Interferon α dari E.

coli
Nella Novita
Produk obat Interferon α-2b
• Intron-A®
• Roferon-A®
• Actimmume®

Digunakan untuk terapi pada pasien:

• Sarkoma Kaposi,
• Hepatitis B,
• Hepatitis C
• Kanker Ginjal
Apa itu Interferon α-2b
• Interferon (IFN) merupakan sitokin yang diproduksi
oleh berbagai tipe sel sebagai respon rangsangan
terhadap stimulasi virus, bakteri, parasit, sel tumor,
atau antigen lain.
• Interferon alfa-2b memiliki efek yang mirip dengan
interferon alami tubuh. Obat ini akan mempengaruhi
respon tubuh, termasuk menghambat pertumbuhan
dan perkembangan virus, menghambat proliferasi sel
tumor/kanker, dan meningkatkan aktivitas sistem
kekebalan tubuh
Dosis
• Sarkoma Kaposi terkait AIDS
Dosisnya 30 juta unit/m2 luas tubuh, dengan suntikan melalui
otot (intramuskular/IM) atau ke bawah kulit (subkutan/SC), 3
kali seminggu.
• Hepatitis C kronis
Dosisnya 3 juta unit, dengan suntikan melalui otot
(intramuskular/IM) atau ke bawah kulit (subkutan/SC), 3 kali
seminggu. Durasi pengobatan 6–12 bulan jika digunakan
bersama ribavirin. Durasi pengobatan 6–18 bulan sebagai
monoterapi.
• Hepatitis B kronis aktif
Dosisnya 5–10 juta unit, dengan suntikan melalui otot
(intramuskular/IM) atau ke bawah kulit (subkutan/SC), 3 kali
seminggu, selama 4–6 bulan atau 5 juta unit per hari selama 16
minggu.
• Interferon alfa-2b akan disuntikkan secara langsung ke lesi
kulit atau melalui otot (intramuskular/IM), atau bawah
kulit (subkutan/SC). Interferon alfa-2b juga bisa diberikan
melalui suntikan intravena (IV) secara perlahan selama 20
menit. Rute pemberian obat akan disesuaikan dengan
kondisi yang ingin ditangani.

• Selama menjalani pengobatan dengan interferon alfa-2b,

Anda akan diminta untuk menjalani pemeriksaan
kesehatan secara rutin, termasuk pemeriksaan darah, tes
fungsi hati, atau pemeriksaan jantung.
Kombinasi Glikosilasi dengan basis E.coli dengan
transglikosilasi secara infitro untuk menghasilkan
interferon alfa glikosilat
Glikosilasi merupakan modifikasi pasca translasi yang terjadi
di dalam sistem ekspresi sel eukariotik dengan penambahan
gugus gula (glikosil) pada untaian polipeptida. Modifikasi ini
memiliki peran penting karena sebagian besar protein pada
organisme eukariotik mengalami glikosilasi
Glikosilasi dengan basis E. coli akan memberikan alternatif
yang lebih cepat, lebih ekonomis, dan lebih sederhana
dalam proses pembentukan interferon alfa glikosilat
Disini, gikosilasi terjadi karena adanya penambahan
Campylobacter jejuni untuk menghasilkan protein eukariotik
N-glikosilasi
IFNα adalah protein-heliks yang terdiri dari 165 asam amino
dengan satu ikatan O-glikosilasi
Proses
Dibuat dengan kondisi optimum
1. Pembuatan Plasmid Rekombinan
Gen E. coli (DH5α) metionin aminopeptidase
di amplifikasi PCR (2mM MgCl2, 1.5 mM
dNTPs, Taq buffer solution, 20pM setiap
primer, 2.5 unit Taq polymerase)

2. Aktifitas enzim dengan susbtrat yang berbeda

3. Ditambahkan karbenisilin 100 g/ml

dan kanamisin 50 g/ml.
Gambar 1. foto SDS-PAGE yang menunjukkan ekspresi
dan E. coli metionin aminopeptidase yang dimurnikan
Gambar 2. Molecular weight determination by
MALDI-TOF analysis of purified recombinant
methionine aminopeptidase
1.
• Ekspresi maksimum enzim rekombinan dalam larutan dan bentuk
fungsional diperoleh ketika inang sel bakteri diinduksi semalaman
dalam 0,4 mM IPTG pada 20 °C dan 100 rpm. Enzim dimurnikan
dengan pertukaran anion dalam kromatografi;
• Fraksi enzim utama dielusi dari Kolom Q-Sepharose antara 0,15 dan
0,25 M NaCl adalah dianalisis pada SDS-PAGE (Gambar 1). Berat
molekul ditentukan oleh MALDI-TOF adalah 29200,941 Da (Gambar
2).
• Enzim yang dimurnikan memiliki pH optimum 7,5 dan maksimum
aktivitas diukur pada 37 ° C dengan adanya 2 mM ion kobalt.
2
• Klon dikonfirmasi untuk keberadaan plasmid rekombinan digunakan
untuk menumbuhkan kultur dalam skala kecil; gen ekspresi diinduksi
oleh 0,4 mM IPTG ketika OD kultur adalah 0,6 pada 600 nm. Kultur
diinkubasi semalam pada 20 ° C dan ekspresi dianalisis pada 15% SDS-
PAGE
Aktifitas enzim dengan substrat berbeda
• Aktivitas spesifik enzim dengan metionil-p-nitroanilide adalah 1,64
mol/min/mg. Pada waktu 0, profil HPLC menunjukkan puncak tunggal
untuk elusi substrat.
• Setelah 5 menit, setengah dari substrat diubah menjadi produk dan
setelah 10 menit semua MGMM tetrapeptida diubah menjadi produk
GMM (Gambar 3).
• Melihat ke area puncak elusi substrat dan dengan asumsi bahwa
setengah dari substrat memakan waktu 5 menit, aktivitas spesifik
enzim dihitung sebagai 1,51 μmol substrat menit/mg enzim
Proses Inteferon α-2b manusia
• Profil HPLC dari interferon α-2b manusia menunjukkan tiga puncak
yang mewakili tiga spesies, satu tanpa metionin N-terminal yang
memiliki berat molekul 19.265 Da, kedua, asetil-interferon α-2b tanpa
N-terminal metionin tetapi asetat memiliki molekul berat 19.307 Da,
dan ketiga Met-interferon α -2b dengan metionin dengan berat
molekul 19.396 Da.
• Untuk rekombinan E. coli metionin aminopeptidase murni, profil HPLC
yang menunjukkan kemajuan reaksi ditunjukkan setelah 0, 10, 20, 30,
dan 40 menit (Gambar 4), dan reaksi dihentikan setelah 36% substrat
dikonsumsi (Tabel Tambahan ST1)
4.Dibiarkan semalaman pada suhu 22oC

5.Sel dipanen dengan cara sentrifugasi

dengan kecepatan 4000 rpm selama 15
menit pada suhu 4oC

6. Menginduksi produksi protein pada suhu

relatif rendah (16-25)oC dengan hasil
20mg/L interferon alfa-2b-Glikosilat
7. Interferon alfa-2b- Glikosilat diisolasi
dengan Lectin Affinity Chromatography

8. Didapatkan hasil akhir rendemen

120 mg/L atau 1–2 × 106 cells/ml
interferon alfa-2b Glikosilat
Terima Kasih
Nella Novita 2121012021