IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni laboratorik (true

experimental) dengan rancangan penelitian randomized post test only control

group design yaitu peneliti mengukur pengaruh perlakuan pada kelompok

eksperimental dengan membandingkan kelompok kontrol tanpa terlebih dahulu

melakukan pre test. Pada penelitian ini menggunakan hewan tikus putih (Rattus

norvegicus) betina yang dibagi menjadi 5 kelompok yaitu 2 kelompok kontrol

(kelompok kontrol negatif dan kelompok kontrol positif) dan 3 kelompok

perlakuan.

K- O0

K+ O1

S R P1 O2

P2 O3

P3 O4

Hari 1 - 26

Gambar 4.1 Rancangan penelitian mekanisme proteksi nano kurkumin terhadap

progresivitas stres oksidatif dan apoptosis pada granulosa ovarium
tikus putih (Rattus norvegicus) yang dipapar timbal asetat (PbAc).

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

Keterangan :

S : Sampel
R : Randomisasi
K- : Kelompok kontrol negatif diberikan Minyak jagung satu jam kemudian
diberikan Aquadest hari ke 1 – 26.
K+ : Kelompok kontrol positif diberi Minyak jagung satu jam kemudian
diberikan timbal asetat (PbAc) 40 mg/kbg bb /hari, hari ke 1 – 26.
P1 : Kelompok perlakuan 1 diberi nano kurkumin 50 mg/kg bb/hari, satu jam
kemudian diberikan timbal asetat (PbAc) 40 mg/kg bb hari ke 1- 26.
P2 : Kelompok perlakuan 2 diberi nano kurkumin 100 mg/kg bb/hari satu jam
kemudian diberikan timbal asetat (PbAc) 40 mg/kg bb hari 1 - 26.
P3 : Kelompok perlakuan 3 diberi nano kurkumin 200 mg/kg bb/hari satu jam
kemudian diberikan timbal asetat (PbAc) 40 mg/kg bb hari ke 1 - 26.

4.2. Unit Eksperimen dan Replikasi

4.2.1. Unit eksperimen

Pada penelitian ini unit eksperimen yang digunakan adalah tikus putih

(Rattus norvegicus), berumur ± 2,5-3 bulan dengan berat badan 140-180 gram dan

berjenis kelamin betina dari strain wistar.

4.2.2. Replikasi

Besar replikasi

Besar replikasi menggunakan rumus Lemeshow et al., (1990) :

Keterangan:

n = Jumlah replikasi tiap kelompok

Z1-α/2 = Nilai pada distribusi normal standart yang sama dengan tingkat
kemaknaan α (untuk α= 0,05 adalah 1,96)
Z1-β = Nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan kuasa (power)
sebesar diinginkan (untuk β=0,10 adalah 1,28)
σ = Stadart deviasi kesudahan (outcome)
μ1 = Mean outcome kelompok kontrol
μ2 = Mean outcome kelompok perlakuan

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

Mengacu penelitian terdahulu tentang efek pemberian timbal asetat (PbAc)

terhadap ekspresi MDA testis tikus putih (Rattus norvegicus) didapatkan standar

deviasi kesudahan (outcome) adalah 1,87; mean outcome kelompok kontrol (μ1)

adalah 32,50; mean outcome kelompok perlakuan (μ2) adalah 35,83 (Sudjarwo et

al., 2017) dan angka drop out (f) ditetapkan 20%, maka jumlah replikasi tiap

kelompok adalah :

n = 2(1,87)2 (1,96 + 1,28)2

___________________
(32,50 - 35,83)2

n = 73,42
________
11,09

n = 6,62

n = 6,62 dibulatkan menjadi 7.

Untuk mengantisipasi hilangnya unit eksperimen dilakukan koreksi dengan rumus

1/(1-f), dimana f adalah angka drop out yang telah ditetapkan yaitu 20%.

Sehingga jumlah replikasi untuk masing-masing kelompok adalah :

n = 7 + 1/(1-0,2); n = 7 + 1/0,8; n = 7 + 1,25; n = 8,25 dan dibulatkan menjadi 9.

Jadi besar replikasi tiap-tiap kelompok adalah 9 ekor tikus putih (Rattus

norvegicus).

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.3. Kriteria Subyek Penelitian, Variabel Penelitian, dan Definisi

Operasional

4.3.1. Kriteria subyek penelitian

Kriteria Inklusi :

1. Tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur strain wistar

2. Berusia 2,5-3 bulan

3. Berat tikus putih 140-180 gram

4. Dara (Belum pernah kawin)

5. Sehat, ditandai dengan bulu halus, mata bersinar, tidak pincang, gerakan

aktif, feses tidak lembek, tidak didapatkan adanya bekas luka.

Kriteria Eksklusi :

1. Tikus pernah dipakai sebagai hewan coba penelitian lain

2. Tikus tidak mau makan, sakit pada masa adaptasi.

Kriteria drop out :

Tikus tidak mau makan, sakit atau mati pada masa perlakuan.

4.3.2. Variabel penelitian

Variabel bebas

Nano kurkumin dosis 0 , 50 , 100 dan 200 mg/kg BB.

Variabel antara :

1. Ekspresi caspase-3 sel granulosa ovarium

Variabel tergantung :

1. Ekspresi SOD sel granulosa ovarium

2. Ekspresi Glutation peroksidase (GPx) sel granulosa ovarium

3. Ekspresi MDA sel granulosa ovarium

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4. Apoptosis sel Granulosa ovarium

Variabel kendali :

1. Jenis hewan coba

2. Umur hewan coba

3. Pakan, pemeliharaan dan perawatan hewan coba

4. Kesehatan fisik hewan coba

5. Air minum hewan coba

6. Waktu perlakuan

7. Timbal asetat (PbAc)

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.3.3. Definisi operasional

Tabel 4.1 Definisi operasional variabel

Variabel Definisi Metode Bahan Hasil Skala

No operasional pengukuran yang ukur
diperiksa
.
1. Ekspresi SOD Gambaran jumlah sel Imunohistoki- Jaringan sel Angka rata- Rasio
sel granulosa granulosa ovarium mia garulosa rata dari
ovarium yang mengandung ovarium jumlah
antioksidan SOD yang ekspresi per
memberikan reaksi lapang
positif terhadap anti pandang
SOD yang dievaluasi
dengan mikroskop
cahaya 10 lapang
pandang dengan
pembesaran 400x

2. Ekspresi GPx Gambaran jumlah sel Imunohistoki- Jaringan sel Angka rata- Rasio
sel granulosa granulosa ovarium mia granulosa rata dari
ovarium yang mengandung ovarium jumlah
antioksidan GPx yang ekspresi per
memberikan reaksi lapang
positif terhadap anti pandang
GPx dengan
imunohistokimia yang
dievaluasi dengan
mikroskop cahaya 10
lapang pandang
dengan pembesaran
400x

3. Ekspresi MDA Gambaran jumlah sel Imunohistoki- Jaringan sel Angka rata- Rasio
sel granulosa granulosa ovarium mia granulosa rata dari
ovarium yang mengandung ovarium jumlah
antioksidan MDA ekspresi per
yang memberikan lapang
reaksi positif terhadap pandang
anti MDA yang
dievaluasi dengan
mikroskop cahaya 10
lapang pandang
dengan pembesaran
400x

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

Variabel Definisi Metode Bahan Hasil Skala

No operasional pengukuran yang ukur
diperiksa

4. Ekspresi Gambaran jumlah sel Imunohistoki- Jaringan sel Angka rata- Rasio
caspase-3 sel granulosa ovarium mia granulosa rata dari
granulosa yang memberikan ovarium jumlah
ovarium reaksi positif terhadap ekspresi per
anti caspase 3 dengan lapang
yang dievaluasi pandang
dengan mikroskop
cahaya 10 lapang
pandang dengan
pembesaran 400x

5. Apoptosis sel Jumlah kematian sel Tunnel Jaringan sel Angka rata- Rasio
granulosa granulosa ovarium (Terminal granulosa rata dari
ovarium akibat kerusakan deoxyribonucle ovarium jumlah
perangkat genetik atau otidyl ekspresi per
fragmen genetik yang Transferase- lapang
dievaluasi dengan mediated dUTP pandang.
mikroskop cahaya 10 Nick End
lapang pandang Labeling)
dengan pembesaran
400x

6. Nano Sediaan bahan kimia

kurkumin kuning cerah
dosis 0, 50,100 diproduksi curcuma
dan 200 mg/kg longa yang mempunya
BB aktivitas antioksidan
yang dibentuk dalam
nano partikel dan
diberikan pada tiga
kelompok perlakuan,
kelompok perlakuan
satu diberikan dosis
50 mg/ kg BB,
kelompok perlakuan
dua diberikan 100 mg/
kg BB, kelompok
perlakuan tiga 200 mg
/ kg BB.

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.4. Alat dan Bahan Penelitian

Penelitian ini menggunakan 45 tikus putih (Rattus norvegicus) betina.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel granulosa ovarium tikus

putih (Rattus norvegicus) betina berumur 2,5-3 bulan dengan berat badan 140-180

gram.

4.4.1. Alat

1. Kandang

Tikus ditempatkan di kandang plastik di ruang ber-AC dengan suhu

dipertahankan pada suhu 26C°±2C° dan 12 jam dalam siklus cahaya dan gelap.

Tikus dibagi menjadi 5 kelompok. Kelompok 1 adalah kelompok kontrol negatif

yang diberi Minyak jagung dan aquades. Kelompok 2 adalah kelompok Kontrol

positif yang mendapatkan Minyak jagung dan timbal asetat sebesar 40 mg kg bb

perhari. Kelompok 3 adalah kelompok perlakuan 1 yang mendapatkan nano

kurkumin 50 mg/kg bb dan timbal asetat (PbAc) sebesar 40 mg/kg bb, kelompok

4 adalah kelompok perlakuan 2 yang mendapatkan nano kurkumin 100mg/kg bb

dan timbal asetat (PbAc) sebesar 40 mg/kg bb. Kelompok 5 adalah kelompok

perlakuan 3 yang mendapatkan nano kurkumin 200 mg/kg bb dan timbal asetat

(PbAc) sebesar 40 mg/kg bb.

2. Alat penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah pinset, tissue basket,

inkubator, cetakan parafin, kulkas, pisau mikrotom, gelas obyek, gelas penutup,

penangas air, rak gelas obyek, pipet tetes, pipet Mohr, mikropipet, gelas piala,

gelas ukur, mikroskup cahaya dan mikrokskup photo. Serta alat suntik yang

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

digunakan adalah disposible syringe 1cc, beserta jarum khusus untuk

memasukkan perlakuan personde.

4.4.2. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain :

1. Kurkumin dalam bentuk nano partikel (nano kurkumin).

2. Timbal asetat (PbAc)

3. 45 organ ovarium tikus putih betina (Rattus Norvegicus) yang berumur 2,5-3

bulan.

4. Bahan penelitian lain sebagai penunjang pelaksanaan penelitian antara lain :

aquades, larutan Bouin, alkohol (70%, 80%, 90%, 95% dan alkohol absolut),

xylol, parafin, milli-Q (air bebas ion), larutan H2O2 3%, metanol, larutan

posphate buffer saline (PBS), serum normal 10%, backgroud sniper, antibodi

primer SOD, antibodi GPx, antibodi caspase-3, antibodi MDA, Trekkie

Universal Link, Trekkie Avidin HRP, diaminobenzide (DAB), hematoksilin,

air kran dan entelan.

4.4.3. Makanan

Tikus mendapatkan jenis dan porsi makanan dan minuman yang sama.

Tikus diberi pakan ad libitum dan diberi. minum air mineral. Semua tikus akan

mendapatkan perlakuan yg sama selama masa adaptasi 1 minggu maupun saat

mendapatkan perlakuan.

4.5. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Airlangga Surabaya pada bulan 14 Desember 2019 sampai 11 Januari

2020

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.6. Prosedur Penelitian

4.6.1. Pembuatan nano kurkumin

Pembuatan nano kurkumin dilakukan di laboratorium Fisika Universitas

Airlangga. Metode yang digunakan dalam pembuatan nano kurkumin adalah

dengan metode milling, dengan alasan bahwa secara mekanik milling merupakan

teknik yang sederhana dan efektif untuk membuat ukuran kristal padat yang cukup

besar menjadi lebih kecil tanpa melalui fase penguapan atau reaksi kimia yang

mana biasanya diperlukan dalam proses sintesa lainnya. Biaya yang dikeluarkan

menggunakan metode milling juga lebih rendah. Metode ini menggunakan mesin

High Energy Milling (HEM). Pembuatan nano kurkumin dilakukan dengan

beberapa kali uji coba pemilingan yaitu pemilingan selama 10, 20,30,40,50,60,

dan 120 menit. Hasil uji coba pemilingan menunjukkan adanya perubahan

semakin lama waktu pemilingan semakin kecil ukuran partikel dan semakin gelap

warna kurkumin. Hasil analisis nano kurkumin didapatkan pemilingan dalam

waktu 20 menit adalah nano kurkumin yang terbaik yaitu tidak mengalami

perubahan warna dan fungsi kurkumin masih efektif. Proses pembuatan nano

kurkumin dengan menggunakan bahan bubuk kurcumin merk sigma dari rimpang

curcuma longa (turmeric) produk China dan minyak jagung (minyak jagung)

