JOURNAL READING

Topical Application of a Vitamin D3 Analogue and

Corticosteroid to Psoriasis Plaques Decreases Skin
Infiltration of TH17 Cells and Their Ex vivo Expansion
Co-Assistants

Annisa 1918012099
Fahmi Ikhtiar 1918012116
Mira Yustika S 1918012108
Tiara Cornela A 1918012092
Ratu Nirmala W 1918012100

Perceptor
dr. Hendra Tarigan S.,M.Kes., Sp. KK., FINSDV

Kepaniteraan Klinik Ilmu Kesehatan Kulit Dan Kelamin

Fakultas Kedokteran Universitas Lampung
Rsud Dr. H. Abdul Moeloek Provinsi Lampung
2020
Pendahuluan

Psoriasis adalah salah satu penyakit kulit keratotik inflamasi yang paling
umum. Sel TH17 dan sitokinnya, IL-17A dan IL-22, memiliki peran
penting dalam terjadinya akantosis dan peradangan pada psoriasis.
Selain itu, IL-23 dan sel dendritic juga dianggap memiliki peran dalam
perkembangan psoriasis

Terapi topikal konvensional menjadi pilihan standar pengobatan

dikarenakan kenyamanan, keamanan, dan efisiensi ekonominya. Obat
topikal yang paling sering digunakan termasuk kortikosteroid dan analog
vitamin D3
Pendahuluan

Kortikosteroid adalah antiinflamasi yang poten dengan efek

imunosupresif luas terhadap beberapa jenis sel, seperti sel T,
dikarenakan kortikosteroid dapat memblok jalur-jalur inflamasi dan
menginduksi apoptosis.

Sementara itu, analog vitamin D3 memiliki profil imunomodulator yang

ditandai dengan kemampuan untuk menginduksi keadaan tolerogenik
pada sel dendritik dan sel T, meningkatkan kemampuan imunosupresif
dari sel T regulator dan mendorong sel T menuju TH2 sambil
menghambat sel TH1 /TH17.
Pendahuluan

Kortikosteroid dan analog vitamin D3 diasumsikan secara sinergis dapat

memperbaiki keadaan psoriasis ketika kombinasi mereka diaplikasikan
pada lesi plak. Namun, investigasi terperinci mengenai efeknya terhadap
kulit yang diinfiltrasi sel T, terutama Sel TH17 patogen, belum dilakukan

Penelitian ini berusaha untuk mengeksplorasi efek kalsipotriol topikal

(Cal), betametason dipropionat (Taruhan), dan kombinasinya terhadap
kulit yang terinfiltrasi sel T. Studi ex vivo ini mengklarifikasi perbedaan di
antara keduanya dalam efek penghambatan pada populasi sel-T.
 Metode Penelitian
Kriteria pasien dan pengaplikasian topikal dari Calcipotriol dan Betametasone dipropionate

▪ 10 pasien dengan psoriasis vulgaris dengan diagnosis dibuat berdasarkan temuan klinis dan histologis dan semua pasien belum pernah

menerima pengobatan sistemik atau fototerapi untuk psoriasis.

▪ Pemilihan lesi adalah 4 plak psoriasis berbeda dan belum diobati secara topikal dengan obat apa pun selama lebih dari 2 minggu

▪ Salep yang diberikan adalah calcipotriol ointment (Cal; Dovonex, LEO pharma, Ballerup, Denmark), betamethasone dipropionate

ointment (Bet; Rinderon DP, Shionogi, Japan), atau calcipotriol and betamethasone dipropionate 2-compound formulation (CB;

Dovobet, LEO pharma)

▪ Pemberian salep yang digunakan pada penelitian diaplikasikan sekali sehari ke 3 tempat berbeda selama 14 hari, sesuai dengan

metode fingertip.

▪ Satu lesi yang tidak diaplikasikan digunakan sebagai kontrol.

▪ Setelah 2 minggu pengobatan topikal, dilakukan pengambilan spesimen biopsi kulit dari 4 tempat untuk studi histologis dan

imunologi.
 Metode Penelitian
Persiapan Sel
▪ Spesimen biopsi kulit 4 mm dipotong menjadi 2 bagian, dengan 1 spesimen digunakan untuk ekspansi sel T yang

menginfiltrasi kulit (expanded skin-infiltrating T cells) dan satu spesimen digunakan untuk pemeriksaan histologis.

▪ Metode yang digunakan untuk menilai expanded skin-infiltrating T cells cdengan menggunakan microbeads anti-CD3 /

CD28 yang dilapisi antibodi dan IL-2.

▪ Sampel direndam dalam cRPMI yang dilengkapi dengan 50 U / mL rekombinan manusia IL-2 (R&D Systems,

Minneapolis, Minn) dan microbeads anti-konjugasi antibodi / CD28 antibodi (Human T-Activator; Dynal, Copenhagen,

Denmark)

▪ Sel dikultur selama 2 minggu, dan media kultur diubah atau ditambahkan setiap hari untuk memastikan setengah dari

total volume media segar.

▪ Semua sel dikumpulkan dan dihitung untuk uji produksi sitokin dan uji pewarnaan sitokin intracytoplasmic. Sisa sel

disimpan di suhu 80 derajat C untuk dilakukan tes produksi apoptosis dan sitokin yang distimulasi obat.
 Metode Penelitian
Analisis aliran sitometrik dan penilaian produksi sitokin

• Sel yang akan dianalisis (Aliquots of 106) dicuci dengan PBS (pH 7,4) dengan panel mAb terkonjugasi-

fluoresensi selama 15 menit pada suhu kamar dalam gelap.

• Setelah dicuci, sel dipanen dan disuspensikan kembali dalam PBS untuk selanjutnya dilakukan analisis

sitometrik. Lebih dari 5x104 sel per sampel dianalisis pada FACSCanto II (BD Biosciences, San Jose,

Calif). Hasil dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo (TreeStar, Ashland, Ore).

• Untuk uji pewarnaan sitokin intraseluler, 106 sel / well dalam 24-well plate diinkubasi dalam cRPMI yang

mengandung 108 mol/L phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA :Sigma Aldrich, St Loius Mo), 10 6 mol / L

kalsium ionofor (Sigma-Aldrich), dan 1 m L / mL GolgiStop (BD) selama 6 jam pada 37 derajat C.

• Sel-sel dipanen dan diwarnai dengan mAb yang ditandai dengan fluoresensi terhadap sitokin dengan

menggunakan Kit Cyto fi x / CytopermPlus dengan GolgiStop (BD), menurut protokol pabrikan, setelah

pewarnaan antibodi yang diberi tag fluoresensi terhadap CD3 dan CD8.

8
 Metode Penelitian
Studi histopatologis dan imunohistokimia

▪ Setengah dari spesimen biopsi dari lesi difiksasi dalam formalin 4% dan secara rutin diwarnai dengan hematoxylin-eosin

untuk histopatologi standar.

▪ Spesimen yang mengalami deparafasi akan diautoklaf dalam buffer sitrat 10 mmol / L (pH 6.0) selama 10 menit pada 120

derajat Celcius untuk diambil epitop antigenik dan kemudian akan dianalisis ekspresi CD3 dengan menggunakan metode

kompleks avidin-biotin, dan analisis ekspresi IL-17A dengan menggunakan pewarnaan immuno-fluorescent.

▪ Pewarnaan nuklir dilakukan dengan hematoxylin atau 4’- 6 diamidino-2-phenylindole dihydrochloride.

▪ Bagian yang akan dianalisis terlebih dahulu dipindai dengan pemindai gambar digital (NanoZoomer; Hamamatsu Photonics,

Hamamatsu, Jepang) dan dianalisis dengan menggunakan perangkat lunaknya.

▪ Ketebalan epidermis atau ketebalan stratum korneum dihitung dengan mengukur luas dan panjang garis permukaan

epidermis dari seluruh gambar jaringan.

