A. Ratnadewi A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muha mmad Naqib A. A.

Istri , Zulfikar , Muhammad Naqib

yang sifatnya hampir sama. Untuk memperoleh Sampel yang digunakan adalah buah apel katalase dengan tingkat kemurnian yang tinggi, ( Malus sylvestris Mill. kultivar Rome Beauty perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut hasil budidaya Perkebunan Kusuma menggunakan metode yang lebih spesifik. Agrowisata, Malang) yang dipetik pada Pelaksanaan pemurnian masih dirasa sulit dan kematangan komersial , sedangkan bahan Proceeding of The 6 t h ITB-UKM Joint Seminar on Chemistry mahal sehingga informasi tent ang metode yang digunakan adalah pemurnian katalase dari buah apel masih tris(hidroksimetilamino)metana, Na -EDTA, 2 sangat sedikit. sodium dodesil sulfat (SDS), Isolasi, Pemurnian Dan Karakterisasi Katalase Dari Buah Apel ( Malus Sylvestris polivinilpirollidon (PVP, BM rata-rata 40000), Pada penelitian ini akan Mill. dilakukan isolasiRome Beauty) sebagai Biomaterial Sensor Kultivar gliserol 99 %, asam klorida (HCl), hidrogen katalase dari buah apel ( Malus sylvestris peroksida (H 2 O2 ), coomassie brilliant blue Rkultivar Rome Beauty). Ekstrak kasar katalase 1) 3) (CBB) 2 ),, ethanol (C 2 H OH), asam fosfat A. A.Istri Ratnadewi , 250 Zulfikar Muhammad Naqib 5 hasil isolasi dimurnikan berturut-turut meliputi (H3 PO4 ), ammonium sulfat [(NH 4 )2 SO4 ], asam fraksinasi dengan metode presipitasi sitrat, natrium dihidrogenfosfat (NaH PO4 . 2 2 1, 2) ammonium sulfat, dialisis dengan membran Kimia FMIPA, Universitas Jember H O), glisin, natrium hidroksida (NaOH), selofan, kromatografi kolom penukar ion Jalan Kalimantan III/252Jember, 68211, Indonesia nitrogen cair, bovine serum albumin (BSA), dewi_pjw2003@yahoo.com dengan DEAE-Selulosa. Elektroforesis reagent-reagent elektroforesis gel zulfikar@yahoo.com dilakukan untuk menentukan berat molekul. 3) dodesil sulfat dan Alumni Kimia FMIPA, poliakrilamida-sodium Universitas Jember, Indonesia Pemanfaatan katalase murni dari buah apel standar protein ( marker ), air deionisasi, dan naqib@yahoo.com sebagai biomaterial sensor merupakan suatu aquadest. terobosan baru dan katalase yang dihasilkan akan lebih berguna bila dapat digunakan Isolasi Katalase Abstrakdengan aktifitas dan berulang-ulang Sebanyak 30 gram daging buah apel segar Katalase merupakan enzim oksidoreduktase yang mengkatalisis dua jenis reaksi, yaitu disertai reprodusibilitas yang tetap tinggi. Berdasarkan dihaluskan menggunakan blender dan peroksidatik, dimana masing-masing mendekomposisikan hidrogen peroksida latar belakang katalitik yang telah di kemukakan, penambahan pasir kuarsa dan nitrogen cair. -1 dan hidroperoksida. Aktivitas spesifik katalase diukur dengan satuan Unit/mg . 1 Unit terdapat beberapa permasalahan yang ingin Setelah halus kemudian dihomogenisasi dalam adalah kemampuan katalase untuk mendekomposisikan substrat 1 mol hidrogen peroksida diungkap, yaitu : (a) Penentuan aktivitas 90 mL. buffer ekstraksi Tris-HCl 0,1 M (pH 0 H2 O2 dalam 1 menit pada kondisi pH 7 pada temperatur 30 C. Katalase dapat diisolasi dari katalase hasil isolasi dan pemurnian, (b) 8,5) yang mengandung polivinilpirollidon buah-buahan misalnya apel. Penelitian ini berorientasi pada pemanfaatan katalase sebagai Penentuan karakteristik hasil isolasi (PVP) 10% , Na 2ini -EDTA 0,5; 2,0 biomaterial katalase sensor, sehingga dibutuhkan katalase yang10%, relatif gliserol lebih murni. Penelitian dan pemurnian, yang meliputi pH dan dan 5,0 mM. Homogenat disentrifugasi pada bertujuan untuk mengisolasi dan memurnikan katalase yang dihasilkan dari buah apel temperatur optimum, (c) Penentuan kadar Rome Beauty) 15.000 gravitasikarakteristik selama 15(aktifitas, menit. Ekstrak (Malus sylvestris Mill. kultivar dan menentukan kadar protein katalase hasil isolasi dan pemurnian. kasar katalase diambil dari supernatan dan protein serta temperatur dan pH optimum). Tahapan-tahapan yang telah dilakukan untuk digunakan pada tahap berikutnya. memperoleh katalase murni, yang berturut-turut meliputi isolasi dari buah apel kultivar Aktifitas Penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah Rome Beauty, fraksinasi dengan metode presipitasi ammonium sulfat, dialisis menggunakan katalase diukur secara spektrofotometri satu alternatif pemanfaatan daging buah apel membran selofan, desalting dengan kolom Shepadex G-25, kemudian kromatografi kolom ( Malus sylvestris Mill. kultivar Rome Beauty) Fraksinasi Dan Dialisis Katalase penukar ion DEAE-Selulosa. Elektroforesis dilakukan untuk mengetahui berat molekul sebagai sumber kat al ase yang potensial. Protein dalam ekstrak kasar katalase katalase. Hasil penelitian menunjukkan bahwa katalase dari buah apel dapat diisolasi Informasi yang diperoleh dari hasil katalase penelitian dipresipitasi dengan penambahan larutan-1 ), kadar dengan aktivitas spesifik hasil pemurnian sebesar 1046,93 (Unit/mg -1 0 0,206 mg/ml bagi serta temperatur optimum 50 C dan pH optimum 8. Elektroforegram ini akan dapat protein menjadi pedoman ammonium sulfat 0100% (fraksi 040%, menghasilkan satu pita pada kisaran berat molekul 45.00066.000 kD. 6085%, dan fraksi 85 pengembangan pemanfaatan katalase buah fraksi 4060%, fraksi apel. Informasi mendasar tentang karakteristik 100%) pada 0C. Ekstrak pelet masing-masing Kata Kunci : Apel Rome Beauty, Kata lase, Karakteristik Kata lase, dan Elektrofregram enzi matis katalase juga dapat dimanfaatkan fraksi kemudian ditentukan aktivitasnya secara oleh para bioanalis disektor industri maupun spektrofotometri. Ekstrak pelet dengan 1. Pendahuluan 2001). Dalam jaringan suatu organisme, riset untuk mempelajari karakteristik katalase aktivitas tertinggi kemudian didialisis selama Pesatnya penggunaan enzim dalam bidang 12 jam katalase dikenal karena dialisis kemampuannya dan menganalisis hidrogen peroksida. menggunakan kantung selofan. analitik-medis, pangan, non pangan, dan mengkonversi hidrogen peroksida yang bersifat Hasil dialisis kemudian ditentukan aktivitasnya 2. Percobaan farmasi menempatkan enzim sebagai bioaktif secara spektrofotometri toksik terhadap sel menjadi molekul air dan Tempat dan Bahan yang esensial untuk diproduksi. Katalase oksigen. Pemanfaatan katalase berbagai Penelitian dilakukan di Pusat Penelitian Penentuan Aktivitas Dengan merupakan salah satu enzim yang telah sumber denganKatalase kemurnian tinggi telah banyak Biologidiisolasi Molekuler, Laboratorium Biokimia Spektrofotometri dari berbagai sumber seperti dilakukan, terutama sebagai biomaterial sensor Jurusantumbuhan, Kimia, dan Laboratorium Penentuan aktivitas berdasarkan metodeyang Cohen hewan, mikroorganisme, dan karena spesifitas dan produknya spesifik Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas yang dimodifikasi (Graham dan Higgins, 1993) metabolit. Isolasi katalase dari jaringan dan aman. Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, serta dilakukan pada 4C. tumbuhan telah banyak dilakukan, termasuk Katalase hasil isolasi masih memiliki tingkat laboratorium Pengendalian Mutu Pusat isolasi katalase dari anggur (Kharizanov, kemurnian yang rendah karena kemungkinan Pelatihan Bogasari Fakultas Teknologi 1974), tomat (Valenzula et al ., 1991), kentang adanya berbagai protein dan enzim-enzim lain Pertanian Universitas Jember. (Bering, 1994), dan pir (Larrigaudiere et al .,

h Proceeding Proceeding of The 6 of tThe ITB-UKM 6 t h ITB-UKM Joint Seminar Jo int o Seminar n Chemistry on Chemistry

