat untuk aktivitas protein juga

penting, dan sebagian besar protein aktif ditangguhkan dalam zat penyangga untuk menjaga

fungsi maksimal.

Protease alami yang dapat mencerna protein target dalam sediaan adalah ancaman lain.

Protease inhibitor dan antimikroba dapat ditambahkan untuk mencegah molekul protein

dibongkar tetapi harus dihilangkan kemudian, karena harus ada aditif yang digunakan dalam

proses pemurnian. Masih masalah potensial lainnya adalah kerusakan mekanis dengan berbusa

atau mencukur protein menjadi fragmen yang tidak berguna. Sekali lagi, aditif dapat membantu

mencegah pembusaan dan pengikisan protein, tetapi aditif harus dihilangkan kemudian.

Seperti yang telah kita lihat, beberapa metode pemurnian cukup kuat untuk merusak

protein target. Dibutuhkan tindakan penyeimbangan untuk mengekstraksi dan memurnikan

protein dengan sukses. Meskipun penting bahwa protein dimurnikan, adalah sama pentingnya

bahwa protein mempertahankan aktivitas biologisnya.

Langkah tiga: Memisahkan komponen dalam ekstrak

Langkah terakhir dalam proses pemurnian bisa menjadi yang paling penting. Kesamaan antara

protein memungkinkan kita untuk memisahkannya dari bahan seperti lipid (lemak), karbohidrat,

dan asam nukleat, yang juga dilepaskan ketika sel terganggu. Perbedaan antara masing-masing
protein kemudian digunakan untuk memisahkan protein target dari yang lain. Berikut adalah

beberapa metode yang digunakan untuk pemisahan protein.

Presipitasi protein

Protein sering memiliki asam amino hidrofilik pada permukaannya yang menarik dan

berinteraksi dengan molekul air. Karakteristik itu digunakan sebagai dasar untuk memisahkan

protein dari zat lain dalam ekstrak. Garam, paling umum adalah amonium sulfat, dapat

ditambahkan ke dalam campuran protein untuk mengendapkan protein (untuk menyebabkannya

mengendap dari larutan).

Pengendapan amonium sulfat seringkali merupakan langkah pertama dalam pemurnian

protein, menghasilkan endapan protein yang relatif stabil. Masalah yang terkait dengan

presipitasi amonium sulfat membuatnya menjadi pilihan yang buruk dalam beberapa situasi

industri.

Amonium sulfat sangat reaktif ketika kontak dengan baja tahan karat, misalnya, dan

banyak fasilitas pemurnian industri terbuat dari baja tahan karat. Pelarut lain yang sering

digunakan untuk meningkatkan presipitasi protein termasuk etanol, isopropanol, aseton, dan

dietil eter. Sama seperti amonium sulfat, pelarut ini menyebabkan pengendapan protein dengan

mengeluarkan air dari antara molekul protein.

Metode pemisahan filtrasi (berdasarkan ukuran)

Ada berbagai cara untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan kepadatan. Sentrifugasi

memisahkan sampel dengan memutarnya dengan kecepatan tinggi. Dengan proses ini, protein

seringkali dapat diisolasi dalam satu lapisan atau dipisahkan dari komponen sel yang lebih berat.
Sentrifugal volume kecil hanya mampu memproses beberapa liter saja pada setiap putaran.

Reaktor besar dapat memproses ratusan atau ribuan liter (lihat Gambar 8). Sentrifugasi skala

industri biasanya dicapai dengan menggunakan sentrifugal aliran kontinu yang memungkinkan

pemrosesan kontinu dari konten bioreaktor.

Gambar 8. Fixed-Angle dan Sentrifugasi Batch

Sentrifugal sudut tetap (a) dapat mengembangkan gaya gravitasi yang sangat tinggi (gaya g)
tetapi terbatas pada jumlah yang lebih kecil dan harus dijalankan secara terpisah untuk setiap
bets. Sentrifugal batch (b) dikembangkan untuk memungkinkan aliran material yang
berkelanjutan dan pemisahan puing-puing sel dari protein sel. Tekanan kontinu dari aliran dan
gaya sentrifugal dapat disesuaikan untuk memaksimalkan pemisahan aliran keluar dari
supernatan protein.
 Filter dengan berbagai ukuran dan jenis juga dapat digunakan untuk memisahkan protein

dari molekul lain dalam campuran. Dalam proses ini, yang dikenal sebagai filtrasi membran,

membran tipis nilon atau bahan rekayasa lainnya dengan ukuran pori bervariasi digunakan untuk

menyaring semua puing seluler dari suatu larutan. Pertama, mikrofiltrasi menghilangkan endapan

dan bakteri. Ultrafiltrasi kemudian menggunakan filter yang dapat menangkap molekul seperti

protein dan asam nukleat. Beberapa proses ultrafiltrasi bahkan dapat memisahkan protein besar

dari yang lebih kecil. (Lihat www.amicon.com untuk melihat beberapa perangkat ini.) Salah satu

kekurangan utama sistem filtrasi membran adalah kecenderungan mereka untuk menyumbat

dengan mudah. Di sisi positifnya, penggunaan sistem penyaringan ini membutuhkan waktu lebih

sedikit daripada sentrifugasi.

Diafiltrasi dan dialisis adalah metode filtrasi yang mengandalkan konsep kimia

keseimbangan, perpindahan zat terlarut dari area dengan konsentrasi lebih tinggi ke area dengan

konsentrasi lebih rendah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 9, dialisis tergantung pada

kemampuan beberapa molekul untuk melewati membran semipermeabel sementara yang lain

dihentikan atau diperlambat karena ukurannya. Dialisis sering diperlukan untuk menghilangkan

garam yang lebih kecil, pelarut, dan aditif lain yang digunakan sebelumnya dalam pemurnian.