 Metode Penelitian
Uji produksi sitokin Analisis statistik
Sel (2x105 sel / sumur) distimulasi dengan pelat anti- Pada penelitian ini diterapkan tes Friedman, dan jika

CD3 mAb yang dilapis anti-CD3 amobil (BD terdapat perbedaan yang signifikan maka dilakukan

BioCoat; BD) selama 48 jam dengan ada atau tidak uji post hoc (tes Dunn-Bonferroni). Penilaian

adanya obat, dan supernatan kultur dipanen untuk statistik dilakukan dengan perangkat lunak SPSS

mengukur kadar sitokin (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL- (versi 21; IBM, Armonk, NY). Dengan p value <0.05

17, IFN- g, dan TNF-Alfa) dengan TH 1 / T H 2 / T dianggap signifikan secara statistik

H 17 Kit Cytokine Beads Array (BD), sesuai dengan

protokol yang ada.

HASIL
Kombinasi Cal dan Bet secara sinergis
meningkatkan perbaikan lesi psoriatik

Terdapat 4 plak psoriasis dengan tingkat keparahan

yang sama

Masing-masing plak diberikan Cal, Bet, CB, dan control

selama 2 minggu

Pemberian obat topical memperbaiki plak dan CB

menjadi yang terbaik
• Perbaikan klinis dinilai dengan skor SUM, yang mencakup
tingkat keparahan (pada skala 0 hingga 4 poin) eritema,
indurasi, dan penskalaan

• Perawatan CB dan Cal signifikan meningkatkan skor SUM,

sedangkan tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik
antara Cal dan Bet

• Keefektifan pengobatan tunggal Cal dan Bet bervariasi pada

setiap pasien
▪ Kombinasi Cal dan Bet secara sinergis meningkatkan perubahan histologis lesi
psoriatik

Spesimen biopsi kulit yang Dalam semua kasus, CB dan Bet,dan Cal kecuali
diperoleh dari masing-masing kasus 3, mengurangi ketebalan epidermis.
lesi dari kelompok yang
menerima perawatan dan
kelompok yang tidak menerima
perawatan dijadikan subjek Status keratinisasi dinilai berdasarkan ketebalan
stratum korneum dan persentase panjang
untuk pengamatan secara parakeratosis
histopatologis
Kombinasi kalsipotriol dan kortikosteroid
mengurangi infiltrasi sel IL-17A1 pada lesi
psoriatik

• dilakukan pewarnaan immunohistokimia dan

immunofluorescent dari CD3 dan IL-17A, masing-
masing, dan seluruh bagian sediaan digambarkan
sebagai bentuk digital untuk dianalisis jumlah sel
infiltrasinya

• Aplikasi topikal dari Cal, Bet, dan CB secara

signifikan menurunkan infiltrasi sel-T bersamaan
dengan pengurangan ketebalan epidermis
Jumlah sel T yang diperluas pada kulit yang menerima terapi Bet dan CB
dibandingkan pada kulit kelompok kontrol

Karena hasil dari pewarnaan imunofluoresen tidak terlalu meyakinkan ,Analisis untuk
melihat sel T yang meninfiltrasi kulit diperluas dengan menggunakan microbead anti-
CD3 / CD28 yang dilapisi antibodi dan IL-2 selama 2 minggu

Jumlah sel T yang diperluas berkurang dengan aplikasi topikal Bet dan CB
untuk lesi psoriatic, selain itu, CB menunjukkan hasil rata-rata yang paling
rendah pada 10 pasien.
Hasil pada pemberian Cal dan CB lebih baik dalam mengurangi frekuensi
sel TH17 dalam sel yang diperluas
Jumlah dan frekuensi sel TH17
(sel CD3+CD8-IL-17+) berkurang
dengan pengobatan CB dan Cal,
hal ini menunjukkan bahwa Cal
dapat menekan ekspresi sel-sel
TH17 dengan baik. Jumlah sel
TH1, TH2, dan TH22 cenderung
menurun oleh semua perlakuan
yang diberikan, meskipun hasil
yang didapatkan tidak signifikan
secara statistik
Sitokin yang diproduksi oleh sel T
yang diperluas juga diukur.
Produksi IL-17A oleh sel-sel T
dari kulit yang dirawat dengan
Cal jauh lebih rendah daripada
yang dari kulit control, hal ini
mendukung penurunan frekuensi
sel-sel TH17 setelah perawatan
Cal.
Cal menurunkan regulasi produksi sitokin TH1 / TH17, sedangkan Bet
menurunkan regulasi sitokin TH1 / TH2 / TH17

Bet menghambat produksi sitokin TH1, TH2, dan TH17, namun dari hasil yang
didapatkan bahwa Cal cenderung meningkatkan produksi IL-4 dan secara
signifikan menurunkan regulasi IL-17A

Hasil ini menunjukkan bahwa terdapat efek bias pada pemberian Cal karena
efeknya yang dapat menghambat sel TH17 namun cenderung meningkatkan
regulasi sel TH2.
Bet, namun bukan Cal, dapat menginduksi apoptosis

Untuk mengklarifikasi perbedaan antara Cal dan Bet dalam hal

penghambatan pada sel T, peneliti menyelidiki efek apoptosis
langsung dari Cal dan Bet pada sel T yang menginfiltrasi kulit

Sel T pada kelompok control dikultur dan diberikan Bet, Cal, atau
keduanya selama 96 jam. Kemudian jumlah sel hidup dan mati
dihitung

Frekuensi sel hidup berkurang secara signifikan dengan

penambahan Bet atau Bet plus Cal, sedangkan Cal tidak
mempengaruhi viabilitas sel
Cal menurunkan regulasi ekspresi IL23A dan CCL20 pada kulit lesional dan
reseptor asam retinoat yang berhubungan dengan Orphan-receptor dan
ekspresi α dalam sel T lesional yang diperluas

Untuk mengatasi mekanisme

Ditemukan ekspresi CCL20
yang mendasari penghambatan
(kemoattracting sel TH17) dan
TH17, peneliti melakukan
IL23A (yang dapat
pemeriksaan dengan PCR
mempertahankan sel TH17)
kuantitatif dari sampel kulit yang
mengalami penurunan regulasi
diambil dari 3 pasien (kasus 6, 8,
oleh pengaplikasian Cal
dan 10) yang memiliki respon
bersamaan dengan pengurangan
terhadap pemberian Cal dengan
ekspresi dari IL17A.
baik
Cal menurunkan regulasi ekspresi IL23A dan CCL20 pada kulit lesional dan
reseptor asam retinoat yang berhubungan dengan Orphan-receptor dan
ekspresi α dalam sel T lesional yang diperluas

Selanjutnya, sel T yang diperluas

dari kulit kelompok psoriatik yang
tidak diobati dalam kasus 1
hingga 5 distimulasi dengan anti-
CD3 mAb dan diinkubasi dengan
Cal. RORC dan RORα dinilai
menggunakan real time PCR
Ekspresi mRNA dari RORC
menurun akibat pemberian Cal
terjadi dalam semua kasus, dan
ROR α menurun pada 3 dari 5
kasus
Diskusi

▪ Terapi kombinasi steroid topical lebih efektif. Meskipun perluasan

meningkatkan TH1 dan TH2, frekuensi TH17 itu terpengaruh minimal, dan
sel T yang diperluas mencerminkan populasi sel T yang asli. Hal ini
menunjukkan bahwa jumlah sel T skin infiltrating menurun oleh kedua
perawatan dengan analog kortikosteroid tunggal dan vitamin D3. Kombinasi
ini lebih kuat menurunkan infiltrasi sel T daripada agen tunggal, terutama
TH17 sel. Calcipotriol menghambat TH17 sel dan termodulasi TH2 sel tanpa
induksi apoptosis, sedangkan Bettametasone secara seragam menurunkan
semua sitokin, setidaknya sebagian dengan menggunakan apoptosis.

27
Diskusi

▪ Aplikasi topikal dari analog vitamin D3 mengurangi jumlah sel T dan

frekuensi sel T CD8 IL-17A yang meremajakan kulit dan sel CD45 IL
17A tetapi bukan sel CD4 IL-17A. Hasil menunjukkan bahwa tidak
hanya sel CD8 IL-17A tetapi juga sel CD4 IL-17A, yaitu sel TH17,
mengalami penurunan frekuensi. Uji produksi sitokin selanjutnya
mendukung penurunan jumlah sel T yang memproduksi IL-17A pada
kulit yang diobati dengan Calcipotriol atau CB.
▪ Studi lain juga menunjukkan bahwa vitamin D3 mengurangi frekuensi
atau fungsi sel TH17 pada tikus dan manusia.
28
Diskusi

▪ Meskipun mekanisme detail mendasari preferensi tersebut penghambatan

sel TH17 oleh vitamin D3 tidak sepenuhnya dipahami, baik mekanisme
langsung dan tidak langsung dapat diajukan.
▪ Mekanisme langsungnya adalah sel T mengekspresikan reseptor vitamin
D3 dan memberi sinyal melalui blok reseptor yang mengikat faktor
transkripsi faktor nuklir sel T yang diaktifkan ke promotor gen IL-17.
▪ Selain faktor nuklir sel T teraktivasi, ROR alfa dan ROR gama juga
penting untuk diferensiasi dan pembentukan TH17

29
Diskusi

▪ Di sisi lain, ada mekanisme potensial penghambatan tidak langsung sel TH17
oleh vitamin D3. Salah satu target utama vitamin D3 pada pasien dengan
psoriasis dianggap keratinosit. Keratinosit menghasilkan CCL20, ligan untuk
CCR6 dan kemoatraktan pada sel TH17, sehingga menginduksi CCR6 TH17
terkait peradangan pada kulit. Selain itu, ekspresi CCL20 diregulasi oleh
TH17 cytokines untuk membentuk loop umpan balik positif. Ekspresi mRNA
CCL20 juga sangat downregulated oleh perawatan Calcipotriol dan CB, dan
ini bisa menjadi salah satu mekanisme utama penekanan infiltrasi sel TH17.

30
Diskusi

▪ Selain mekanisme yang bergantung pada CCL20, IL23A ekspresi

gen juga diturunkan. IL-23 diproduksi oleh makrofag dan sel
dendrit dan meningkatkan proliferasi sel TH17, dan Calcipotriol
dan CB telah terbukti memiliki efek penghambatan sekresi IL-23
oleh sel dendrit. Dengan demikian regulasi jalur ini juga dapat
terlibat dalam penurunan jumlah sel TH17 dalam studi ekspansi
sel-T.

31
Diskusi

▪ Keratinosit juga mengekspresikan peptida atau alarmin antimikroba, seperti psoriasin,

koebnerisin, dan cathelicidin LL37, yang ekspresinya diregulasi oleh IL-17A. Alarmin
ini dapat memicu keratinosit epidermal untuk memproduksi sitokin imunotropik yang
semakin memperkuat respons inflamasi. Karena Calcipotriol menekan ekspresi peptida
antimikroba, ini mungkin menyediakan mekanisme tidak langsung alternatif.
▪ Dalam kultur sel T in vitro yang berasal dari lesi kulit pasien yang tidak diobati,
Calcipotriol meningkatkan produksi IL-4 dalam semua kasus. Dengan demikian
Calcipotriol dapat secara langsung dan tidak langsung menyebabkan polarisasi TH2.
Lingkungan sitokin tipe 2 dapat mengurangi peradangan yang lebih besar TH1,
menghasilkan pengurangan psoriasis.

32
Diskusi

▪ Berbeda dengan Calcipotriol, Betametasone mengerahkan efek supresif

nonskewing pada sel T karena pengobatan topikal Bettametasone menekan
ekspansi sel in17 secara ex vivo, serta populasi sel T lainnya. Secara umum,
kortikosteroid memiliki efek penghambatan yang kuat pada fungsi sel-T. Data
histologis dan ex vivo kami juga menunjukkan bahwa Bettametasone mengurangi
infiltrasi sel T pada lesi kulit psoriatik, dan data in vitro menunjukkan bahwa
Bettametasone menginduksi apoptosis sel T infiltrasi kulit psoriatik dan
menghambat produksi sitokin sel T secara seragam, termasuk IL-17A.

33
Diskusi

▪ Namun, penyelidikan baru ini menunjukkan bahwa ada sel TH17 yang resistan
terhadap glukokortikoid yang disebut sel TH17 proinflamasi dan bahwa vitamin
D3 menghambat produksi IL-17A dengan cara yang tidak tergantung
glukokortikoid pada pasien dengan asma berat. Sel-sel TH17 proinflamasi pada
subyek manusia adalah CCR6 CXCR3 CCR4 tinggi CCR10 rendah CD1611 dan
menghasilkan IL-17 dan IFN-g. mengingat adanya sel-sel TH17 proinflamasi
dalam lesi psoriatik, subset tertentu dari sel-sel TH17 dapat bertahan hidup bahkan
setelah pengobatan Bettametasone.