Departement of Chemistry ITB, Jl. Ganesha 10, Bandung 40132, Phone : +62 (22) 2502103 ext 101, Fax : +62 (22) 2504154, Homepage : http://www.chem.itb.ac.id/jschem, E-mail : jschem@chem.itb.ac.id

A. A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muha mmad Naqib

Penentuan Kadar Protein Katalase Penentuan protein dilakukan berdasarkan metode Bradford (Whitaker,1994) dengan standar bovine serum albumin (BSA). Penentuan Temperatur dan pH Optimum Penentuan temperatur optimum dan pH optimum dilakukan berdasarkan metode Cohen yang dimodifikasi (Graham dan Higgins, 1993). Pemurnian Katalase dengan Kromatografi Penukar Ion Tahapan pemurnian menggunakan kromatografi penukar ion dilakukan berdasarkan metode Prento dan Prento (1984). 3. Hasil dan Pembahasan Enzim Katalase Hasil Isolasi Pada tahap isolasi dilakukan langkah homogenisasi dengan buffer dan zat aditif merupakan langkah terpenting. Pada langkah ini, buffer Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) yang mengandung PVP, gliserol, dan zat aditif dihomogenisasi bersama dalam blender, dimana masing-masing memiliki fungsi berbeda yang dibutuhkan enzim dalam medium barunya. Tris-HCl sebagai buffer akan mempertahankan pH ekstrak sekitar 8,5. Hal ini berkaitan dengan terlepasnya asam-asam fenol yang akan menyebabkan penurunan pH ekstrak. Walaupun pH 8,5 bukan merupakan pH optimum katalase namun pH tersebut termasuk kisaran pH aktif katalase dalam mendekomposisi substratnya. Sampel berupa jaringan daging buah apel sangat rentan terhadap perubahan warna ( browning ). Perubahan warna ini diakibatkan oleh adanya kerusakan jaringan yang menyebabkan terjadinya perubahan aktivitas metabolisme in vivo . Adanya oksigen diudara terbuka juga akan menimbulkan reaksi

senyawa-senyawa fenolat atau polifenol yang dikatalisis enzim. Fenol dalam vakuola dapat bertindak sebagai substrat bagi reaksi polifenol oksidase (enzim utama penyebab browning ) apabila jaringan pembatas vakuola mengalami kerusakan. Inaktivasi senyawa fenolat (polifenol) selama isolasi enzim sangat penting dilakukan untuk menghasilkan enzim tanaman dalam keadaan native (Beevers, 1991). Pada penelitian ini dilakukan upaya untuk mengikat senyawa-senyawa fenol atau polifenol melalui penambahan absorben kedalam medium homogenisasi. Penambahan PVP (BM rata-rata 40.000) sebagai suatu polimer sering digunakan untuk mengikat senyawa-senyawa fenol dan untuk meminimalkan koagulan kloroplas (Waters et al ., 1982; Siebert, 1999) dalam campuran reaksi tersebut, yang ternyata efektif dalam menginaktivasi senyawasenyawa fenol. Zat aditif selalu ditambahkan pada setiap proses isolasi untuk melindungi komponenkomponen enzim dari inaktivasi. EDTA adalah zat aditif yang sering ditambahkan pada proses homogenisasi, karena buffer yang digunakan dalam isolasi suatu enzim lebih baik mengandung kelator logam berat seperti EDTA (Beevers, 1991; Sugiharto, 1998). Dalam penelitian ini konsentrasi EDTA sebagai garamnya, Na 2 -EDTA divariasi antara 0,5; 2,0 dan 5,0 mM. Hal ini sesuai dengan Scopes (1982) yang menyebutkan bahwa EDTA dapat digunakan pada konsentrasi antara 0,15,0 mM. Na 2 -EDTA adalah pengkelat yang sering digunakan karena selain sebagai kelator kuat juga memiliki affinitas yang non spesifik untuk beberapa logam. Berdasarkan tabel berikut tampak bahwa penggunaan EDTA 0,5 mM akan menurunkan aktivitas katalase sebesar 44,427% bila dibandingkan dengan ekstrak kasar katalase tanpa zat aditif apapun. Aktivitas katalase meningkat sebesar 4,336%
2

Tabel 1. Aktivitas Relatif Katalase Pada Berbagai Konsentrasi Na Konsentrasi (mM) 0,0 100,000 0,5 55,5730 2,0 104,336 5,0 38,6450
1

-EDTA
1

Aktivitas Relatif (%)

Aktivitas relatif merupakan prosentase rasio aktivitas ekstrak kasar katalase + Na 2 -EDTA terhadap ekstrak kasar katalase tanpa Na -EDTA (non aditif) 2 Proceeding of The 6
th

ITB-UKM Jo int Seminar on Chemistry

A. A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muhammad Naqib

Fraksi

Vol. (ml)

Tabel 2. Aktivitas Dan Kadar Protein Fraksi (NH A A. T. K. P. -1 (unit) (unit.ml ) (mg.ml -1 )

) SO 4 0100% A. S. (unit.mg -1 ) Hasil (%) F. K.

4 2

E. K 100,0 2610,957 26,110 1,641 15,912 100,000 1,000 040 45,6 959,6490 21,045 1,228 17,137 74,840 1,077 4060 38,3 1496,213 39,066 1,522 25,670 92,7450 1,613 6085 20,5 2624,334 128,016 2,093 61,145 127,596 3,843 85-100 15,1 1273,263 84,238 1,409 59,780 85,8780 3,757 E.K. : ekstrak kasar katalase + disodium EDTA 2,0 mM A, A.T., K. P., A. S., F. K. masing-masing adalah aktivitas, aktivitas total, kadar protein, aktivitas spesifik, dan factor kemurnian

Tabel 3. Data Pemurnian Katalase Apel Rome Beauty A A. T. K. P. A. S. J.P. Vol. (ml) (unit) (unit.ml - 1 ) (mg.ml 1 ) (unit.mg -1 ) Hasil (%) F. K. E. K 100,0 2610,957 26,110 1,641 15,912 100,000 1,000 Fraksi 6085% 20,5 2624,334 128,016 2,093 61,145 127,596 3,843 Dialisat 9,0 2492,051 276,895 1,443 191,868 87,951 12,058 Kat. DesSephadex 8,5 425,17 50,020 0,214 233,738 13,041 14,689 G-25 Kat. Murni1,50 323,500 215,670 0,206 1046,93 32,190 65,795 DEAESelulosa J.P. : Jenis perlakuan E. K : ekstrak kasar katalase + disodium EDTA 2,0 mM Dialisat : katalase (+ disodium EDTA 2 mM) hasil dialisis Kat. Des- : katalase hasil desalting Kat. Murni : katalase murni hasil kromatografi A, A.T., K. P., A. S., F. K. masing-masing adalah aktivitas, aktivitas total, kadar protein, aktivitas spesifik, dan fakto r kemurnian

pada penggunaan Na -EDTA 2 mM dan 2 berkurang hingga 61,355% pada konsentrasi Na2 -EDTA 5,0 mM. Tabel 1 menunjukkan aktivitas katalase pada konsentrasi EDTA yang digunakan. Berdasarkan tabel tersebut tampak bahwa pada konsentrasi Na 2 -EDTA yang rendah (0,5 mM) menyebabkan penurunan aktivitas katalase. Pada konsentrasi ini, Na -EDTA hanya 2 bertindak sebagai inhibitor metallo-protease, karena dalam fungsi ini Na 2 -EDTA yang dapat digunakan antara 0,11,0 mM (Deutscher, 1990), sedangkan fungsi kelat logam Na 2 EDTA yang tidak dominan menyebabkan penurunan aktivitas katalase. Pada konsentrasi 2,0 mM tampak terdapat peningkatan aktivitas kat alase. Hal ini kemungkinan merupakan

konsentrasi Na 2 -EDTA yang dibutuhkan katalase sebagai metallo-protease dan pengkelat logam-logam yang terdapat pada tahap isolasi. Aktivitas yang lebih rendah terjadi pada konsentrasi Na 2 -EDTA yang lebih tinggi (5,0 mM). Hal ini dihubungkan dengan kemampuan Na 2 -EDTA sebagai sequester logam. Katalase yang dalam formasi aktifnya mengandung besi kemungkinan mengalami sequester oleh EDTA, yang menyebabkan penurunan aktivitas ekstrak kasar katalase, dengan mempertimbangkan affinitas EDTA yang non spesifik. EDTA telah diketahui sebagai sequester kation divalen sehingga dapat menyingkirkan ion tembaga(II) dari jaringan selama isolasi (Gong et al ., 2000). Oleh karena itu tiga hal yang

Proceeding of The 6

th

ITB-UKM Joint Seminar o n Chemistry

A. A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muha mmad Naqib

cukup penting dalam penambahan Na 2 -EDTA ini berkaitan dengan kemampuannya sebagai inhibitor browning (Sapers et al ., 1984), inhibitor metallo-protease (Deutscher, 1990; Bollag dan Edelstein, 1991), dan sequester logam-loga m inhibitor katalase [terutama ion tembaga(II)] (Kocsis dan Hanson, 2000; Gong et al ., 2000). Katalase Hasil Fraksinasi Pada penel itian ini, purifikasi awal dilakukan melalui fraksinasi menggunakan ammonium sulfat (NH 4 )2 SO4 . Fraksinasi adalah presipitasi ekstrak kasar dengan konsentrasi bert ingkat (NH4) 2 SO4 0100% jenuh. Pada tahap ini terdapat pula proses resuspensi dan sentrifugasi tambahan pembentukan pellet yang akan menyebabkan pemecahan organel sel (Beevers, 1991). Tabel 2. menunjukkan bahwa aktivitas dekomposisi tertinggi diperoleh pada fraksi 6085%. Apabila dibandingkan dengan ekstrak kasar maka katalase yang diperoleh pada fraksi 6085% ini memiliki tingkat kemurnian lebih

t inggi. Berdasarkan hal tersebut maka fraksi 6085% dipilih untuk dipisahkan dan dimurnikan lebih lanjut pada tahap dialisis. Tabel 2 menunjukkan aktivitas dan kadar protein fraksi (NH 4 )2 SO4 . Katalase Hasil Dialisis Tahap dialisis dilakukan pada temperatur 0 8o C. Pellet fraksi 6085% yang telah disuspensi ke dalam buffer diinjeksikan ke dalam kantung dialisis. Aktivitas dan kadar protein suspensi fraksi 6085% dan katalase hasil dialisis diberikan pada tabel 3. Katalase Hasil Pemurnian Dengan Penukar Anion Pemurnian dengan penukar anion DEAESelulosa didasarkan pada terdapatnya perbedaan pH isoelektrik dari enzim atau protein yang terdapat pada fraksi hasil desalting Sephadex G-25. Katalase diikatkan pada matriks kolom DEAE-Selulosa dengan buffer Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0). Proses elusi selanjutnya j uga dilakukan menggunakan

Profi l El usi Katal ase Hasil Pemurnian

110 100 90 80 0.2 70 60 50 40 30 0.05 20 10 0 0 102030405060708090100 -10 0.1 0.15 : Aktivitas : Abs. 280 nm : Gradien NaCl 0.3

1M

0.25

0M NaCl

Nomor Fraksi (@2,5 ml)

-0.05

Gambar 1. Profil elusi katalase pada pemurnian dengan kromatografi penukar anion Proceeding of The 6
th

ITB-UKM Jo int Seminar on Chemistry

A. A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muhammad Naqib Profil Aktivitas Relatif Katalase Pada Berbagai Te m pe r at ur
1730 1430 1130 830 530 230 -70 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Te m p e ra tu orC) ( 105 95 85 75 65 55 45 35 25 15 5 -5

Profil Aktivitas Re latif Katalase Pada Be rbagai pH

23 45678 9101112

pH Medi um

Gambar 2. a.

