IV.

Cara Kerja
4.1. Waktu dan Tempat
Praktikum dilaksanakan pada hari Rabu, 15 Maret 2023 pada pukul 10.00
sampai dengan 12.00 WIB. Praktikum dilaksanakan di Laboratorium
Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Sriwijaya, Indralaya.

4.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum berupa laptop, GeneStudio, java,
mesquite, dan mega 11. Bahan yang digunakan berupa data DNA hasil
sekuensing.

4.3. Cara Kerja

Aplikasi Gene Studio dilakukan dengan membuka programnya, lalu pilih
menu “Components” dan “Contig Editor”. Dimasukkan sekuen DNA yang di
contig dengan cara klik “import” pada deretan toolbar. Kemudian pilih file hasil
sekuensing yang akan diedit baik file forward maupun reverse dengan eksistensi
format file AB1. Diblok kedua file kemudian diklik Open. Selanjutnya, klik
“Open” maka program secara otomatis akan assemble guna digabungkan kedua
file menjadi satu bagian. Sebelum file tampil, akan muncul kotak dialog opsi
mengatur tingkat toleransi pemasangan nukleotida (semakin tinggi yang dipilih,
maka program hanya akan mencocokan pasangan nukleotida dengan nilai tinggi),
klik OK. Jika grafik romato gram tidak otomatis keluar, pilih dan klik “Show all”.
Sekuens forward memiliki tanda panah arah kekanan, sedangkan reverse
arah kekiri, jika tanda panah sekuens forward tidak mengarah kekanan atau tidak
sesuai maka lakukan “Reverse Complement” melalui toolbar “Contig” kemudian
klik “Reverse”. Cek kembali arah panah, jika benar lanjut lakukan koreksi pada
basa nukleotida yang masih bermasalah atau eror dengan fungsi “Ambiguity”.
Dipilih toolbar “Contig” lalu “Ambiguity Finder” dan akan terdapat dua opsi
“Before ambiguity” kursor akan berada di Universitas Sriwijaya belakang
nukleotida yang salah. Setelah seluruh nukleotida benar, bias dilakukan export
untuk dikonversi dalam bentuk FASTA, pilih “export consensus” pada toolbar
berinama file dan simpan dengan eksistensi file format FASTA klik Ok atau Save.
Setelah proses assembling sekuen DNA hasil sekuensing selesai langkah
selanjutnya yaitu Homologi Search menggunakan menu Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST) pada NCBI. Untuk sampel DNA pilih “Nucleotide
BLAST”. Dimasukkan file FASTA (.fas) pada note pad dengan cara copy paste,
atau pilih browser pada bagian bawah dan open file dimana tempat kita
menyimpan data sampel hasil pembacaan dengan Gene Studio. Apabila semua
kotak isi antelah sesuai, lalu Run BLAST. Terdapat 100 data (scroll up dan scroll
down). Tahap selanjutnya, dipilih 9 spesies yang berbeda den gancar ater lebih
dahulu klik select all pada pojok kiri atas, lalu centang 9 spesies bakteri yang
diinginkan, setelah itu klik opsi download dan pilih FASTA (Complete
Sequence).
Masuk ke mesquite dahulu disatukan file hasil download BLAST dengan
file hasil assembling DNA pada Gene Studio dengan membuka kedua file lalu
copy sekuens hasil assembling dan tekan pada bagian paling atas pada file
download pada laman NCBI dan setelah disatukan lalu save as file tersebut diberi
nama file “Hasil Homologi Search Sismik 1” dan rubah ekstensi file nya dengan
cara tambah .nt tanpa spasi dibelakang nama file. Kemudian buka Mesquite lalu
klik File dan pilih Open file serta pilih file yang telah dibuat pada langkah
sebelumnya, kemudian klik Open. Dipilih FASTA (DNA/RNA) sesuai dengan
data sampel dan format file yang dimiliki, klik “OK”. Klik Save, semua kotak
dialog yang muncul pilih “OK” tunggu hingga proses selesai.
Apabila matrix tidak otomatis muncul, klik “Show Matrix” pada bagian kiri
bawah. Selanjutnya, pensejajaran sekuens DNA (alignment). Diklik “Matrix”,
kemudian dipilih “Align Multiple Sequences”, Dipilih “Opal” atau “ClustalW
Align” dan “Ok” untuk setiap kotak dialog yang muncul. Hasil yang didapat
kemudian dipotong guna menyamakan panjang dari sekuen yang akan dilakukan
analisis. Diklik nomor sekuen yang tidak rata, kemudian ditekan tombol ”Shift +
panah kiri” untuk memblok urutan basa pada bagian depan yang tidak rata,
kemudian ditekan tombol “Backspace” pada keyboard dan pilih “Yes”, sehingga
didapatkan sekuen DNA yang sejajar. Setelah selesai, hasil yang didapat
kemudian di export. Dengan cara diklik ”File” dipilih “export” dipilih format file
FASTA (DNA/RNA) dan “OK”. Dan akan muncul kotak dialong klik export.
Lalu ubah ekstensi file dari .nt menjadi .fas lalu klik “Save”.
Dibuka program MEGA, klik “File” laludipilih “Open A file/Session”. File
yang didapat dari langkah sebelumnya (file dalam bentuk .fas) lalu diklik “Open”
danakan muncul kotak dialog klik “Align”. Untuk mengetahui variasi basa
nukleotida dan conserved region dapat dilakukan Alignment pada toolbar, lalu
pilih dan klik ClustalW dan klik OK. Diklik OK tunggu sampai proses selesai,
dan muncul tampilan alignment variasi basa nukleotida sehingga dapat terlihat
daerah beda /mutasi serta daerah conserved region (ditandai dengan tanda“ * ”).
V. Hasil dan Deskripsi

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, didapatkan hasil sebagai

berikut :

5.1. Analisis Mutasi

1 2 3
4 5

Keterangan:
1. Mutasi Delesi
2. Transversi
3. Transisi
4. Mutasi Substansi
5. Conserved Region
Deskripsi:

5.2. Jarak Genetik

1 2 3 4 5
1 Sismik 1 0.0050 0.0061 0.0071 0.0093

2 NR 148295.1 Pseudomonas 0.0127 0.0046 0.0051 0.0091

songnenensis strain NEAU-
ST5-5 16S ribosomal RNA
partial sequence
3 NR 169495.1 Pseudomonas 0,0190 0.0105 0.0050 0.0090
nitrititolerans strain GL 14
 16S ribosomal RNA partial
sequence
4 NR 113617.1 Pseudomonas 0.0253 0.0127 0.0127 0.0088
oleovorans strain NBRC
13583 16S ribosomal RNA
partial sequence
5 NR 114167.1 Azotobacter 0.0443 0.0401 0.0380 0.0380
chroococcum strain NBRC
102613 16S ribosomal RNA
partial sequence
Deskripsi:

5.3. Pohon Filogenetik

Deskripsi: