Pembuatan Media

Gel terdiri dari gel bawah ( rurning gel = separatin gel ) dan gel atas ( stacking gel ) dibuat
dengan komposisi bahan-bahan seperti pada tabel berikut :
Gel Bawah
%Gel
Akrilamida / Bis 30 :
0,8% w/v
Tris-HCL 1,0 M p H 8,8
SDS 10%
H2O
APS 10%
TEMED
Jumlah

8%
4,0 ml

10%
5,0 ml

12,5%
6,2 ml

6,0 ml
150 L
4,86 ml
7,2 L
10,0 L
15,0 L

6,0 ml
150 L
3,8 ml
7,2 L
10,0 L
15,0 L

6,0 ml
150 L
2,6 ml
7,2 L
10,0 L
15,0 ml

Semua bahan dicampur, kecuali APS dan TEMED dicampur pada saat akan dimasukkan ke dalam cetakan
gel.
% gel
Akrilamida / Bis 30 : 0,8% w/v
Tris-HCL 1,0 M pH 8,8
SDS 10%
H2O
APS 10%
TEMED
Jumlah

4%
1,3 MI
1,2 mL
100 L
7,2 MI
5,0 L
10,0 L
10,0 ml

6%
2,0 ml
1,2 ml
100 L
7,2 ml
5,0 L
10,0 L
10,0 L

Semua bahan dicampu, kecuali APS dan TEMED dicampur pada saat akan dimasukkan ke dalam cetakan
gel
Keterangan : Jika gel bawah < 10%, maka digunakan gel atas 4% ; sedangkan jika gel bawah > 10%
maka digunakan gel atas 6%
Setelah gel bawah dimasukkankedalam cetakan gel dengan tinggi 10cm, masukkan aquades pelapis
diatasnya agar permukaannya rata dan mencegah hambatan polimerisasi oleh oksigen, lalu tunggu 25-40
menit. Setelah gel terbentuk, aquades pelapis diambil, kemudian masukkan gel atas kira-kira 1cm. Segera
setelah sel atas dimasukkan ke dalam cetakan kotak, msukkan sisir khusus untuk membuat sumur tempat
sampel lalu tunggu 20-50menit. Setelah terbentuk gel atas, kemudian sisir dikeluarkan.
3.3 Persiapan Sampel
Sebelum sampel (serum 5mg/ ml, y-globulin 2 mg/ml, dan transferin 2 mg/ml) dimasukkan ke
dalam gel, sampel dicampur dengan buffer sampel yang mengandung merkaptoetanol dan SDS, didihkan
selama 5 menit untuk mereduksi protein sampel sehingga bermuatan negative, kemudian sampel
didinginkan pada suhu ruang.

3.4 Proses Pemisahan

Preparasi sampel, mula-mula protein didenaturasi dengan pemanasan larutan dapar yang
mengandung sodium dodesil sulfat (SDS). Denaturasi dalam SDS panas akan memberikan muatan negatif
pada seluruh protein dalam larutan, karena terjadi interaksi hidrofobik antara molekul protein dengan
protein SDS. Interaksi ini sebanding dengan ukuran molekul suatu protein. Jadi, makin besar ukuran
molekul suatu protein, makin banyak muatan negative hasil interaksi protein dengan SDS.
Selanjutnya bila diberi medan lisrik, kompleks protein yang terdenaturasi SDS di dalam gel
poliakrilamid akan berjalan ke satu arah, yaitu kutub positif (anoda). Jarak yang ditempuh ditentukan oleh
ukuran molekul dalam menembus pori-pori gel. Makin kecil molekul tersebut, makin jauh jarak yang
ditempuh. Dengan demikian, terjadilah pemisahan protein berdasarkan berat molekul.
Gel poliakrilamid dibentuk oleh polimerisasi akrilamid (CH2=CH-CO-NH2) dan bisakrilamid
(N,N-metilenbisakrilamid)(CH2=CH-CO-NH2-CH2-NH-CO-CH=CH2). Proses pembentukan polimer
ini diawali oleh suatu sistem yang menghasilkan radikal bebas. Umumnya, polimerisasi diawali dengan
penambahan ammonium persulfat (APS) sebagai inisiator, dan tetrametilendiamin (TEMED) sebagai
akselerator. Pada proses ini TEMED mempercepat