Profil aktivitas relatif katalase p ada berbagai pH; berbagai temperatur

b. Profil aktivitas relative katalase pada

buffer awal Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) yang diberikan gradien konsentrasi satu tahap NaCl 0-1 M untuk melepas protein enzim secara selektif maupun protein lain yang kemungkinan masih terikat pada matriks kolom. Profil elusi yang dihasilkan ditunjukkan pada gambar 1. menggunakan eluen gradien konsentrasi NaCl 0-1 M dalam buffer Tris-HCl 0,1 M (pH 7). Pada gambar tersebut tampak bahwa hasil pengukuran absorbansi pada 280 nm terhadap fraksi hasil elusi menunjukkan adanya empat puncak (peak) protein yaitu pada fraksi 24-39, fraksi 57-59, fraksi 65-67, dan fraksi 71-79. kee mpat puncak tersebut kemudian dilakukan penentuan aktivitas katalitiknya menggunakan substrat hidrogen peroksida H 2 O2 . hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa fraksi 24-39

atau puncak yang pertama ternyata menunjukkan adanya aktivitas katalitik. Fraksi yang menunjukkan adanya aktivitas tersebut kemudian dikumpulkan yang selanjutnya dilakukan dialisis dalam buffer Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0). Data pemurnian ditunjukkan pada tabel 3. Fraksi katalase hasil kromatografi penukar anion ini dianggap telah bersifat murni karena hasil pemisahannya menunjukkan aktivitas spesifik 65,8 kali lebih besar daripada fraksi ekstrak kasar. Aktivitas spesifik yang dihasilkan merupakan rasio unit katalase terhadap jumlah protein yang dimiliki. Aktivitas enzim berhubungan dengan tingkat kemurnian, sehingga makin t inggi t ingkat kemurnian enzim maka besarnya aktivitas spesifik akan bertambah.

Da

16

35

Da

66.000 45.000 31.000

66.000 45.000 31.000

14.200 12 3 456

14.200

Gambar 3 . Elektroforegram protein katalase. Lajur 1 dan 6 : marker, lajur 2 dan 4 : katalase (30 g), lajur 3 dan 5 : katalase (20 g)

Proceeding of The 6

th

ITB-UKM Joint Seminar o n Chemistry

A. A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muha mmad Naqib

Temperatur Optimum Katalase Kondisi temperatur berkaitan erat dengan faktor-faktor yang mempengaruhi mekanisme kerja suatu enzim, yaitu energi aktivasi dan stabilitas enzim. Berdasarkan gambar 2a, pada temperatur antara 10 hingga kurang dari 50 o C (temperatur rendah) katalase belum memiliki energi aktivasi yang memadai untuk memulai reaksi dekomposisi hidrogen peroksida, sehingga dekomposisi tersebut tidak dapat berlangsung dengan sempurna yang ditandai dengan aktivitas katalase yang rendah. Pada kondisi temperatur optimum 50 katalase telah memiliki energi yang cukup untuk memulai reaksi dekomposisi sehingga reaksi dapat berlangsung dengan sempurna. Dengan kata lain energi yang diperoleh katalase sama dengan energi aktivasi yang dibutuhkan untuk mendekomposisi hidrogen peroksida menjadi molekul air dan oksigen.
o

pH tersebut membuat konformasi katalase tepat berpasangan dengan konformasi substratnya. Visualisasi Elektroforesis Katalase Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul akibat pengaruh filtrasi gel. Pada pengamatan terhadap pita dengan injeksi untuk 20 g ternyata menunjukkan pita dengan intensitas yang lemah. Rf yang dihasilkan masing-masing sebesar 0,306 dan 0,429. Pada injeksi 30 g untuk katalase yang sama menunjukkan pita dengan intensitas kuat dan memiliki Rf sebesar 0,265, 0,306, dan 0,429. Intensitas pita yang dihasilkan menunjukkan adanya pita selain protein yang dimaksud. Pita ini diduga sebagai pemunculan protein selain katalase yang masih terdapat dalam larutan. Bila ditinjau berdasarkan berat mol ekul nya, tampak bahwa katalase hasil dialisis mengalami disosiasi menjadi sub unit dengan berat molekul yang lebih kecil. Katalase apel merupakan enzim tetramer dengan berat molekul sub unit berkisar 53.00065.000 Dalton. Pada penelitian ini berhasil diperoleh katalase dengan berat molekul berkisar sebesar 46.431,67-65.894,16 Dalton, seperti tampak pada gambar 3. Hal ini dimungkinkan sebagai akibat penggunaan SDS dalam elektroforesis, yang berperan mendisosiasi protein enzim terintegrasi. Katalase hasil pemurnian mengalami disosiasi menjadi sub unit dengan berat molekul yang lebih kecil. Katalase ini merupakan enzim tetramer dengan berat molekul sub unit berkisar 53.00065.000 Dalton. Pada penelitian ini berhasil diperoleh katalase dengan berat molekul berkisar sebesar 45.00066.000 Dalton, seperti tampak pada gambar 4. Satu pita yang tampak tersebut menunjukkan bahwa pemurnian dengan kromatografi penukar anion DEAE-Selulosa telah mampu menghasilkan katalase apel dengan tingkat kemurnian yang cukup tinggi .