Garam kemudian diganti dengan zat penyangga yang membantu menstabilkan protein selama

sisa proses. Diafiltration menambahkan komponen filter ke dialisis.

 Gambar 9. Dialisis
Dialisis dapat digunakan untuk menghilangkan garam (titik-titik besar dalam gambar), dengan
proses difusi, dan menggantinya dengan buffer yang lebih cocok untuk stabilitas protein.

Kromatografi

Langkah-langkah awal dalam setiap proses pemurnian membebaskan protein dari sel,

menghilangkan kontaminan dan partikulat yang tidak diinginkan, dan memusatkan protein.

Metode kromatografi memungkinkan kita untuk mengurutkan protein berdasarkan ukuran

atau dengan cara mereka menempel atau terpisah dari zat lain. Dalam kromatografi, tabung gelas

panjang diisi dengan manik-manik resin mikroskopis dan larutan buffer. Ekstrak protein

kemudian ditambahkan dan mengalir melalui manik-manik resin dalam kolom kaca. Bergantung

pada resin yang digunakan, protein dapat menempel pada manik-manik atau melewati kolom

sementara manik-manik bertindak sebagai sistem penyaringan.

   Kromatografi ukuran-eksklusi (SEC) menggunakan manik-manik gel sebagai sistem

penyaringan. Molekul protein yang lebih besar dengan cepat bergerak di sekitar manik-manik gel

sementara molekul yang lebih kecil melewati lebih lambat karena mereka mampu menyelinap

melalui lubang kecil di manik-manik, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10. Gel tersedia

dalam berbagai ukuran pori, dan gel yang diperlukan untuk pemisahan yang tepat tergantung

pada berat molekul kontaminan atau protein yang dipisahkan. Metode ini hanya dapat melakukan

pemisahan awal, dan dapat menimbulkan masalah dalam pengaturan industri karena memerlukan

kolom yang sangat besar.

Gambar 10. Pemurnian Protein dengan Kromatografi Pengecualian Ukuran (a) Protein dengan
berat molekul rendah dan tinggi melakukan perjalanan melalui kolom kromatografi
pengecualian-ukuran. (B) Diagram menunjukkan bagaimana protein berat molekul rendah dan
tinggi muncul ketika mereka keluar dari kolom ketika dimonitor untuk protein (ultraviolet [UV]
280 penyerapan). Perhatikan bahwa protein dengan berat molekul tinggi bergerak cepat melalui
buffer, sedangkan protein dengan berat molekul rendah diperlambat oleh matriks resin kolom.
Resin dapat dibeli dengan berbagai ukuran pori. Dari Protein ke PCR oleh David W. Burden,
Gambar 5.4, hal. 99. Hak Cipta © 1995 oleh Springer-Verlag. Dicetak ulang dengan izin.
 Kromatografi pertukaran ion (IonX), bergantung pada muatan elektrostatik (seperti ikatan

statis) untuk mengikat protein ke manik-manik resin dalam kolom. Sementara protein bermuatan

menempel pada resin, kontaminan lain melewati dan keluar dari kolom, seperti yang ditunjukkan

pada Gambar 11.

Gambar 11. Ion-Exchange Chromatography

(a) Asam amino yang diikat mengikat manik-manik resin ionik. Meningkatkan kekuatan ion
buffer menggantikan protein (berdasarkan kekuatan ikatannya) setelah mereka terikat pada resin
kolom. (B) Protein X dilepaskan pada konsentrasi terendah dari gradien garam menggusur;
protein Y memiliki kekuatan ikat yang lebih tinggi dan dilepaskan kedua; protein Z memiliki
kekuatan ikatan tertinggi dan membutuhkan konsentrasi garam yang tinggi untuk
memindahkannya dari manik-manik penukar ion kolom. (c) Resin penukar anion adalah positif;
resin penukar kation dibebankan secara negatif. Dari Protein ke PCR oleh David W. Burden,
Gambar 554, hal. 102. Hak Cipta © 1995 oleh Springer-Verlag. Dicetak ulang dengan izin.

Protein kemudian dapat dielusi (dilepaskan dari resin) dengan mengubah muatan

elektrostatik; ini dilakukan dengan membilas kolom dengan larutan garam dengan konsentrasi
yang meningkat. Protein yang terikat kemudian dilepaskan dari perlekatannya (terdeteksi dengan

melihat di bawah UV 280) dan dikumpulkan.

Kromatografi afinitas bergantung pada kemampuan sebagian besar protein untuk

mengikat secara khusus dan reversibel dengan senyawa berbentuk unik yang disebut ligan. Ligan

adalah molekul kecil yang berikatan dengan molekul besar tertentu dalam protein. Pikirkan ligan

yang cocok dengan molekul protein unik seperti kunci yang cocok dengan kunci (Gambar 12).

Gambar 12. Kromatografi Afinitas Ligan afinitas dirancang untuk mengikat secara khusus ke
komponen kimia tiga dimensi unik dari protein yang dimurnikan. Protein yang tidak terikat
mencuci melalui kolom. Meningkatkan kekuatan ion buffer dapat menggantikan protein yang
terikat (setelah pengikatan preferensial) dan meregenerasi kolom afinitas. Protein yang
dipindahkan (murni) dapat dikumpulkan dan dipekatkan.

