ROUTINE BLOOD SCREENING FOR ANEMIA

HEMOGLOBIN (CYANMETHMOGLOBIN METHOD)

Prinsip Percobaan
Whole blood ditambahkan ke dalam reagen cyanmethemoglobin (HiCN). Potassium ferricyanide
(K3FeCN6) dalam reagen akan mengonversi besi hemoglobin dari ferro (Fe2+) menjadi ferri (Fe3+)
untuk membentuk methemoglobin yang akan bereaksi dengan K3FeCN6 membentuk
cyanmethemoglobin yang lebih stabil. Setelah itu larutan dibaca absorbansinya pada 540 nm.
Absorbansi yang didapat berbanding lurus dengan konsentrasi hemoglobin.

Spesimen
Whole blood dengan EDTA; darah kapiler.

Alat dan Reagen

1. Cyanmethemoglobin (HiCN) reagent, yang mengandung:
- Potassium cyanide 50 mg
- Potassium ferricyanide 200 mg
- Dihydrogen potassium phosphate 140 mg
- Nonionic detergent 1 mL
- Semuanya dalam 1 L distilled water

2. Tabung reaksi
3. Pipet 0.02 mL
4. Spectrophotometer ( α: 540 nm)

Prosedur
1. Masukkan masing-masing 5 mL HiCN reagent ke dalam 2 tabung reaksi: sample dan blanko.
2. Tambahkan 0.02 mL whole blood ke dalam tabung sampel. Bilas pipet 3 – 5 kali dengan HiCN
reagent hingga pipet bersih dari darah.
3. Campur larutan dan tunggu selama 3 menit dalam suhu kamar.
4. Pindahkan larutan ke dalam cuvette untuk dibaca absorbansinya pada 540 nm.

Nilai Normal
Laki-laki : 13 – 18 g/dL
Perempuan : 11.5 – 16 g/dL
Anak-anak : 11 – 16 g/dL
Ibu hamil : 11 – 12 g/dL

Interpretasi
Peningkatan : jarang ditemukan.
Penurunan : kurangnya intake besi, gangguan absorbsi besi, blood loss, hypervolemia.
Teori
Besi ferro (Fe2+) dari hemoglobin rentan terhadap adanya oksidasi oleh oksidan kuat hasil
metabolisme sel tubuh. Proses oksidasi tersebut akan mengubah besi ferro (Fe 2+) dari hemoglobin
menjadi ferri (Fe3+) untuk membentuk methemoglobin yang tidak memiliki kemampuan untuk
mengangkut oksigen. Methemoglobin terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit di dalam darah
karena adanya mekanisme untuk mereduksi kembali ferri (Fe3+) menjadi ferro (Fe2+) oleh NADH,
methemoglobin reduktase, dan sitokrom b5.
Methemoglobinemia diklasifikasikan menjadi inherited atau acquired methemoglobinemia. Inherited
methemoglobinemia dapat disebabkan oleh defisiensi enzim methemoglobin reduktase yang
diturunkan secara autosomal resesif. Acquired methemoglobinemia dapat disebabkan oleh konsumsi
obat-obatan seperti sulfonamide dan zat kimia seperti aniline dye. Manifestasi klinis paling khas dari
methemoglobinemia adalah sianosis pada kulit dan membran mukosa. Diagnosis dapat ditegakkan
dengan analisis spektroskopik yang akan menunjukkan absorbansi khas terhadap hemoglobin. Terapi
yang dapat diberikan untuk methemoglobinemia antara lain adalah ingesti methylene blue dan asam
askorbat.

HEMATOCRIT MEASUREMENT (MICROHEMATOCRIT METHOD)

Prinsip Percobaan
Whole blood disentrifugasi untuk mendapatkan packed red cell. Banyaknya eritrosit dalam tabung
diekspresikan sebagai persentase terhadap volume whole blood.

Spesimen
Whole blood dengan EDTA.

Alat dan Reagen

1. Microhematocrit tube
2. Clay-like sealing blood
3. Centrifuge
4. Microhematocrit tube reader

Prosedur
1. Masukkan dua microhematocrit tube ke dalam wadah spesimen hingga darah naik sampai 2/3
tabung.
2. Tutup ujung microhematocrit tube dengan clay material dengan cara menekannya ke clay
material secara vertikal.
3. Letakkan dua microhematocrit tube pada posisi yang berlawanan pada centrifuge. Ujung dengan
clay material mengarah ke luar.
4. Sentrifugasi 10,000 rpm selama 5 menit.
5. Baca hasil keduanya pada microhematocrit tube reader. Hasil dinyatakan dalam persen atau
bentuk desimal.

Nilai Normal
Laki-laki : 40 – 48%
Perempuan : 37 – 43%

Interpretasi
Peningkatan : DHF, polycytaemia vera, hypoxia, dehidrasi.
Penurunan : hemorrhage, excessive hydration.

RED BLOOD CELL COUNT

Prinsip Percobaan

Whole blood didilusi dengan larutan pengencer isotonis untuk mencegah lisis eritrosit sehingga
mempermudah proses penghitungan.