sebagi pelarut kurkuma. Prinsip dalam proses pembuatan nano kurkumin ini

adalah dengan penumbukan oleh bola-bola zicornia, dengan perbandingan 1:10 (1

gram kurkumin : 10 gram bola). Dalam pembuatan nano kurkumin disiapkan

kurkumin bentuk serbuk 2 gram dan bola-bola zicornia. Kurkumin 2 gram

dimasukkan tabung beserta bola-bola zicornia, untuk selanjutnya tabung dipasang

didalam mesin High Energy milling (HEM) dan ditutup dengan kunci pas dan

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

tomol power dinyalakan. Langkah berikutnya adalah melakukan pengaturan

waktu milling. Waktu pemillingan adalah 20 menit dengan pengaturan 5 menit

milling, 5 menit istirahat (sampai jumlah waktu proses efektif pemillingan 20

menit diluar waktu istirahat). Setelah pengaturan waktu, pemillingan dimulai,

pada waktu pemillingan terjadi proses penumbukan serbuk kurkumin oleh bola-

bola zicornia.

4.6.2. pengukuran karakteristik nano kurkumin

Analisis karakteristik nano kurkumin pada penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui ukuran kurkumin sebelum dan setelah dilakukan pemillingan. Metode

yang digunakan untuk analisis ukuran nano kurkumin pada penelitian ini

menggunakan dua Metode yaitu metode Scanning Electron Microscopy (SEM)

dan Particle Size Analisis (PSA).

1. Metode Scanning Electron Microscopy (SEM)

Pelaksanaan analisis ukuran nano kurkumin dengan metode SEM pada penelitian

ini dilaksanakan di Laboratorium Robotika ITS Surabaya. Proses pelaksaan

metode SEM pada penelitian ini, langkah pertama persiapan yang meliputi

menyiapkan; sampel kurkumin dan nano kurkumin, seperangkat mesin SEM,

tempat menempel sampel, conducting glue, Hand blower, Pt dan Au. Langkah ke

dua pelaksanaan; Sampel yang sudah disiapkan ditempelkan pada tempat bahan

dengan menggunakan conducting glue. Hand blower digunakan pada sampel agar

sampel dapat menempel dengan baik pada conducting glue yang ada pada tempat

bahan. Langkah berikutnya dilakukan coating, proses coating ini untuk melapisi

sampel dengan Pt dan Au agar sampel tidak rusak saat discanning. Sampel

disimpan di ruang vakum, kemudian siap untuk dianalisa. terbentuknya gambar

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

pada SEM dibuat berdasarkan deteksi electron baru (electron sekunder) atau

electron pantul yang muncul dari permukaan sampel ketika permukaan sampel

tersebut discan dengan sinar electron. Elektron sekunder atau electron pantul yang

terdeteksi selanjutnya diperkuat sinyalnya, kemudian besar amplitudonya

ditampilkan dalam gradasi gelap-terang pada layar monitor Cathode Ray tube

(CRT). Di layar CRT inilah gambar struktur sampel yang sudah diperbesar bisa

dilihat.

2. Metode Particle Size Analisis (PSA)

Pelaksanaan analisis ukuran nano kurkumin dengan metode PSA ini

dilaksanakan di Laboratorium Material Fisika ITS Surabaya. Dalam penelitian ini

digunakan satu macam pengenceran, yaitu 10 kali dengan aquabidest. Sebelum digunakan

alat PSA dipanaskan terlebih dahulu selama ± 20 menit. Setelah itu, perangkat

kompuer yang terhubung dengan alat dinyalakan. Kemudian mulai dilakukan

pengaturan pada alat. Untuk pertama kali digunakan cara otomatis dengan bentuk

grafik distribusi standard. Sampel dilarutkan dengan larutan standar 10 kali

pengenceran dikocok menggunakan vortex mixer selama ± 1 menit. Kemudian

dimasukkan ke dalam cuvet bersih hingga terisi 2/3 cuvet. Setelah itu cuvet yang

berisi larutan standar di masukkan kedalam alat dan ditutup dengan sebuah sensor.

Sebelum diukur, suhu dikondisikan terlebih dahulu pada 25o C dengan menekan

menu “Temp.Panel”. Standar mulai diukur dengan menekan menu “Auto1”. Maka

secara otomatis alat akan mengukur besarnya ukuran partikel sebanyak tiga kali

pengukuran.

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.6.3. Perlakuan hewan coba

1. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina

diambil dari Unit Hewan Coba ITB.