Setelah protein terikat pada manik-manik resin, larutan buffer digunakan untuk

membersihkan molekul yang tidak terikat. Akhirnya, larutan buffer khusus digunakan untuk

menyebabkan desorpsi (untuk memutuskan ikatan ligan) dari protein yang ditahan. Protein fusi,

seperti yang disebutkan sebelumnya, dapat digunakan dalam kromatografi afinitas karena

substrat (ligan) dari protein bakteri dapat menjadi bagian dari kolom afinitas, menarik protein
yang menyatu (protein enzim bakteri) ke dalam kolom. Kromatografi afinitas dapat

mempersingkat proses pemurnian dengan mengurangi jumlah langkah.

Seperti yang telah kita lihat, asam amino tertarik atau ditolak oleh molekul air. Dalam

kromatografi interaksi hidrofobik (HIC), protein diurutkan berdasarkan daya tolak airnya.

Manik-manik kolom dalam HIC dilapisi dengan molekul hidrofobik, dan asam amino hidrofobik

dalam protein tertarik pada bahan kimia serupa dalam manik-manik, ditunjukkan pada Gambar

13.
 resin
beads
Protein with hydrophobic
"patches" on its surface

Organized water
structure surrounding
the hydrophobic part
Hydrophobic
ligand
Add protein to resin under
conditions of high salt
concentration

Protein binds to the column

because of hydrophobic
interaction between the
ligand and the protein

Proteins are eluted in an order of

increasing hydrophobicity by linearly
decreasing the salt concentration

Decreasing
salt gradient
Concentration

O
Time
(increasing
protein
hydrophobicity)

Gambar 13. Interaksi Hidrofobik Kromatografi Meningkatkan konsentrasi nonpolar dari buffer
dapat menyebabkan bagian hidrofobik protein bergabung dengan resin kolom penukar ion
hidrofobik. Lebih lanjut mengurangi konsentrasi ion memindahkan protein dari resin kolom dan
menggantikan pelekatannya dengan pelarut nonpolar. Fraksi dapat dikumpulkan dan konsentrasi
protein ditentukan berdasarkan deteksi dengan analisis spektrofotometri pada UV 280 nanometer
(nm). Dari Protein ke PCR oleh David W. Burden, Gambar 5.6, hal. 104. Hak Cipta © 1995 oleh
Springer-Verlag. Dicetak ulang dengan izin.

Fokus isoelektrik sering digunakan dalam kontrol kualitas selama pemurnian untuk

mengidentifikasi dua protein serupa yang sulit dipisahkan dengan cara lain. Setiap protein

memiliki sejumlah asam amino bermuatan khusus di permukaannya di tempat-tempat tertentu.

Karena kombinasi unik dari gugus bermuatan ini, setiap protein memiliki tanda tangan elektronik

unik yang dikenal sebagai titik isoelektriknya (IEP), di mana muatan pada protein tersebut sesuai

dengan pH larutan. IEP dapat digunakan untuk memisahkan protein serupa dari satu sama lain.

Fokus isoelektrik adalah dimensi pertama dari elektroforesis dua dimensi. Elektroforesis dua

dimensi memisahkan protein berdasarkan muatan dan ukuran listriknya. Ini pada dasarnya adalah

kombinasi dari dua metode, IEP dan elektroforesis gel. Dalam teknik ini, para peneliti

memperkenalkan solusi protein sel ke strip polimer yang disiapkan khusus. Ketika strip terkena

arus listrik, setiap protein dalam campuran mengendap menjadi lapisan sesuai dengan

muatannya. Selanjutnya, strip ligan protein diselaraskan dengan gel dan sekali lagi terkena arus

listrik. Saat protein bermigrasi melalui gel, mereka berpisah sesuai dengan berat molekulnya.

Metode analitik

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) menambah twist pada metode kromatografi yang

dijelaskan sebelumnya, yang bergantung pada aliran gravitasi atau pompa bertekanan sangat

rendah untuk memindahkan ekstrak melalui kolom. Metode aliran rendah seperti itu dapat

memakan waktu beberapa jam untuk memproses satu sampel. Sebaliknya, sistem HPLC

menggunakan tekanan yang lebih besar untuk memaksa ekstrak melalui kolom dalam waktu

yang lebih singkat. Sistem HPLC memiliki keterbatasan. Lebih sedikit protein yang dipisahkan,

sehingga teknik ini lebih berguna dalam situasi analitis daripada dalam produksi massal.

Spektrometri massa (spec massa) adalah metode yang sangat sensitif yang digunakan

untuk mengidentifikasi perbedaan kecil antara protein. Bahkan, itu sering digunakan pada aliran

sistem HPLC. Semua spektrometer massa melakukan tiga hal: menangguhkan molekul sampel

ke dalam fase gas bermuatan, memisahkan molekul berdasarkan rasio massa terhadap muatannya
dengan mempercepat tabung sempit, dan akhirnya mendeteksi ion yang terpisah. Sampel sekecil

satu picogram (sepersejuta gram) dapat dianalisis dengan proses ini, yang diilustrasikan dalam

Gambar 14. Pembacaan definitif dihasilkan, yang menunjukkan identitas dan ukuran sebagian

besar protein atau fragmen yang dianalisis.

Gambar 14. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan Spektrometri Massa Kromatografi cair kinerja
tinggi sering digabungkan dengan spektrometri massa untuk menganalisis protein. (a) HPLC
menggunakan manik-manik resin yang tidak dapat dimampatkan di bawah tekanan yang sangat
tinggi untuk memisahkan protein yang sering memiliki ukuran yang serupa. (B) Spektrometri
massa mengikuti pemisahan awal ini untuk mendeteksi perbedaan halus dalam protein terionisasi
dan dipercepat yang akan dianalisis (berdasarkan jarak atau waktu) saat mereka melakukan
perjalanan ke tabung berisi vakum.