Kondisi temperatur yang lebih tinggi yaitu lebih dari 50 hingga 100 o C (diatas temperatur optimum) dapat menyebabkan ketidakstabilan katalase. Hal ini berkaitan erat dengan kelarutan dan perubahan konformasi katalase dalam larutan. pH Optimum Katalase Kondisi pH dalam pengujian aktivitas katalase ditentukan antara pH 3,0 hingga 10,0 dengan interval 0,5 satuan pH berdasarkan aktivitas minimum pada keadaan asam dan basa. Gambar 2b. menunjukkan bahwa perubahan pH medium dapat mempengaruhi aktivitas katalase secara in vitro . Peningkatan pH dimulai dari 3,0 hingga pH 8,0 menyebabkan aktivitas katalase juga meningkat dan selanjutnya mengalami penurunan aktivitas pada pH diatas 8,0. Berdasarkan rentang tersebut diketahui bahwa katalase memiliki kisaran pH yang lebar, sehingga di luar rentang tersebut dapat dipastikan katalase tidak akan aktif sama sekali. pH optimum ini merupakan salah satu karakteristik katalase yaitu katalase memiliki kelarutan pada pH 8,0 dan jumlah ion-ion pada

Proceeding of The 6

th

ITB-UKM Jo int Seminar on Chemistry

A. A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muhammad Naqib

Da 1
66.000

45.000

5. Ucapan Terimakasih Penelitian ini dilaksanakan dengan sumber dana Proyek Penelitian Ilmu Pengetahuan Dasar DP3M Dirjen DIKTI DEPDIKNAS tahun anggaran 2004. Penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah me mbantu hingga terselesaikannya penelitian ini, antara lain Lembaga Penelitian Universitas Jember, para Kepala dan Staf laboratorium yang telah mengizinkan penggunaan fasilitas laboratoriumnya untuk menunjang penelitian ini, serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu. 6. Daftar Pustaka
Beevers, H. (1991). Metabolic Compartmentation in Plant Cells. In : Society for Experimental Biology. Compartmentation of Plant Metab olism in NonPhotosynthetic Unit Tissue. Seminar Series : Emes, M. J. (Ed.).. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 1-21. Bollag, D. M., and S. J. Edelstein, (1991). Protein Methods. Wiley-Liss A John Wiley & Sons, Inc. Publication, New York Bering, C. L., (1994). Enzymes. A Workshop for Secondary School Students, J. Chem.. Educ., 241. 71 (3),

Gambar 4. Elektroforegram protein katalase. Lajur 1: marker, lajur 2 d an 3 : katalase hasil pemurnian (20 g).

4. Kesimpulan Ekstrak kasar katalase berhasil diisolasi dari daging buah apel varietas Rome Beauty dengan -1 dan aktivitas total sebesar 26,110 unit.ml kadar protein 1,641 Unit.mg -1 . Purifikasi parsial awal yang dilakukan menggunakan (NH 4 )2 SO4 6085% jenuh dapat meningkatkan aktivitas total ekstrak kasar katalase (+ Na 2 - EDTA 2,0 mM). Hal ini ditandai dengan aktivitas total yang dihasilkan hingga 128,016 unit.ml -1 dan kadar protein sebesar 2,094 mg.ml -1 . Aktivitas total tersebut akan meningkat pada penggunaan dialisis pada tahap purifikasi parsial berikutnya, yaitu sebesar 276,895 unit.ml - 1 dan menghasilkan kadar protein 1,443 mg.ml -1 . Katalase apel hasil dialisis memiliki karakteristik enzimati s meliputi temperatur optimum sebesar 50 o C dan optimum pada pH 8,0. Penggunaan SDS-PAGE untuk mengetahui homogenitas protein hasil dialisis menghasilkan berat molekul protein katalase hasil dialisis, yaitu sebesar 46.431,6765.894,16 Dalton atau merupakan berat molekul sub unit monomer katalase. Katalase berhasil dimurnikan dari daging buah apel varietas Rome Beauty dengan aktivitas -1 dan kadar total sebesar 215,670 unit.ml protein 0,206 unit.mg -1 . Penggunaan SDSPAGE untuk mengetahui homogenitas protein hasil dialisis menghasilkan berat molekul protein katalase hasil dialisis, yaitu sebesar 45.000-66.000 Dalton atau merupakan berat molekul sub unit monomer katalase.