2. Adaptasi/aklimasi hewan coba dilakukan selama 7 hari dalam kandang yang

bersih, cukup udara, cukup cahaya, cukup makan dan minum.

Tikus dibagi menjadi 5 kelompok, masing-masing berjumlah 9 ekor

3. Pembuatan nano kurkumin dengan metode pemillingan di laboratorium

Fisika Universitas Airlangga Surabaya.

4. Pada hari ke 8 jam 08.00, pembuatan larutan nano kurkumin, dengan cara

menimbang serbuk nano kurkumin sebanyak 2 gram dilarutkan pada minyak

jagung dan dijadikan 200 ml. Minyak jagung sebagai pelarut nano kurkumin.

Pada penelitian ini menggunakan minyak jagung sebagai pelarutan karena

minyak jagung mempunyai kemampuan memperangkap nano kurkumin

dalam micelle yang terbentuk di saluran cerna. Nano kurkumin dalam micelle

mudah ditranspor melewati barrier salauran pencernaan masuk ke dalam

serum. micelle juga membantu nano kurkumin melewati membran sel,

memasuki sitosol dalam kondisi micelle masih utuh (Maibaum et al., 2004).

5. Pada pukul 09.00 kelompok kontrol negatif diberikan Minyak jagung satu

jam kemudian diberikan Aquadest. Kelompok kontrol positif diberi Minyak

jagung satu jam kemudian diberikan timbal asetat (PbAc) 40 mg/kbg bb

/hari. Kelompok perlakuan 1 diberi nano kurkumin 50 mg/kg bb/hari, satu

jam kemudian diberikan timbal asetat (PbAc) 40 mg/kg bb hari. Kelompok

perlakuan 2 diberi nano kurkumin 100 mg/kg bb/hari satu jam kemudian

diberikan timbal asetat (PbAc) 40 mg/kg bb hari. Kelompok perlakuan 3

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

diberi nano kurkumin 200 mg/kg bb/hari satu jam kemudian diberikan timbal

asetat (PbAc) 40 mg/kg bb hari . Semua kelompok diberikan perlakukan satu

hari satu kali secara oral selama 26 hari.

6. Pengambilan ovarium tikus dilakukan setelah perlakuan terhadap hewan coba

berakhir (hari ke 27). Tikus dikorbankan dengan melakukan dislokasi pada

tekuk kepala. Kurang lebih setelah 2 menit tikus tidak bergerak yang ditandai

mata meredup dan badan tidak bergerak, Selanjutnya dilakukan pembedahan

untuk mengambil ovarium. Ovarium dibersihkan dari jaringan ikat,

kemudian dicuci dengan 0,9% NaCl fisiologis dan dimasukkan dalambuffer

formalin 10%, untuk selanjutnya diproses untuk pemeriksaan dengan

menggunakan imunohistokimia.

7. Pemeriksaan ekspresi SOD, GPx, MDA, caspase-3 metode imunohistokimia

dan apoptosis dengan metode Tunnel.

4.6.4. Metode pemeriksaan imunohistokimia

1. Sampling dan fiksasi

Ovarium yang sudah dimasukkan dalam buffer formalin 10% selanjutnya

dimasukkanan pada larutan fiksasi Bouin (dengan komposisi asam pikrat

jenuh : formalin pro-analisis : asam asetat glacial = 15 : 5 : 1 ) selama 24 jam.

Setelah organ terfiksasi, larutan diganti dengan alkohol 70% yang dikenal

sebagai stopping point dengan pengertian jaringan dapat disimpan lama pada

larutan ini.

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

2. Dehidrasi

Proses penarikan air dari jaringan (dehidrasi) dilakukan menggunakan alkohol

dengan konsentrasi bertingkat, mulai 80%, 90%, 95% (masing-masing 24 jam)

selanjutnya dengan alkohol absolut I,II dan III (masing-masing selama 1 jam).

3. Clearing (penjernihan)

Clearing bertujuan menarik alkohol dalam jaringan dan dijernihkan dengan

menggunakan xylol I, xylol II masing-masing selama 1 jam dan xylol III (30

menit pada suhu ruang dan 30 menit pada suhu 65oC.

4. Infltrasi parafin

Infiltrasi parafin bertujuan menghilangkan xylol di dalam jaringan ovarium

dan digantikan dengan parafin cair. Organ di dalam tissue basket dipindahkan

ke dalam parafin cair I, II dan III (masing-masing 30 menit). Proses ini

dilakukan di inkubator pada suhu 65OC.

5. Embedding (penanaman)

Embedding adalah menanam ovarium ke cetakan yang berisi parafin cair

untuk memudahkan pemotongan dengan mikrotom putar. Cetakan parafin

ditetesi gliserin, selanjutnya diisi dengan parafin cair sampai cembung (dalam

keadaan panas). Cetakan diisi dengan potongan jaringan ovarium yang berasal

dari cair III. Cetakan parafin kemudian dipindahkan ke colt plate beberapa

saat untuk dibekukan dan ditempeli label. Cetakan parafin dipindahkan ke

dalam air sampai membeku sempurna dan selanjutnya dimasukkan ke dalam

lemari pendingin selama satu malam. Parafin yang telah membeku sempurna

dikeluarkan dari cetakan dengan mengungkit salah satu bagian cetakan.

Parafin disekitar organ dipotong membentuk segi empat dan ditempelkan pada

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

blok kayu. Blok parafin disimpan didalam lemari pendingin sebelum dipotong

dengan mikrotom.

6. Sectioning (pemotongan)

Ovarium dalam blok parafin disayat serial menggunakan mikrotom rotary

dengan ketebalan 4 - 5μm, dilekatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi

dengan alkohol 70% atau 0,2% neofrien ® dalam toluene, kemudian disimpan

dalam inkubator 37 - 40OC minimal selama 24 jam. Preparat jaringan sebelum

diwarnai disimpan kembali pada inkubator suhu 65OC selama 3 menit untuk

penyempurnaan penempelan jaringan.

7. Pewarnaan Imunohistokimia

Pewarnaan imunohistokimia dimulai dengan deparafinisasi (xylol III,

II, I). dan rehidrasi (alkohol absolut III, II, I, alkohol 95%, 90%, 80% dan

70%) masing-masing selama 3 menit. Preparat jaringan selanjutnya direndam

dalam milli-Q selama 3 menit. Tahapan berikutnya inaktivasi peroksidase

endogen dengan memasukkan preparat jaringan ke dalam campuran 300μL

H2O2 3% dan metanol 30 mL selama 3 menit. Inaktivasi peroksidase

dilakukan pada keadaan gelap. Preparat jaringan dibilas dengan milli-Q (2 kali

masing-masing 5 menit) dan BPS (2 kali masing-masing 5 menit). Selanjunya

preparat jaringan diinkubasi serum normal 10% selama 45-60 menit untuk

memblok protein non spesifik dan dibilas dengan BPS (3 kali masing-masing

5 menit). Inkubasi dilakukan pada suhu 4OC. Selanjutnya preparat jaringan

diinkubasi dengan backgroud sniper (15 menit), antibodi primer SOD, GPx,

MDA, caspase-3 (2x 24 jam), Trekkie Universal Link (20 menit) dan Trekkie

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

Avidin-HRP (10 menit). pembilasan dengan PBS sebanyak 3 kali selama 5

menit dilakukan disetiap pergantian larutan.

Hasil reaksi antigen-antibodi divisualisasikan menggunakan DAB

selama 2 menit. Preparat jaringan direndam dalam milli-Q selama 10 menit.

Selanjutnya dilakukan counterstain hematoksilin selama 1 menit. Preparat

jaringan direndam dalam air kran selama 10 menit dan akuades selama 5

menit. Preparat jaringan didehidrasi dengan alkohol bertingkat 70%, 80%,

90%, 95% (masing-masing 3 detik), alkohol absolut I (3 detik), alkohol

absolut II dan III ( masing-masing 1 menit)

Tahapan selanjutnya adalah clearing pada xylol I (3 detik), xylol II

dan xylol III (masing-masing selama 1 menit). tahapan terakhir dilakukan

mounting menggunakan entelan. Hasil pewarnaan imunohistokimia terhadap

SOD, GPx, MDA dan caspase-3 diamati. Dalam pewarnaan imunohistokimia,

reaksi positif ditunjukkan dengan munculnya warna coklat pada bagian sel

yang mempunyai spesifisitas dengan antibodi primer yang digunakan.

Antibodi primer yang digunakan dalam pewarnaan imunohistokimia terhadap

preparat histologi mempunyai spesifitas untuk mendeteksi apa yang diperiksa.

Hasil pewarnaan imunohistokimia diamati menggunakan mikroskup cahaya

dan didokumentasikan dengan mikroskop foto.