Aplikasi penting dari proses ini adalah pengurutan protein. Protein yang lebih besar dapat

dicerna menjadi fragmen (peptida) dan dianalisis untuk menentukan urutan asam amino.

Spektrometri massa sekarang menjadi metode yang disukai dan, di perusahaan biotek, sebagian
besar telah menggantikan metode analisis kelompok akhir Edmond yang lebih lambat yang

digunakan untuk pengurutan asam amino. Spektrometri massa dapat mendeteksi perbedaan

antara isomer dari protein yang sama, dan kemampuannya meningkat lebih cepat daripada

kebanyakan instrumen laboratorium dalam hal analisis kritis.

Verifikasi

Pada setiap langkah proses pemurnian, penting untuk memverifikasi bahwa protein target belum

hilang dan upaya konsentrasi telah berhasil. SDSPAGE (elektroforesis gel poliakrilamid) sering

digunakan untuk verifikasi. Dalam metode ini, deterjen yang disebut natrium dodesil sulfat

(SDS) ditambahkan ke sampel campuran protein dan campuran dipanaskan. Muatan sulfat

didistribusikan secara merata di sepanjang protein terdenaturasi (dipanaskan), membuat

pemisahan tergantung pada ukuran protein. Setelah perawatan ini, sampel protein dimuat ke

dalam matriks gel khusus (PAGE) di mana ia membentuk pita tunggal di lokasi tertentu

tergantung pada ukuran dan massa molekulnya, seperti yang terlihat pada Gambar 15.

Gambar 15. SDS-PAGE

Elektroforesis gel poliakrilamida protein yang memiliki muatan seragam (diproduksi dengan
memanaskan dalam natrium dodesil sulfat) dapat dipisahkan berdasarkan ukuran, berdasarkan
migrasi mereka dalam medan listrik vertikal. Prosedur ini biasanya mengikuti setiap langkah
utama dalam pemurnian untuk memverifikasi bahwa pita protein yang diinginkan menjadi lebih
terkonsentrasi (dan belum hilang dalam pemisahan). Perhatikan bahwa protein 65-kilodalton
(kD) memiliki konsentrasi tertinggi pada langkah terakhir (jalur 2) dari prosedur ini (jalur 1)
ketika protein dengan ukuran yang diketahui digunakan untuk perbandingan. Protein terkecil
akan mencapai kutub + pertama.

Dengan menambahkan pewarna yang bergabung dengan protein, seperti pewarnaan

Coomassie, hasil pita berwarna, dan penanda ukuran yang diketahui dapat dibandingkan dengan

sampel yang diwarnai. Ketika sampel dan penanda yang diketahui setara, kami memiliki bukti

bahwa protein yang diminati memang terkonsentrasi. Karena tes ini dijalankan pada setiap

langkah dalam proses pemurnian, pita berwarna harus menjadi semakin kuat, membuktikan

bahwa protein belum hilang.

Metode deteksi spesifik untuk protein yang dipisahkan oleh SDS-PAGE adalah Western

blotting (mirip dengan Southern blotting). Di Western blotting, protein ditransfer Posisi dalam

Produksi Protein.

Asisten Manufakturing (MA) adalah posisi entry-level dalam produksi protein yang

memerlukan sertifikat atau gelar associate di bidang bioteknologi, biologi, mikrobiologi,

biokimia, atau biomanufaktur. Pengusaha mengharapkan setidaknya 2 tahun pengalaman di

bidang terkait seperti pekerjaan MA di pabrik biomanufaktur menggunakan bioreaktor atau

fermentor. Beberapa fermentor digunakan untuk menghasilkan produk makanan atau enzim

untuk proses industri. Tugas pekerjaan bervariasi tergantung pada jenis manufaktur yang

dilakukan. Beberapa MA terlibat dalam pembuatan perangkat medis atau media untuk penelitian

dan pengembangan produk (biasanya protein). MA biasanya bekerja di lingkungan kamar yang

bersih. Mereka menimbang dan mengukur bahan kimia dan bahan baku yang digunakan dalam

proses pembuatan. Dalam posisi pengisian aseptik, MA menyiapkan dan mengoperasikan

peralatan yang mengisi dan mengemas produk yang dimurnikan. Pemurnian produk untuk

pengisian (wadah) adalah fungsi yang umum dan membutuhkan pemahaman tentang peralatan
pemurnian dan cara memecahkan masalah. MA harus menyimpan catatan yang akurat dan

terperinci dan memiliki pengetahuan tentang peraturan pemerintah yang berlaku untuk kegiatan

produksinya.

Teknisi manufaktur biasanya dipromosikan dari posisi MA setelah mereka menunjukkan

pengalaman dan bakat. Gaji mereka lebih tinggi dari gaji MA. Posisi ini mungkin memerlukan

gelar sarjana dalam ilmu kehidupan (selain pengalaman sebagai MA). MA di perusahaan yang

sama dapat naik ke posisi ini dengan kembali ke sekolah untuk mendapatkan gelar sarjana.

Perusahaan sering menghargai jenis pendidikan ini dan dapat mengatur jadwal kerja atau bahkan

memberikan subsidi untuk pendidikan lebih lanjut.