42 ,

Deutscher, M.P., (19 90). Maintaining Protein Stability. In : Methods in Enzymolo gy, 182 . Guide to Protein Purification, Deutscher, M. P. (Ed.), Academic Press, San Diego, pp. 83-85. Gong, Y., P. M. A. Toivonen, P. A. Wiersma, C. Lu, and O. L. Lau, (2000). Effect of Freezing on the Activity of Catalase in Apple Flesh Tissue, J. Agric. Food Chem., 48 (11), 55375542. Graham, J. M., and Higgins, J. A., (1993). Isolation and Analysis: The Identification of Subcellular Fractio ns fro m Mammalian Cells. In : Methods in Molecular Biology Biomembrane Protocols : I. Isolation and Analysis, 19 , Graham, J. M., and Higgins, J. A. (Ed.), Humana Press, Totowa, pp. 118. Kharizanov, A., (1974). A Morfological Studies on Erythroneura arboridia adenae vitisuga, Rev. App l. Entomol. A-Agric., 62 (2), 133. Kocsis, M. G., and Hanson, A. D., (2000). Biochemical Evidence for Two Novel Enzymes in the Biosynthesis of 1-Dimethylsulfonicpropionate in Spartina alterniflora, Plant Physiol., l. 123 (3), 11531161. Larrigaudiere, C., E. Pinto, I. Lentheric, and M. Vendrell, (2001). Involvement of Oxidative Processes in the Development of Core Browning in

Proceeding of The 6

th

ITB-UKM Joint Seminar o n Chemistry

A. A.Istri Ratnadewi , Zulfikar , Muha mmad Naqib Controlled-Atmosphere Stored Pears, J. Hort. Sci. Biotechnol., 76 (2), 157162. Prento, P., and A. Prento, (1984). Crystalline Catalase from the Earthworm Lumbricus terrestris (Oligochaeta : Annelida); Purification and Properties, Comp. Biochem. Physiol., 77B (2), 325 328. Sapers, G. M., Miller, R. L., Miller, F. C., Cooke, P. H., and Choi, S. W., (1994). Enzymatic Browning Control in Minimally Processed Mushrooms, J. Food Sci., 59 (5), 10421047. Scopes, R. K., (1982). Protein Purification. Principles and Practice, Springer-Verlag: New York. Siebert, K. J., (1999). Effect of Protein-Polyphenol Interactions on Beverage Haze, Stabilization, and Analysis : Reviews, J. Agric. Food Chem., 47 (2), 353-362. Sugiharto, B., dan T. Handoyo, (1998). Workshop Nol Dasar-Dasar Biologi Molekuler: Petunjuk Analisis Pada Workshop Dasar-Dasar Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Biologi Molekuler Universitas Jember, Jember, hal. 17. Valenzula, J. L., A. Snchez, and L. Romero, (1991). Physiological Plant Age Dependent Biochemical Indicators and Physiological Parameters o f Iron Nutritio n. In : Proceed ings of The Fifth International Symposium on Iron Nutrition and Interactions in Plants : Iron Nutrition and Interactions In Plants, 43 , Chen, Y., and Y. Hadar. (Ed.), Kluwer Academic Publishers Dordrecht, pp. 107 116. Waters, S. P., Noble, E. R., and Dallig, M. J., (1982). Intracellular Localization of Peptide Hydrolases in Wheat (Triticum aestivum L.) Leaves, Plant Physiol., 69 (3), 575579. Whitaker, J. R., (1994). Principles of Enzymology for The Food Sciences. Marcel Dekker, Inc., New Yor k

Proceeding of The 6

th

ITB-UKM Jo int Seminar on Chemistry