Spesimen

Whole blood dengan EDTA atau heparin; darah kapiler.

Alat dan Reagen

1. Thoma red count pipette
2. Hayem solution (red count diluting fluid), yang mengandung:
- Sodium sulphate 2.5 g
- Sodium chloride 0.5 g
- Mercury chloride 0.25 g
- Aquadest 100 mL

3. Mikroskop
4. Clean gauze
5. Hemocytometer dan cover glass

Prosedur
1. Ambil darah dengan pipet eritrosit hingga tanda 0.5 dan ambil Hayem solution hingga tanda 101
(dilusi 1:200).
2. Campur selama 3 menit.
3. Bersihkan counting chamber.
4. Isi counting chamber dengan larutan. Biarkan selama 3 menit.
5. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x. Cari area dengan distribusi eritrosit yang
merata dan temukan satu kotak besar di tengah counting chamber yang terdiri dari 25 kotak
kecil.
6. Gunakan perbesaran 40x.
7. Hitung eritrosit pada 4 kotak kecil di masing-masing sudut dan 1 kotak kecil di tengah. Hitung
hanya eritrosit yang menyentuh dua batas luar yang ditentukan.
8. Hitung hasilnya dengan rumus berikut:
Nilai Normal
Laki-laki : 4.2 – 6 x 1012/L
Perempuan : 3.6 – 5.6 x 1012/L
Newborn : 5 – 6.5 x 1012/L

Interpretasi
Peningkatan : polycytaemia vera, hypoxia, renal cell carcinoma.
Penurunan : anemia, hemorrhage, ineffective erythropoiesis.

Teori
Anemia merupakan kondisi menurunnya jumlah eritrosit atau rendahnya kadar hemoglobin dalam
darah. Selain itu, anemia dapat terjadi karena adanya massa eritrosit yang rendah atau peningkatan
volume plasma. Karena hemoglobin dalam eritrosit normalnya berfungsi untuk mengangkut oksigen
dari paru-paru menuju jaringan tubuh, anemia dapat menyebabkan terjadinya hipoksia dan
selanjutnya terjadi gangguan metabolisme sel pada organ yang terpengaruh.
Terdapat beberapa jenis anemia yang diklasifikasikan menurut morfologi eritrosit, etiologi, dan
sebagainya. Tiga sebab utama terjadinya anemia adalah excessive blood loss pada chronic
hemorrhage, excessive erythrocyte destruction pada anemia hemolitik, dan defek pada produksi
eritrosit. Manifestasi klinis anemia secara umum adalah general malaise, fatigue, dyspnea, palpitasi,
pucat, dan intermittent claudication. Diagnosis anemia dapat ditegakkan dengan pemeriksaan
complete blood count, flow cytometry, dan pemeriksaan mikroskopik dengan apusan darah. Terapi
anemia salah satunya adalah suplementasi besi (ferrous suphate) dan ingesti vitamin C untuk
membantu absorbsi besi. Transfusi darah dibutuhkan ketika kadar hemoglobin <7 g/dL.

RETICULOCYTE COUNT
Prinsip Percobaan

Setelah orthochromic normoblast kehilangan nukleusnya, sejumlah kecil RNA akan menetap di dalam
eritrosit. Sel ini dinamakan retikulosit. Untuk mendeteksi adanya RNA, eritrosit harus diberi
pewarnaan selama mereka masih hidup (supravital staining).

Spesimen

Whole blood dengan EDTA (1 mL); darah kapiler.

Alat dan Reagen

1. Reticulocyte stain dapat menggunakan salah satu dari dua metode berikut:
a. New Methylene Blue Stain, terdiri dari:
- New methylene blue 1.0 g
 - Sodium chloride 0.89 g
- Distilled water 100 mL

b. Brilliant Cresyl Blue Stain, terdiri dari:

- Brilliant cresyl blue 1.0 g
- Sodium chloride 0.85% 99 mL

2. Tabung reaksi
3. Gelas objek
4. Mikroskop

Prosedur

1. Masukkan 3 tetes reticulocyte stain ke dalam tabung reaksi.

2. Tambahkan 3 tetes whole blood ke dalam tabung reaksi yang sama.
3. Campur dan biarkan pada suhu kamar atau inkubasi pada 37oC selama 15 menit.
4. Campur kembali larutan.
5. Buatlah apusan darah.
6. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x untuk menemukan area dengan eritrosit
yang merata dan tidak saling berdekatan atau menyentuh satu dengan lainnya. Beri minyak
imersi dan amati dengan perbesaran 100 x untuk menemukan area dengan jumlah eritrosit 100 –
200 per lapang pandang.
7. Hitung retikulosit. Retikulosit akan berwarna kehijauan dengan RNA yang berwarna biru gelap.
Hitung jumlah retikulosit pada beberapa lapang pandang hingga berjumlah 1000 eritrosit pada
lapang pandang yang dilihat.
8. Hitung sebanyak dua kali. Nilai rata-rata reticulocyte count dapat dihitung dengan rumus berikut:

Nilai Normal
Retikulosit hanya berkisar 0.8 – 2% dari total eritrosit, atau <85 x 109/L.

Interpretasi
Peningkatan : anemia hemolitik, chronic hemorrhage, ingesti ferrous sulphate.
Penurunan : chemotherapy, anemia aplastic, bone marrow malignancies.

Teori
Tahap perkembangan eritrosit terdiri dari beberapa tingkatan maturitas, dimulai dari pronormoblast,
basophilic normoblast, orthochromic normoblast, retikulosit, dan eritrosit matur. Retikulosit tampak
sedikit lebih besar dibandingkan dengan eritrosit matur. Tahapan sebelum retikulosit terjadi di dalam
bone marrow. Retikulosit sendiri dapat ditemukan pada bone marrow dan darah tepi. Retikulosit
memiliki ribosomal RNA dan mampu melakukan sintesis protein, tidak seperti eritrosit matur. Ketika
retikulosit memasuki sirkulasi darah, dalam 24 jam retikulosit akan menjadi matur dan kehilangan
kemampuannya untuk melakukan sintesis protein. Reticulocyte count berfungsi sebagai indikator
aktivitas bone marrow dan merefleksikan produksi eritosit yang efektif, sedangkan reticulocyte
production index merupakan suatu uji untuk menilai apakah bone marrow sudah melakukan aksi
yang cukup sebagai respon dari anemia. Apabila produksi retikulosit tidak meningkat ketika terjadi
anemia, maka penyebab dari anemia tersebut adalah kausa akut, sehingga tidak terdapat cukup
waktu untuk melakukan kompensasi.

ERYTHROCYTE INDICES
Teori
Indeks eritrosit digunakan untuk menentukan ukuran dan kadar hemoglobin eritrosit. Indeks eritrosit
meliputi Mean Corpuscular Volume (MCV), Mean Corpuscular Hemoglobin (MCH), dan Mean
Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC). Uji ini dilakukan untuk membantu menentukan
diagnosis dan membedakan jenis-jenis anemia.

1. Mean Corpuscular Volume (MCV)

Menggambarkan volume eritrosit dalam satuan femtoliter. Rumusnya adalah sebagai berikut:

2. Mean Corpuscular Hemoglobin (MCH)

Menggambarkan massa hemoglobin dalam eritrosit, serta berkorelasi dengan MCV dan MCHC.
Rumusnya adalah sebagai berikut:

3. Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC)

Menggambarkan konsentrasi hemoglobin dalam eritrosit. Rumusnya adalah sebagai berikut:

Nilai Normal
MCV : 80 – 100 fL
MCH : 27 – 31 pg
MCHC : 31 – 36 g/dL

Interpretasi
Peningkatan MCV (macrocytic): anemia megaloblastik karena defisiensi asam folat atau vitamin B12,
anemia pernisiosa, cytotoxic drugs.
Penurunan MCV (microcytic): anemia defisiensi besi, thalassemia, elliptocytosis, anemia
sideroblastik.
MCV normal (normocytic): normocytic anemia karena acute blood loss, anemia karena penyakit
kronis, dan anemia hemolitik.
Peningkatan MCH dan MCHC (hyperchromic): jarang ditemukan.
Penurunan MCH dan MCHC (hypochromic): anemia defisiensi besi, thalasemia, anemia sideroblastik.

MORPHOLOGIC EVALUATION OF ERYTHROCYTES

Teori
Pemeriksaan apusan darah tepi yang teliti dan komprehensif sangat diperlukan untuk mendapatkan
informasi mengenai morfologi, ukuran, konsentrasi hemoglobin, dan badan inklusi dalam eritrosit
demi menentukan jenis anemia dan penyakit lainnya.
Eritrosit normal berbentuk bikonkaf dengan diameter 6 – 8 µm dan tidak memiliki nukleus. Eritrosit
dengan kandungan hemoglobin normal akan berwarna pucat di bagian tengahnya yang menempati
1/3 dari diameter. Normalnya tidak terdapat badan inklusi di dalam eritrosit.

Interpretasi
1. Distribusi:
- Normal
- Abnormal : rouleaux, aglutinasi.

2. Variasi ukuran (anisocytosis):

- Normocytic : acute blood loss, anemia karena penyakit kronis.
- Microcytic : anemia defisiensi besi, thalassemia, anemia sideroblastik.
- Macrocytic : defisiensi asam folat atau vitamin B12.

3. Variasi bentuk (poikilocytosis):

- Oval macrocytic : anemia megalobastik, defisiensi asam folat atau vitamin
B12.
- Sel target (codocytes/leptocytes) : thalassemia, hemoglobinopathy, anemia defisiensi besi,
liver disease, thalassemia.
- Teardrops (dacryocytes) : myelofibrosis with myeloid metaplasia.
- Elliptocytes : hereditary elliptocytosis, anemia defisiensi besi.

4. Kandungan hemoglobin:
- Normochromic
- Hypochromic : anemia defisiensi besi, thalassemia, anemia sideroblastik.
- Hyperchromic : jarang ditemukan.

5. Badan inklusi:
- Polychromatophilic red cells : reticulocytes.
- Protozoan inclusions : malaria.