8. Pengamatan pewarnaan imunohistokimia

Pengamatan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Pengamatan kualitatif

dilakukan dengan mengamati intensitas warna dan distribusi warna coklat

pada jaringan. Reaksi positif (+) yang terbentuk menunjukkan kandungan

antioksidan pada jaringan, semakin banyak nilai positif (+) berarti semakin

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

tinggi kandungan antioksidan. Pengamatan kuantitatif dilakukan dengan

menghitung jumlah inti sel yang bereaksi terhadap pewarnaan

imunohistokimia pada 10 lapang pandang yang berbeda dengan pembesaran

400x. Reaksi negatif (-) ditunjukkan dengan warna biru pada inti sel, yang

berarti sel tidak mengandung antioksidan.

4.6.5. Metode pemeriksaan Tunnel

Metode untuk mendeteksi sel yang mengalami apoptosis dapat didasarkan

pada karakteristik apoptosis itu sendiri, contohnya adalah fragmentasi DNA.

Metode yang umum untuk mendeteksi fragmentasi DNA secara enzimatik adalah

Tunnel (Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End

Labeling). pemeriksaan apoptosis dengan metode Tunnel dapat memberikan

gambaran proses apoptosis pada tingkat sel tunggal sehingga lebih spesifik dan

memiliki akurasi yang tinggi. Reagen Tunel terdiri dari enzim terminal trasferanse

yang bertugas mengnali ujung-ujung 3’OH (nek end) yang dihasilkan oleh

gfragmen DNA dan fluorescein-dUTP untuk memvisualisasikan ujung 3’OH

tersebut yang dapat diamati menggunakan mikoskup fluoresense atau flow

cytometry.

Untuk memvisualisasikan perbandingan sel apoptosis dengan non apoptosis

dalam satu lapang pandang pengamatan, digunakan metode double staining

menggunakan reagen Tunnel dan propidium iodida. Tunnel hanya akan

mendeteksi sel apoptosis dan memberikan fluoresense hijau, sedangkan propidium

iododa akan mendeteksi sel non apoptosis dan memberikan fluoresensi merah. Sel

yang mengalami apoptosis diperiksa dengan menggunakan metode Tunnel. Sel

yang mengalami apoptosis tampak berwarna coklat pada daerah inti sel.

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

Pemeriksaan indeks apoptosis dilakukan dengan menghitung sel positif pada 400x

pembesaran dan dihitung dalam 10 lapang pandang daerah pembacaan.

Metode pemeriksaan Tunnel diawali dengan deparafin preparat (blok

paraffin) dengan xylene sebanyak 3x, masing-masing 3 menit, kemudian

dilakukan rehidrasi pada preparat dengan menggunakan etanol 100%, 95%, dan

75% masing-masing 2 menit, 2 menit, satu menit dan terakhir dilakukan rehidrasi

preparat dengan aquades stiril. Langkah berikutnya preparat diberi tetesan 50μl

Tunnel labeling mix (terdiri dari 5μl enzim terminal deoxynucleotydil transferase

dan 45 μl fluorescenin-dUTP) dan preparat ditutup dengan siliconize cover slip.

Langkah berikutnya dilakukan inkubasi preparat pada suhu 37Co selama 30 menit

di dalam mois chamber dan dilakukan pencucian dengan PBS (phosphate buffer

saline) sebanyak 3x. proses berikutnya dilakukan inkubasi Rnase Solution pada

suhu 37Co selama 30 menit, kemudian dilakukan pencucian dengan PBS sebanyak

3x dan dilakukan inkubasi preparat dengan larutan propidium iodide pada suhu

ruang selama 10 menit. Langkah terakhir adalah dilakukan pencucian preparat

dengan PBS 3x dan ditutup dengan cover slide diameter 18mm. Selanjutnya

dilakukan pengamatan sel apoptosis dengan menggunkan mikroskup fluoresense

10 lapang pandang dengan pembesaran 400x.

4.7. Alur penelitian

1. Seluruh hewan coba yang digunakan diambil dari Unit Hewan Coba Institut

Teknologi Bandung (ITB).

2. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina

yang berumur 2,5-3 bulan dengan berat 140-180 gram, dipilih berdasarkan

kriteria inklusi dan eksklusi.

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

3. Adaptasi hewan coba selama 1 minggu sebelumnya dikandang yang bersih,

cukup udara, cukup cahaya, makanan minuman yang cukup dan homogen.