Insinyur bioprocessing adalah judul paling umum di bidang manufaktur untuk ilmuwan

tingkat doktor dengan gelar di bidang bioengineering dan pemahaman menyeluruh tentang

proses dan urutan yang digunakan untuk memproduksi dan memurnikan produk dalam

bioteknologi dari gel ke membran nitroselulosa dan dideteksi dengan antibodi spesifik yang

mengenali protein itu dengan strukturnya yang unik. Enzim yang dilekatkan pada antibodi dapat

digunakan untuk mengubah substrat fluoresens sehingga menghasilkan catatan deteksi yang

permanen. Dalam prosedur ini, arus listrik diberikan ke gel. Protein yang dipisahkan kemudian

bermigrasi melalui gel dan ke membran dalam pola yang sama seperti mereka terpisah pada

SDS-PAGE. Semua situs pada membran kemudian dapat diblokir sedemikian rupa sehingga

antibodi (serum) tidak akan mengikatnya secara nonspesifik untuk mendeteksi antigen yang

dibasahi pada membran; antibodi primer (serum) kemudian ditambahkan pada pengenceran yang

sesuai dan diinkubasi dengan membran. Jika ada antibodi yang ada yang diarahkan terhadap satu

atau lebih dari antigen blended, antibodi tersebut akan mengikat protein (s) sementara antibodi

lain akan tersapu pada akhir inkubasi. Untuk mendeteksi antibodi yang terikat, antibodi anti-
imunoglobulin digabungkan ke grup reporter, seperti enzim alkaline phosphatase, ditambahkan.

Akhirnya, setelah antibodi kedua berlebih dicuci bebas dari noda, ditambahkan substrat yang

mengendap pada reaksi dengan konjugat, menghasilkan pita yang terlihat di mana antibodi

primer terikat pada protein (lihat Gambar 15).

Deteksi antibodi protein spesifik juga dapat dilakukan dengan menggunakan uji

immunosorbent terkait-enzim (ELISA). ELISA yang paling umum digunakan membutuhkan dua

antibodi: satu untuk menangkap protein unik dan satu menempel pada enzim untuk

menghasilkan reaksi warna (lihat Gambar 12). ELISA terjadi pada plat multiwell menggunakan

kromatografi afinitas. Antibodi pertama terhadap protein unik disepuh pada lempeng ELISA

multiwell, protein ditambahkan, dan setelah serangkaian tahap pencucian dan pemblokiran

ditambahkan antibodi kedua (enzim yang dilampirkan). Penambahan substrat memungkinkan

reaksi warna terjadi jika antibodi telah terikat. Piring ELISA dirancang untuk menangkap banyak

protein penting yang saat ini sedang diteliti.

Mempertahankan Protein

Setelah protein target telah diisolasi, dikumpulkan, dan dimurnikan, ia harus disimpan dengan

cara yang akan mempertahankan aktivitasnya sampai dapat digunakan. Salah satu cara menjaga

protein adalah liofilisasi, atau pengeringan beku. Dalam proses ini, larutan protein cair murni

dibekukan. Vakum kemudian digunakan untuk mempercepat penguapan air dari fluida. Dalam

liofilisasi, kristal es dikonversi langsung menjadi uap air tanpa melebur menjadi air cair terlebih

dahulu. Wadah dari bahan kering beku disegel setelah air dihilangkan, meninggalkan protein

kering. Lyophilization telah ditunjukkan untuk mempertahankan struktur protein, membuatnya

menjadi metode yang umum dipilih untuk pelestarian protein yang diturunkan secara
bioteknologi. Banyak protein beku-kering dapat disimpan pada suhu kamar untuk waktu yang

lama.

PROFIL KARIR

Posisi dalam Produksi Protein

Asisten Manufakturing (MA) adalah posisi entry-level dalam produksi protein yang memerlukan

sertifikat atau gelar associate di bidang bioteknologi, biologi, mikrobiologi, biokimia, atau

biomanufaktur. Pengusaha mengharapkan setidaknya 2 tahun pengalaman di bidang terkait

seperti pekerjaan MA di pabrik biomanufaktur menggunakan bioreaktor atau fermentor.

Beberapa fermentor digunakan untuk menghasilkan produk makanan atau enzim untuk proses

industri. Tugas pekerjaan bervariasi tergantung pada jenis manufaktur yang dilakukan. Beberapa

MA terlibat dalam pembuatan perangkat medis atau media untuk penelitian dan pengembangan

produk (biasanya protein). MA biasanya bekerja di lingkungan kamar yang bersih. Mereka

menimbang dan mengukur bahan kimia dan bahan baku yang digunakan dalam proses

pembuatan. Dalam posisi pengisian aseptik, MA menyiapkan dan mengoperasikan peralatan

yang mengisi dan mengemas produk yang dimurnikan. Pemurnian produk untuk pengisian

(wadah) adalah fungsi yang umum dan membutuhkan pemahaman tentang peralatan pemurnian

dan cara memecahkan masalah. MA harus menyimpan catatan yang akurat dan terperinci dan

memiliki pengetahuan tentang peraturan pemerintah yang berlaku untuk kegiatan produksinya.

 Teknisi manufaktur biasanya dipromosikan dari posisi MA setelah mereka menunjukkan

pengalaman dan bakat. Gaji mereka lebih tinggi dari gaji MA. Posisi ini mungkin memerlukan

gelar sarjana dalam ilmu kehidupan (selain pengalaman sebagai MA). MA di perusahaan yang

sama dapat naik ke posisi ini dengan kembali ke sekolah untuk mendapatkan gelar sarjana.
Perusahaan sering menghargai jenis pendidikan ini dan dapat mengatur jadwal kerja atau bahkan

memberikan subsidi untuk pendidikan lebih lanjut.

Insinyur bioprocessing adalah judul paling umum di bidang manufaktur untuk ilmuwan

tingkat doktor dengan gelar di bidang bioengineering dan pemahaman menyeluruh tentang

proses dan urutan yang digunakan untuk memproduksi dan memurnikan produk dalam

bioteknologi.

