Modul Praktikum: Konstruksi pohon filogenetik

Task

 Silahkan pilih taxa favorit kalian.

 Kumpulkan sekuens (10-20 sekuens dari minimal 5 species atau OTU) salah satu gen
mtDNA (16s, COI, cytB, atau control region) dari taxa yang kalian pilih.
 Pastikan pilihan taxa dan gen kalian tidak identik dengan teman kalian.
 Analisis data kalian berdasarkan tahapan yang kalian dapatkan selama praktikum.

I. Sequence editing and alignment

Materi yang dibutuhkan:

1. Hasil sequence dengan kualitas yang baik. Hal ini dapat dilihat dari pola kromatogram
dari masing-masing sequence. Format file yang dapat digunakan dalam step ini
adalah .abi atau .txt
2. Software analysis MEGA 7

Prosedur kerja

 Editing
1. Pastikan software MEGA 7 sudah ter-install di masing-masing computer.
2. Buka aplikasi MEGA 7.
3. Klik panel “Align” dan pilih “Edit/build alignment”. Pop-up baru akan muncul dengan tiga
opsi, pilih “Create new alignment”.
4. Lanjutkan memilih “view/edit trace data from DNA sequencers” pada window alignment
explorer da pilih sekuens DNA (.ab1) yang akan dianalisis.
5. Pada tahap ini akan muncul window Trace editor yang menampilkan kromatogram dari
data sekuens yang dipilih. Kromatogram menunjukan kualitas sekuens yang akan
dianalisis. Pastikan hanya menggunakan sekuens dengan kualitas yang baik.
6. Lanjutkan dengan memilih “add unmasked sequence to alignment explorer” maka
sequence akan dikonversi menjadi bentuk deret nukleotida dan ditampilkan pada
window Alignment explorer. Khusus untuk sekuens dari reverse primer perlu diubah
 terlebih dahulu menjadi bentuk komplementarinya (forward) dengan meng-klik “Reverse
complement sequence”.
7. Tergantung pada kondisi sekuens yang kita miliki, proses editing dapat dimulai dengan
menghapus deretan N di awal dan akhir deret sekuens. Tahap ini disebut dengan
“Trimming”.
*Catatan: Pada tahap ini perlu disesuaikan dengan kondisi sekuens dari fasilitas
sekuensing.
8. Tahap selanjutnya adalah tracing N diantara sekuens utama. Apabila terdapat N diantara
sekuens utama maka perlu dilakukan editing dengan cara mengkopi beberapa deret
nukleotida dimana N berada dan mencarinya di window Trace editor melalui menu “Find
the first position of the specified sequence”.
9. Setelah diketahui posisi kromatogram dari N yang diinginkan, N pada alignment editor
dapat dihapus dan diganti dengan nukleotida sesuai dengan warna puncak
kromatogram. Apabila berwarna biru nukleotida pada titik tersebut adalah “C”.
10. Ulangi tahap 5-9 untuk pada seluruh sekuens yang akan dianalisis. Sampai di sini
proses editing telah selesai.

 Alignment
1. “Select all” sekuens yang telah di-edit.
2. Pilih “alignment” maka akan muncul beberapa pilihan metode. Pilih “Align by ClustalW”
atau “Align by Muscle”.
3. Apabila menggunakan ClustalW, akan muncul beberapa parameter. Pada kolom DNA
weight matrix ubah menjadi ClustalW (1.6) dan lanjutkan dengan menekan OK.
4. Apabila menggunakan Muscle ada beberapa parameter yang dapat dimodifikasi. Namun
untuk praktikum kali ini tidak perlu diubah. Lanjutkan menekan compute.
5. Simpan hasil alignment. Untuk analisis selanjutnya hasil alignment perlu diubah
menjadi .meg atau .fas.
6. Pada alignment explorer. Klik Data dan pilih export. Export menjadi bentuk MEGA (.meg)
atau FASTA (.fas).