4. Tikus putih betina dibagi menjadi 5 kelompok. Kelompok 1 adalah kelompok

kontrol negatif yang diberi Minyak jagung dan aquades. Kelompok 2 adalah

kelompok Kontrol positif yang mendapatkan Minyak jagung dan timbal asetat

sebesar 40 mg kg bb. Kelompok 3 adalah kelompok perlakuan 1 yang

mendapatkan nano kurkumin 50 mg/kg bb dan timbal asetat (PbAc) sebesar

40 mg/kg bb, kelompok 4 adalah kelompok perlakuan 2 yang mendapatkan

nano kurkumin 100mg/kg bb dan timbal asetat (PbAc) sebesar 40 mg/kg bb.

Kelompok 5 adalah kelompok perlakuan 3 yang mendapatkan nano kurkumin

200 mg/kg bb dan timbal asetat (PbAc) sebesar 40 mg/kg bb.

5. Pengambilan bahan sempel pada hari ke-27.

6. Pemeriksaan ekspresi SOD, GPx, MDA, caspase 3 dengan pemeriksaan

Imunohistokimia dan apoptosis sel granulosa ovarium dengan pemeriksaan

Tunnel.

7. Data penelitian dicatat dalam formulir pengambilan data.

4.8 Pengumpulan Data

Pengumpulan data adalah teknik pemeriksaan terhadap variabel dependen.

Pemeriksaan variabel dependen dilakukan oleh petugas yang sudah terlatih di

Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya

dengan di dampingi oleh peneliti

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.9 Pengolahan dan Analisis Data

4.9.1 Pengolahan data

Data penilitian ini dicatat dalam formulir pengambilan data. Analisis data

menggunakan software SPSS (Software Package for Social Science).

4.9.2 Analisis data

Analisis data dilakukan setelah hasil penelitian terkumpul semua. Analisis

data dilakukan dengan menggunakan :

1. Analisis Deskriptif

Uji digunakan untuk menggambarkan frekuensi, rerata dan standart deviasi

pada masing-masing kelompok.

2. Uji Normalitas Distribusi : Uji ini menggunakan Shapiro-Wilk Test untuk

mengetahui distribusi atau sebaran data apakah data berdistribusi normal atau

tidak pada masing-masing variabel dan masing-masing kelompok.

3. Uji Homogenitas Variansi

Uji menggunakan Levene Test, untuk mengetahui apakah data homogen atau

tidak, sebagai persyaratan untuk uji berikutnya.

4. Uji Anova Satu Arah dengan Taraf Signifikansi 0,05

Dilakukan uji beda pada masing-masing variabel, apabila dari analisis varian

didapatkan ada pengaruh perlakuan pada variabel dependen, dilanjutkan

dengan uji LSD untuk mengetahui bermakna atau tidaknya beda antar

kelompok.

5. Uji Kruskal-Wallis dan Mann Whitney

Dilakukan apabila tidak memenuhi asumsi Anova maka dilakukan uji

Kruskal-Wallis untuk mengetahui adanya perbedaan antar kelompok pada

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

masing-masing variabel. Apabila terdapat perbedaan antar kelompok

dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk mengetahui bermakna atau

tidaknya beda antar kelompok.

6. Analisis jalur, digunakan untuk mengetahui mekanisme pengaruh nano

kurkumin terhadap berbagai variabel, seperti gambar 4.3. Analisis jalur

menggunakan PLS (Partial Least Square) dengan software Smart PLS for students.

SOD

Nano MDA
kurkumin
Caspase-3 Apoptosis

GPx

Gambar 4.4 Skema diagram analisis jalur Analisi jalur menggunakan metode PLS
(Partial Least Square) dengan software Smart PLS for students.

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH

 IR - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.9.3 Alur penelitian

Tikus putih betina usia

2,5 -3 bulan, berat badan

140-180 gram

Adaptasi 1 minggu

Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok

K- K+ P1 P2 P3

Pemberian Pemberian Pemberian Pemberian Pemberian

Minyak Minyak nano nano nano
jagung jagung kurkumin kurkumin kurkumin
50mg/kg bb 100mg/kg 200mg/kg
bb bb
Selang 1 Selang 1
jam jam selang 1 jam selang 1 jam selang 1 jam
diberikan Pb diberikan Pb diberikan Pb diberikan Pb
diberikan
40 mg/kg bb 40 mg/kg bb 40 mg/kg bb
aquades 40 mg/kg bb hari ke 1-26
hari ke 1-26 hari 1-26 hari ke 1-26 hari ke 1- 26

Hari ke-27
Pengambilan sel granulosa
ovarium

Pemeriksaan ekspresi SOD, GPx, MDA,

caspase-3 dan apoptosis sel granulosa ovarium

Gambar 4.5 Alur Penelitian

DISERTASI MEKANISME PROTEKSI NANO ... ANIS SATUS SYARIFAH