Meningkatkan Pemurnian Protein

Protokol pemurnian protein biasanya dirancang di laboratorium dalam skala kecil. Teknik-teknik

pada tingkat produktivitas ini layak jika produk hanya dibutuhkan dalam jumlah kecil. Pesanan

antibodi monoklonal, misalnya, berada dalam kisaran gram per tahun; permintaan yang relatif

kecil. Bioreaktor skala laboratorium tunggal biasanya dapat menghasilkan jumlah yang

memadai. Namun, protein lain diperlukan dalam jumlah yang jauh lebih besar, yang berarti

bahwa metode produksi harus ditingkatkan.

Peningkatan tidak selalu mudah dilakukan. Metode laboratorium yang dapat bekerja

dalam skala kecil mungkin tidak selalu dapat beradaptasi dengan produksi skala besar. Selain itu,

perubahan dalam proses pemurnian dapat membatalkan studi klinis skala laboratorium

sebelumnya. Misalnya, ketika FDA menyetujui protein bioengineer, FDA juga menyetujui

proses untuk memproduksinya. Untuk mengubah proses, mungkin perlu meminta persetujuan

FDA sekali lagi. Untuk alasan ini, insinyur bioproses terlibat dalam tahap awal pemurnian dan

bekerja untuk memastikan bahwa mungkin untuk meningkatkan proses di kemudian hari.
Metode Analisis Pascurpurifikasi

Menyatukan Proteom Manusia dengan Protein

Selama penelitian, seringkali sangat membantu untuk melihat secara dekat protein yang

dimurnikan. Tujuannya mungkin untuk lebih memahami struktur molekul protein tertentu atau

mengubah strukturnya untuk mengubah fungsi protein. Dua metode berikut digunakan dalam

analisis protein pasca-pemurnian.

ALAT PERDAGANGAN

Menyatukan Proteom Manusia dengan Protein

Proteom, kumpulan protein yang terkait dengan fungsi kehidupan tertentu, telah menjadi lebih

penting sejak ditemukannya genom manusia. Seperti disebutkan sebelumnya, biaya membawa

obat ke pasar sekitar $ 500 juta dan membutuhkan waktu antara 5 dan 8 tahun. Karena sebagian

besar obat yang diproduksi oleh industri bioteknologi adalah protein (seperti faktor pertumbuhan,

antibodi, dan hormon sintetis) yang menggantikan protein yang hilang atau tidak berfungsi pada

manusia, perusahaan sangat tertarik untuk mengembangkan metode yang lebih murah dan lebih

cepat dalam mendeteksi bagaimana protein berfungsi dalam deteksi dan pengobatan penyakit

khususnya, mikroarray protein baru. Seperti microarrays DNA, perangkat miniatur ini

mendeteksi protein yang terkait dengan penyakit dan mereka yang hadir dalam konsentrasi

abnormal. Ketika struktur protein baru diidentifikasi, mikroarray baru dibangun.

Mikroarray protein memiliki banyak kegunaan. Sebagian besar obat biotek terbaru

berfungsi pada tingkat protein, berinteraksi dengan reseptor, memicu kejadian, dan menargetkan

protein lain dalam sel-sel tubuh. Deteksi protein biomarker menggunakan microarray telah

meningkatkan pemantauan aksi obat pada banyak penyakit. Sebagai contoh, kita semua telah
mengalami manfaat vaksin: protein yang merangsang sistem kekebalan tubuh kita untuk

mengenali organisme penyakit tanpa tertular penyakit. Produksi antibodi sebagai respons

terhadap vaksinasi adalah contoh dari efek biomarker protein dan dapat menunjukkan kekebalan

positif.

Protein mikroaray biasanya dibuat dari slide kaca yang dilapisi dengan bahan yang

mengikat protein. Terlampir pada setiap slide adalah antibodi yang spesifik untuk protein yang

akan dideteksi serta mekanisme pensinyalan yang menunjukkan penangkapan protein. Teknologi

Antibodi Cambridge (di Inggris) memiliki perpustakaan lebih dari 100 miliar antibodi yang

dikumpulkan dari darah orang sehat. Packard BioScience (di Connecticut) telah mengembangkan

microarray protein yang memungkinkan protein terlampir untuk mempertahankan bentuk tiga

dimensi saat tertanam dalam bahan pelapis. Ciphergen Biosystems (di California) telah

mengadaptasi spektroskopi massa untuk melakukan deteksi on-chip yang cepat dan analisis

protein langsung dari sampel biologis. Jadi, apa yang tersisa untuk dilakukan?

Ada banyak protein dari berbagai penyakit yang belum ditemukan. Kemampuan untuk

mendiagnosis suatu penyakit dan menentukan pengobatan yang paling efektif akan tergantung

pada kemampuan untuk memurnikan protein dan mengembangkan antibodi yang terkait dengan

penyakit tersebut. Peluang untuk mengubah kondisi penyakit manusia yang sebelumnya tidak

dapat disembuhkan tergantung pada penemuan dan pemurnian protein penting dari proteome

kehidupan. Luangkan waktu untuk mengakses situs web beberapa perusahaan yang

mengembangkan perangkat ini untuk mengimbangi teknologi penting ini (mis.,

Www.ciphergen.com, www.packardbioscience.com, atau www.biacore.com).

Pengurutan protein

Ingat dari diskusi kita tentang struktur protein bahwa setiap protein memiliki urutan asam amino

tertentu, yang dikenal sebagai urutan primer. Untuk memahami protein sepenuhnya, penting

untuk menentukan urutan utamanya. Sequencer protein otomatis memungkinkan tugas ini (lihat

Gambar 14). Dalam metode spektrometri massa, massa peptida diidentifikasi dengan tanda

tangannya yang unik (waktu retensi). Dengan mengubah peptida menjadi ion dan menjadikannya

akselerasi dalam ruang hampa, adalah mungkin untuk mengidentifikasi banyak protein unik

dalam hitungan menit.

Kristalografi sinar-X

Kristalografi sinar-X digunakan untuk menentukan struktur tersier dan kuaterner protein yang

kompleks. Metode ini membutuhkan kristal protein murni yang telah didehidrasi dengan hati-hati

dari larutan. Dibombardir dengan sinar-x, protein murni menciptakan pola bayangan spesifik

berdasarkan konfigurasinya. Analisis komputer terhadap pola-pola ini memungkinkan

pembuatan diagram “pita”, yang tidak hanya menggambarkan struktur protein tetapi juga

memungkinkan untuk merencanakan modifikasi potensial dari molekul protein untuk

meningkatkan fungsi. Kristalografi protein biasanya merupakan persyaratan untuk disetujui oleh

FDA karena memverifikasi bahwa proses menghasilkan produk yang disetujui.

4. Proteomik 

Banyak penyakit adalah hasil dari kekurangan dalam ekspresi protein, tetapi tidak semua

penyakit itu dapat dipahami hanya dalam hal mutasi genetik. Karena protein mengalami
modifikasi posttranslational, teka-teki bisa jauh lebih rumit. Suatu disiplin ilmu baru, proteomik,

didedikasikan untuk memahami hubungan kompleks dari penyakit dan ekspresi protein.

Dalam proteomik, proteom (komplemen PROTEin dengan genome) dibandingkan antara

keadaan sehat dan sakit. Variasi ekspresi protein kemudian berkorelasi dengan timbulnya atau

perkembangan penyakit tertentu. Tujuan dari penelitian proteomik adalah penemuan penanda

protein yang dapat digunakan dalam metode diagnostik baru dan pengembangan obat yang

ditargetkan untuk mengobati penyakit. Misalnya, para ilmuwan di University of California,

Davis, memurnikan protein yang diproduksi oleh BRCA2, onkogen yang terkait dengan kanker

payudara. Para peneliti kemudian dapat mensintesis protein untuk mempelajari peran BRCA2

dalam perbaikan DNA. BRAC2 rentan terhadap obat trastuzumab (Herceptin; Genentech, San

Francisco), yang telah meningkatkan tingkat kelangsungan hidup kanker payudara hingga

hampir 70 persen. Dengan cara ini, hanya pasien dengan biomarker BRAC2 yang menerima

trastuzumab, menyelamatkan ketidaknyamanan dan perawatan yang tidak perlu dari semua

pasien kanker payudara.

Meskipun gen BRCA2 ditemukan pada tahun 1994, memurnikan protein yang dibuat

oleh gen terbukti sulit, karena sangat besar, tidak mengekspresikan dengan baik, dan mudah

terdegradasi. U.C. Peneliti Davis menguji banyak garis sel yang berbeda dan berhasil

memperkenalkan gen BRCA2 ke dalam garis sel manusia dan mengekspresikannya sebagai

protein utuh. Peneliti lain menggunakan teknik rekayasa genetika untuk memproduksi protein

manusia dalam ragi. Mereka kemudian menguji protein yang dimurnikan untuk fungsinya dalam

memperbaiki DNA yang rusak. Eksperimen dengan protein BRCA2 menegaskan bahwa ia

berperan dalam memperbaiki DNA yang rusak, dan ketika itu rusak pada kanker payudara, DNA
gagal berfungsi. Penelitian berlanjut pada fungsi BRCA2 dan protein lain yang terlibat dalam

kanker payudara, tetapi kemajuan ini tidak akan mungkin terjadi tanpa proteomik.

Proteomik menerapkan beberapa teknik yang dijelaskan sebelumnya: elektroforesis dua

dimensi digunakan untuk memisahkan protein, spektrometri massa memverifikasi identitas

protein, dan protein dikarakterisasi menggunakan pengurutan asam amino. Beberapa pekerjaan

padat karya ini mungkin dibantu oleh otomatisasi di masa depan. Protein microarray adalah

seperangkat protein yang diimobilisasi pada permukaan biasanya kaca slide yang telah dilapisi

dengan pereaksi yang akan mengindikasikan pengikatan oleh perubahan warna (Gambar 16).

Gambar 16. Protein Mikroarray protein mikroarray yang secara unik berikatan dengan protein
tunggal sedang disempurnakan. Ketika protein mengikat, ia melepaskan sinyal fluoresens.
Kemampuan untuk mendeteksi keberadaan protein unik (proteomik) akan memungkinkan
pengambilan keputusan yang tepat dalam diagnosis dan terapi penyakit. dari “Antibodi
Mendeteksi Protein Bangunan” gambar 4.17, hal. 44 dari Genomics & Proteomics November/
Desember 2001. Hak Cipta © 2003 Genomics & Proteomic, publikasi Reed Business
Information, sebuah divisi dari Reed Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang.
Dicetak ulang dengan izin.

Kapasitas susunan ini telah meningkat tetapi tidak menyaingi susunan DNA karena

kesulitan produksi. Susunan DNA tunggal dapat memonitor ekspresi seluruh genom. Mikroarray
protein fungsional baru-baru ini diterapkan pada penemuan interaksi protein: protein-protein,

protein-lipid, protein-DNA, proteindrug, dan interaksi protein-protein (Gambar 17).

