PENENTUAN KADAR PROTEIN

SECARA SPEKTROFOTOMETRI
2 NOVEMBER 2015
 Tujuan Percobaan
• Memahami penggunaan spektrofotometri
sebagai alat untuk menganalisis kadar protein
• Menjelaskan prinsip dasar penggunaan
spektrofotometri dalam analisis kadar protein
• Terampil menggunakan spektrofotometri untuk
menentukan kadar protein
 Dasar Teori
• Penentuan kadar protein secara biuret berdasarkan atas
pengukuran serapan cahaya dengan spektrofotometer oleh
ikatan kompleks yang berwarna ungu. Itu terjadi apabila
protein bereaksi denga tembaga dengan lingkungan alkalis
(Tim DoseN Biokimia 2015)
• Protein adalah senyawa organik yang bermolekul tinggi
berkisar antara beberapa ribu sampai jutaan. Protein
tersusun dari atom, C, H, O, dan N serta unsur-unsur lainnta
seperti P dan S membentuk unit-unit asam amino. (Girindra
1990)
 Dasar Teori
• Adapun prinsip kerja dari spektrofotometer UV ini adalah
menggunakan teori yang dikemukakan oleh Lambert (1760) dan
Beer (1852) yang dikenal dengan Hukum Lambert-Beer dimana
Absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasu, artinya
konsentrasi semakin tinggi maka absrobansinya makin tinggi, begitu
pula sebaliknya (Cahyanto 2008).
• Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi 2
kemungkinan (1) cahaya ditangkap, (2)cahaya discattering. Bila
energi dari cahaya(foton) harus sesuai dengan perbedaan energi
dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang
menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer.
(Cahyanto 2008).
 Alat dan bahan
• Alat • Bahan
1. Spketronik 20 1. Sampel protein : susu cair
2. Kuvet 2. CuSO4.5H2O
3. Pipet tetes 3. Natrium kalium tatrat
4. Aquades
4. Pipet volume
5. NaOH 10%
5. Tabung reaksi kecil
6. Serum albumin murni
6. Beker glass
7. Kasein
7. Labu takar 8. NaOH
8. Erlenmeyer
 Cara kerja
• Pembuatan Kurva 2. Pada setiap tabung reaksi
kalibrasi ditambahkan 4mL biuret
1. Menyiapkan 5 tabung reaksi yang +4mL
akan diisi larutan standar protein Biuret
dengan 5 konsentrasi yang berbeda
dengan volume 1mL.
Biuret 1
mg/
diambil mL 2
mg/
mL
3
1
mg/
mL
4
mg/
2
mg/
mL
5
mL mg/
mg/
mL
3 mL
mg/
mL
4
mg/
mL
5
mg/
mL
 Cara kerja
3. Digojog dan didiamkan 30 menit 5. Menggunakan larutan blanko(yang
sudah didiamkan 30 menit)

+4mL
1 Biuret
mg/
mL 2
mg/
mL
3
mg/
mL
4
mg/
mL
4. Mengukur absorbsinya
mg/
menggunakan spektronik 20, panjang mL
gelombang 540nm 6. Membuat kurva kalibrasi
 Cara kerja
2. Digojog dan 4. Menggunakan larutan
• Pengukuran sampel didiamkan 30 menit
blanko(yang sudah
didiamkan 30 menit)
protein
1. 1mL Susu cair dimasukkan ke +4mL
dalam tabung reaksi. Biuret

+4mL
Biuret 3. Mengukur absorbsi-
nya menggunakan
spektronik 20, panjang mg/
Biuret gelombang 540nm mL

diambil 5. Membuat kurva

kalibrasi
1
mL
Susu
cair
 DATA PENGAMATAN
2. Pengukuran sampel protein
Larutan M Volume Gambar Volume Absorba
Standar (mg/mL) (mL) biuret nsi (A)
(mL)
Larutan - 1 4 0
Blanko
Tabung 1 1 4 0.02
1
Tabung 2 1 4 0.02
2
Tabung 3 1 4 0.02
3
Tabung 4 1 4 0.04
4
Tabung 5 1 4 0.08
5
 DATA PENGAMATAN
2. Pengukuran sampel protein
Larutan M Volume Gambar Volume Absorba
Standar (mg/mL) (mL) biuret nsi (A)
(mL)
Larutan - 1 4 0
Blanko
Sampel - 1 4 1.85
protein:
susu cair
 Analisis Data
• Pengenceran Larutan Standar
Protein
Tabung 1(1ppm)=M1.V1=M2.V2
10.V1=1.50 Tabung 4(4ppm)=M1.V1=M2.V2
V1=50/10=5ml 10.V1=4.50
Tabung 2(2ppm)=M1.V1=M2.V2 V1=200/10=20ml
10.V1=2.50
V1=100/10=10ml Tabung 5(5ppm)=M1.V1=M2.V2
Tabung 3(3ppm)=M1.V1=M2.V2 10.V1=5.50
10.V1=3.50 V1=250/10=25ml
V1=150/10=15ml
Kurva Kalibrasi Kadar Protein
0.09

0.08

0.07 y = 0.018x - 0.004

R² = 0.8804
0.06

0.05
Series1
0.04
Linear (Series1)
0.03

0.02

0.01

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
-0.01
 Analisis Data
y=0.018x-0.004 Data 3
0.02
=0.018x-0.004
=0.018x-0.004
Sampel Protein: Susu Cair

R2=0.8804 x =0.02+0.004 Y =0.018x-0.004

0.018
x = 1.3 mg/mL 1.85 =0.018x-0.004
Data 1 =0.018x-0.004 X =1.85+0.004
0.02 =0.018x-0.004 Data 4 =0.018x-0.004
0.018
x =0.02+0.004 0.04 =0.018x-0.004
x = 103mg/mL
0.018 x =0.04+0.004
x = 1.3 mg/Ml 0.018
x = 2.4 mg/mL
Data 2 =0.018x-0.004
0.02 =0.018x-0.004 Data 5 =0.018x-0.004
x =0.02+0.004 0.08 =0.018x-0.004
0.018 x =0.08+0.004
x = 1.3 mg/mL 0.018
x = 4.67 mg/mL
 Pembahasan
Pada masing-masing larutan sampel ditambahkan 4ml reagen biuret kemudian dikocok dan
didiamkan 30 menit. Didapatkan larutan berubah menjadi ungu. Ini terjadi apabila protein
bereaksi dengan tembaga dalam suasana basa/alkali.

• Persamaan reaksi yang

terjadi:
H H

[ ] +Cu2+
OH

H
+Cu2+

KOMPLEKS UNGU
 Pembahasan
• Larutan NaOH merupakan basa kuat
memiliki ion H- yang tinggi dalam larutan
sehingga mampu mengikat ion H+ pada
larutan protein sampel.
• Ion H+ yang lebih reaktif mampu diikat
dan tidak akan bereaksi dengan gugus
amino, sehingga Cu2+ dapat bereaksi
dengan 4 gugus amino dari ikatan peptida
protein.
• Gugus Cu2+ akan berikatan dengan 4
gugus amino membentuk kompleks
berwarna ungu.
• Semakin tinggi konsentrasi larutan protein
sampel, semakin banyak ikatan peptida
dalam larutan maka pembentukan
kompleks semakin banyak, ini dapat
dilihat dari warna ungu yang semakin
pekat.
• Pendiaman 30 menit, bertujuan agar
endapan dan filtrat campura dapat
terpisahkan dan tidak mengganggu proses
identifikasi menggunakan spektronik 20.
• Pada proses ini telah terjadi absorbsi
radiasi sinar panjang gelombang yang
lebih panjang karena transfer elektron
memerlukan energi radiasi yang lebih
kecil.
• Digunakan panjang gelombang 540nm
yang gelombang elektromagnetiknya
dapat melalui wadah sampel.
• Didapatkan hasil, nilai absrobsinya antara
0.02-0.08 yang setelah dibuat kurva
kalibrasinya didapatkan nilai y=0.018x-
0.004 dengan nilai kadar protein susu cair
yaitu 103mg/mL
 Pembahasan
• Ada beberapa tabung yang memiliki
hasil absorbsi yang sama dengan
konsentrasi yang berbeda. Hal ini
dapat terjadi karena larutan
didiamkan lebih dari 30menit
sehingga kestabilan warnanya tidak
cukup lama dan memudar.
• Ketidakstabilan dapat disebabkan
oleh oksidasi oleh udara, suhu, dsb
• Warna larutan tidak memiliki
intensitas yang tinggi sehingga nilai
absorbtivitas molarnya menurun.
 Simpulan Saran
• Didapatkan campuran kompleks berwarna ungu
dari pereaksian ion Cu2+ dalam larutan protein • Praktikan dituntut untuk lebih
dalam lingkungan basa/alkalis
• Semakin tinggi konsentrasi larutan protein sampel,
teliti dalam melakukan
semakin banyak ikatan peptida dalam larutan maka
pembentukan kompleks semakin banyak
pengenceran larutan standar
• Semakin tinggi konsentrasi larutan akan semakin protein karena dapat
banyak molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UV
sehingga sinar yang diteruskan akan semakin mempengaruhi hasil
sedikit.
• Perbedaan hasil pengukuran absorbsi dapat • Sebaiknya pengukuran absorbsi
disebabkan ketidakstabilan warna, warna larutan
tidak cukup tua, oksidasi udara, suhu, dan dilakukan saat pendiaman tidak
sebagainya.
• Kadar protein yang terdapat dalam sampel susu cair lebih dari 30 menit
yaitu 103mg/ml