BLOK A.

Disusun oleh
Dewan Asisten Biokimia Pendidikan Dokter 2009

Reagen Resadita Medischa Roza

Yogik Onky S. W Nunik Fatmawati
M. Aprianto Ditya Dewi
Dwi Jatmiko Rima Astari
M. Rezqa Kalifa Dwi Utari Pratiwi
Rasita Richa
Qistira

Dewan Asisten Biokimia 2009 1

 C. Praktikum MetHb

Prinsip • Apabila terapat sulfhemoglobin pd hemolisat,

Sample darah dilisiskan dengan cara akan terjadi peningkatan pd kurva absorbansi
menambahkan sample dengan aquadest
antara 600-620 nm.
sample yg sudah terlisis dicampur dengan • Spectrum absorbansi normal menunjukkan
K3Fe(CN)6 untuk mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+
absorbansi yg sedikit di atas 600nm.
tambahkan hasil campuran dengan KCN untuk
memperoleh cyan met Hb
ukur absorbansi Reagen dan Fungsinya
pada 630nm
menentukan rasio met Hb asli dg • Aquadest = melisiskan eritrosit
metHb “buatan” keseluruhan. • Buffer fosfat = menjaga pH darah
Dengan bahasa yg lebih jlimat, bisa dikatakan • K3Fe(CN)6 = mengoksidasi Fe2+ dalam Hb
seperti ini : menhadi Fe3+
• Spectrum absorbansi met Hb menunjukkan • KCN= mengubah metHb menhadi Cyan
karakteristik puncak yg khas dan kecil, yaitu metHb.
630-635 nm.
• Penambahan sianida akan menurunkan Perlakuan
puncak spectrum ini karena met Hb akan • Perlakuan yg dilakukan hanya menutup
berubah menjadi cyn met Hb. tabung reaksi dengan menggunakan parafilm
• Penurunan absorbansi sebanding dengan dan membolak balik sebanyak tiga kali, hal ini
kadar metHb dalam darah. bertujuan untuk homogenisasi.
• Pengukuran absorbansi dilakukan untuk
mencari kadar metHb.
Prosedur :
blanko C1 sample C2 sample C3
whole blood - 0,1 ml 0,1 ml
aquadest 1,5 ml 3 ml 3 ml
buffer fosfat 1,5 ml 0,4 ml 0,4 ml
Divortex
3ml hemolisat 3 ml hemolisat
0,1 ml tutup dengan
K3Fe(CN)6 parfilm
campur dengan baik
setelah 2 menit baca absorbansi pada 630 nm
catat sebagai C1a C2a C3a
KCN 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
campur dengan baik (tutup dahulu dg parafilm), biarkan dalam 5 menit, baca pada 630.
catat sebagai C1b C2b C3b

Dewan Asisten Biokimia 2009 7

Hasil yg akan Diperoleh  Tipe I pada eritrosit
menyababkan
Dalam praktikum kali ini ini kita akan menghitung sianosis
kadar metHb dengan menggunakan absorbansi  Tipe II menyerang otak, hepar, fibroblast.
campuran. Rumus yg kita pakai sederhana, tetapi  Tipe III terjadi pada semua sel darah.
terdapat beberapa variable yg perlu kita ingat  Tipe IV pada eritrosit yg menyebabkan
kembali. sianosis kronis.
 Definisiensi G6PD
 HbM disease yg menyebabkan residu
histidine yg mengikat hem eke globin
%metHb =
digantikan oleh tyrosin sehingga Hb rentan
terhadap oksidasi.
Dimana,
 Defisiensi piruvat kinase.
A2a = C2a – C1a
A2b = C2b – C1b
• Acquired
A3a = C2a – C1a
 Obat-obatan anestesi local
lidocaine,
A3b = C3b – C1b
procaine, benzocaine
Keterangan:
 Obat-obatan
quinine, phenacetin,
• C1a = blanko untuk “a”
dapsone, sulfonamide
• C2a = larutan yg mengandung metHb asli,
 Aniline dye
zat kontras radiografi.
bukan karena pengaruh K3Fe(CN)6
 Klorat dan nitrit.
• C2b = larutan yg berisi cyanmetHb dari C2a.
• C1b = sebagai blanko untuk “b” Gejala metHbemia berdasarkan kadarnya
• C3a = berisi metHb yg berasal dari metHb asli dalam darah :
dalam darah maupun oleh pengaruh K3Fe(CN)6 . konsentrasi gejala
• C3b = berisi cyanmetHb yg berasal dari <10% Asiymptomatic
perubahan metHb oleh KCN dari larutan C3a. 10-20% Diskolorasi kulit, terutama
20-30% mukosa
Interpretasi Hasil & Korelasi Klinis 30-50% Khawatir, sakit kepala, dispnea,
Methbemia merupakan kondisis patologis, 50-70% takchycardi
dimana kadar metHb dalm tubuh melebihi 1,5%. >70% Lemah, bingung, pusing,
Penyebabnya antara lain : tachypnea, palpitasi
• Congenital Koma, kejang, aritmia, asidosis
 Defisiensi NADH reduktase, dan merupakan kematian
autosom resesif:

Dewan Asisten Biokimia 2009 8

 D. Praktikum Kimia Darah
1. Koagulasi darah
a. 2ml darah oksalat + 2-5 tetes CaCl2 5%
koagulasi
b. 2 ml darah defibrilasi + 2-5 tetes CaCl2 5%
tidak
koagulasi
Pembahasan :
a. Darah oksalat (masih ada fibrinogen ) itu ion
kalsium nya diikat oleh oksalat, saat ditambah
CaCl2, maka darah akan kembali memiliki kalsium
yang cukup untuk memulai proses koagulasi
kembali
b. Darah defibrilasi sudah tidak mengandung
fibrinogen, sehingga faktor koagulasi sudah tidak
lengkap dan walaupun ada ion kalsium tidak akan
terjadi koagulasi.
2. Serum Protein
a. 5 ml serum + 5 ml ammonium sulfat
saring
(endapan tersaring) *globulin mengendap, albumin
ttp larut*
- Endapan + sedikit air
larut kembali
- Endapan + banyak air
tidak larut
b. Filtrat (albumin) + ammonium sulfat padat

mengendap
- Endapan + sedikit air
larut
- Endapan + banyak air
larut
Pembahasan : fungsi ammonium sulfat aladalah
menarik gugus H2O dari gugus polar protein (-NH, -
NH2, -COOH,-OH) sehingga protein akan mengendap.
a. Sifat globulin mengendap di garam setengah jenuh.
serta tidak larut dalam air. Pada saat
menambahkan sedikit air, gugus H20 yang telah
ditarik oleh ammonium sulfat akan kembali terisi,
tapi saat terlalu banyak air, maka globulin menjadi
tidak larut
b. Sifat albumin mengendap dalam garam ammonium
sulfat jenuh, dan larut dalam air, sehngga
penambahan banyak air ttp melarutkan.
3. Serum bebas Protein. (kata laborernya serum nya
udah encer, jadi gak usah ditambah air)
a. 5 ml serum + air 10 ml +panaskan +asam asetat 2%

koagulasi mengendap + klor fenol merah +
natrium karbonat sedikit demi sedikit, sampe pH
bergeser.
b. Saring filter untuk percobaan lain
Pembahasan :
- Asam asetat : membuat suasana asam dan
mendenaturasi protein, di pH asam
Dewan Asisten Biokimia 2009
- Klor fenol merah
indikator wanta untuk mencari
pH isoelektris (kuning pH <5, merah pH>6)
- Natrium karbonat
menggeser pH untuk mencari
titik isoelektris protein lain
- Pemanasan denaturasi protein scr fisika
Pemanasan bertujuan untuk mengendapkan
protein(denaturasi) penambahan asam dan basa
membawa prtein ke titik isoelektis nya sehingga
protein yang belum menendap akan mengendap.
Pergeseran ke pH basa digunakan untuk
mengendapkan protein yang bertitik isoelektir di
sekitar pH basa. Sehingga semua protein akan
megendap dan isi dari serum tinggal lah zzat zat yang
digunakan untuk percobaan selanjutnya.
4. Deteksi klorida
a. Serum bebas protein + HNO3 pekat (watch out!)
+AgNO3
kekeruhan putih (positif klorida)
Pembahasan :
- Serum bebas protein
sumber klorida
- HNO3 pekat
merubah Cl organik menjadi Cl
inorganik, mencegah terbentuk Ago2 (endapan
hitam) dan stabilisator Cl inorganik spy gak kencan
sama yang lain.
- AgNO3 donor Ag
AgCl (endapan putih
Keberadan asam nitrat membuat Cl yang berikatan
dengan senyawa organik akan lepas menjadi ion Cl
anorganik, sehingga dapat berikatan dengan Ag+ dan
membentuk endapan putih, seputih Citra lotion baru.
5. Deteksi Phospat
a. Serum bebas protein + HNO3 pekat (watch out!)
+ammnonium molibdat
setelah dipanaskan akan
mennjukan warna kuning jeruk (test neumann)
Pembahasan : Fungsi reagen hampir sama dengan yang
diatas. Intinya adalah ammonium molibdat akan
berikatan dengan phospat menjadi ammonium- phospo
molibdat yang berwarna kuning jeruk.
6. Deteksi Kalsium
a. Serum bebas protein + Kalium oksalat

kekeruhan putih (positif calsium)
Pembahasan : Kalium oksalat
donor oksalat.
Seperti pada batu ginjal, kalsium memiliki affinitas
terhadap oksalat lebih tinggi, sehingga akan berikatan
ketika ditambahkan oksalat dan membentuk endapan
yang terlihat secara kasat mata.
9
7. Deteksi Glukosa
a. Serum bebas protein + Na2CO3 + CuSO4 + gliserol

panaskan
endapan merah (hijau sampe
merah)
Pembahasan :
- Gliserol
mengikat Cu2+ agar tidak menjadi
Cu(OH)2 dengan membentuk Cu-gliserol
- Na2CO3
alkali mengubah gugus karbonil menjadi
enol reaktif dan mereduksi Cu2+ menjadi Cu+
- CuSO4
donor Cu
Prinsipnya sama kayak test benedict biasa.. udah pada
tau kan ya?? Pasti pada tau,,
Nanti kalo muncul warna merah (glukosa banyak), kalo
hijau (kadar glukosa sedang), orange (glukosa rendah)

8. Pigmen darah
a. 1 tetes darah + 10 ml aquadest
panaskan, dan
dinginkan di bawah air mengalir
b. Sudah dingin + H2O2 + reagen tauber
biru Hijau
c. Test Haemin
Cuma liat aja di mikroskop.
Pembahasan :
- Aquadest : melisiskan eritrosit
- H2O2
mengoksidari Fe2+ menjadi Fe3+
- As. Asetat glasial
memecah Hb menjadi Heme
dan globulin
- Benzidine : mengikat ferri sehingga tampak
perubahan warna hijau biru
- Hemin test mengunakan KCl
membentuk
Hematin Klorida, dimana iod dan brom

mengoksidasi Ferro menjadi ferri, dan
menstabilkan hematin klorida
Test benzidine berjalan seperti ini:
Darah
lisis
hemoglobin + as. Asetat glasial

heme + globin
heme(Fe2+) + H2O2
Fe(3+) +
benzidine
membentuk komples warna hijau
kebiruan.

Dewan Asisten Biokimia 2009 10