Gambar 17. Protein Microarrays Dapat Mendeteksi Lebih Dari Sekadar Protein Kapasitas
microarrays protein telah meningkat. Mikroarray protein fungsional baru-baru ini diterapkan
pada penemuan interaksi protein (mis. Proteinprotein, protein-lipid, protein-DNA, protein-obat,
dan proteinprotein), memperluas pengetahuan tentang pentingnya interaksi protein dengan fungsi
sel normal. Mengikat antibodi atau protein lain ke dalam matriks memungkinkan deteksi ketika
ikatan terjadi.

MEMBUAT PERBEDAAN

Seperti yang telah kita lihat, diagnosis dan pengobatan penyakit telah sangat ditingkatkan oleh

teknologi pemurnian protein. Meskipun demikian, masih ada masalah yang harus dipecahkan:

cairan biologis (plasma, serum, urin, dan saliva) memiliki berbagai konsentrasi protein yang

berbeda, dan beberapa protein konsentrasi tinggi menutupi keberadaan yang lain seperti protein

khusus penyakit yang disebut biomarker. Protein biomarker konsentrasi rendah ini sering

terdegradasi oleh enzim alami atau proses pemurnian itu sendiri. Ceres Nanosciences of Virginia
menerapkan nanoteknologi untuk pemurnian produksi untuk mengatasi masalah ini. Nanotrap

menggunakan nanopartikel berpori untuk menarik biomarker spesifik. Nanopartikel

mengecualikan protein lain karena ukuran kecil dari pori-pori pada permukaan yang harus

mereka tembus. Teknologi Nanotrap menambahkan dimensi lain pada proses pemurnian protein,

memungkinkan deteksi protein yang "menandai" adanya penyakit. Nanoteknologi membuat

perbedaan dalam pengobatan penyakit.

PERTANYAAN & AKTIVITAS

Jawaban dapat ditemukan di akhir bab ini.

1. Apa yang bisa diketahui oleh database publik tentang protein?

2. Bagaimana teknologi evolusi molekuler terarah berbeda dari mutasi yang terjadi secara alami?

3. Bagaimana pemahaman tentang struktur protein mendapat manfaat dari hasil Inisiatif Struktur

Protein?

4. Mengapa protein terutama dicari melalui produk cDNA?

5. Jika organisme menghasilkan protein sendiri, mengapa perusahaan harus mematenkan

protein?

6. Jika Anda memurnikan protein kecil dari kolom SEC, fraksi mana yang ingin Anda

kumpulkan?

7. Apakah protein yang terikat kuat pada kolom IonX dielusi dulu atau terakhir dari kolom?

8. Apakah kromatografi afinitas lebih atau kurang selektif dalam memisahkan protein daripada

kromatografi IonX?

9. Sebutkan metode pemisahan protein yang terutama digunakan dalam metode analitik (bukan

produksi).
10. Jika Anda melakukan analisis SDSPAGE setelah setiap langkah dalam urutan pemurnian

protein dan menemukan bahwa langkah terakhir mengakibatkan kurangnya pita di lokasi yang

Anda harapkan, apa artinya ini?

Kunjungi www.pearsonhighered.com/biotechnology

Untuk mengunduh tujuan pembelajaran, ringkasan bab, tautan web "Keeping Current",

glosarium, kartu flash, dan jpeg angka dari bab ini.

Jawaban atas Pertanyaan & Aktivitas

1. Ketika Anda mengakses www.ncbi.nlm.nih.gov, Anda akan menemukan tab berlabel Entrez.

Ini adalah basis data publik untuk protein, yang diperbarui oleh para peneliti dan ditinjau sejawat

secara teratur. Urutan asam amino dari protein yang umum untuk beberapa organisme dapat

dibandingkan dan struktur beberapa dari ini dapat dilihat (walaupun perangkat lunak khusus

mungkin diperlukan untuk melihat). Sebagian besar peneliti menggunakan database ini untuk

mengarahkan penelitian mereka dan menganalisis pekerjaan rekan kerja.

2. Teknologi evolusi molekuler terarah berfokus pada mutasi gen tertentu, memilih protein yang

berfungsi terbaik dari gen itu terlepas dari manfaat atau bahaya yang mungkin dimilikinya bagi

organisme.

3. PSI telah membantu para peneliti untuk menemukan fungsi protein, merancang eksperimen,

dan memecahkan masalah utama biomedis. Ini juga memungkinkan identifikasi yang lebih cepat

dari obat-obatan baru berbasis struktur yang menjanjikan, membantu menghasilkan terapi yang

lebih baik untuk mengobati penyakit genetik dan penyakit menular, dan memfasilitasi

pengembangan teknologi dan metodologi untuk produksi protein.

4. Hanya gen aktif dalam sel yang membuat mRNA, sumber cDNA.

5. Proses produksi protein sedang dipatenkan, dan langkah-langkahnya harus diulang. Produk

harus manjur jika ingin mendapatkan paten. Jika organisme menghasilkan protein sendiri,

mengapa perusahaan harus mematenkan protein? Proses paten membutuhkan pengetahuan

tentang urutan DNA, urutan asam amino, dan fungsi protein. Jika "kegunaan" protein tidak

berubah (yaitu, ia belum dipindahkan ke organisme lain), itu tidak dapat dipatenkan. Pemindahan

gen biasanya menghasilkan ekspresi protein dalam organisme yang berbeda (mis., Dalam kasus

protein tahan serangga yang telah dipindahkan ke tanaman yang rentan) untuk tujuan tertentu.

Jika paten disetujui, itu akan membutuhkan bukti baru yang dapat diverifikasi ini.

6. Fraksi paling awal.

7. Terakhir dari kolom.

8. Lebih selektif.

9. MS, HPLC, kristalografi x-ray.

 10. Prosedur kehilangan protein Anda.