34
Diskusi

▪ Penerapan lebih lanjut dari Calcipotriol dapat memberantas populasi TH17. Sel-sel TH17
proinflamasi seperti itu, diidentifikasi sebagai sel IL-17A1IFN-g1, diamati dalam sel-sel
yang diperluas, dan frekuensinya lebih tinggi pada sel T dari kulit yang dirawat dengan
Bettametasone dibandingkan pada sel T dari kulit yang dirawat dengan Calcipotriol (Bet vs
Cal adalah 5,89% 6 4,59% vs 2,9% 6 1,59% [rata-rata 6 SD]; P=,013, uji peringkat bertanda
Wilcoxon), menunjukkan bahwa sel TH17 proinflamasi resisten terhadap Bettametasone
tetapi rentan terhadap Calcipotriol
▪ Singkatnya, Calcipotriol dan Bettametasone menormalkan perubahan psoriatik melalui cara
yang berbeda, dengan penurunan ekspansi sel TH17 di kulit lesi. Sangat mungkin bahwa
tindakan yang berbeda dari 2 obat pada sel T dan bahkan subpopulasi sel TH17
menghasilkan efek antipsoriatik yang unggul dalam kaitannya dengan efektivitas terapi.

35
P-I-C-O Analysis

Patient Comparison
10 Pasien yang didiagnosis Psoriasis plak dan belum Membandingkan efek dari obat topikal kalsipotriol
mendapatkan pengobatan sistemik ataupun fototerapi. (Cal), betametason dipropionat (Bet), atau kalsipotriol
Dilakukan pemilihan 4 lesi plak psoriasis yang berbeda dan betamethasone dipropionate 2-compound
namun memiliki tingkat keparahan yang sama. formulation (CB)

Intervention Outcome

3 lesi plak psoriatik diberikan kalsipotriol (Cal),
betametason dipropionat (Bet), atau kalsipotriol dan
betamethasone dipropionate 2-compound formulation
(CB) 1x sehari selama 14 hari. Dan 1 lesi plak psoriasis
dijadikan sebagain kontrol.
Perbaikan klinis yang dinilai dari ketebalan epidermis
dan stratum korneum serta panjang parakeratosis.
Perbaikan secara histopatologis dengan menilai infiltrasi
TH17 pada lesi kulit dan produksi sitokin-sitokin seperti :
TH1, TH2, TH17, IL-4, IL-17A.

36
Critical Appraisal
Was the assignment of patients to treatments randomised? NO
Were the groups similar at the start of the trial? YES
Aside from the allocated treatment, were the group treated equally? YES

Seluruh grup diperlakukan sama

yakni dilakukan biopsy pada hari
ke-14 setelah intervensi untuk
dilakukan studi secara
histologis&imunologis, dan tidak
mendapatkan terapi tambahan
Were all patients who entered the trial accounted for? Were they analysed in
the groups to which they were randomised ? YES

Dalam jurnal ini disebutkan ke-10 pasien mengikuti penelitian dari awal hingga akhir
dilakukannya analisis secara histologi&immunologi namun pasien tidak dilakukan
randomisasi
Were measures objective or were the patients and clinicians kept “blind” to
which treatment was being received? NO

Peneliti mengetahui jenis intervensi yang diberikan kepada pasien

So, are the result of the trial valid? YES
Importancy

▪ Penelitian ini penting untuk mengetahui efek dari obat topikal

kalsipotriol (Cal), betametason dipropionat (Bet), atau kalsipotriol
dan betamethasone dipropionate 2-compound formulation (CB)
dalam pengobatan psoriasis plak

44
Applicability

▪ Jurnal ini dapat diterapkan karena obat yang digunakan tersedia

di Indonesia dan pemakaiannya mudah bagi pasien yakni 1x
sehari selama 14 hari.

45
THANK YOU

46