USE OF PCR FOR DIRECT DETECTION OF CAMPYLOBACTER SPECIES IN

BOVINE FECES
Contoh Penerapan Amplifikasi Gen
Jurnal ini membahas mengenai penggunaan PCR untuk langsung mendeteksi dan
membedakan spesies Campylobacter dalam kotoran sapi tanpa pengayaan uraniumnya. Inhibitor
yang ada dalam tinja adalah rintangan utama untuk menggunakan PCR dalam mendeteksi
mikroorganisme. Metode mini kit ternyata tidak manjur untuk ekstraksi, seperti yang ditetapkan
oleh amplifikasi positif dari internal kontrol DNA ditambahkan ke kotoran sapi sebelum
ekstraksi. Campylobacter coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni tersebut diletakkan atau
seminested multiplex PCR, yang dideteksi pada semua sampel kotoran, kemudian diinokulasi di
104 CFU g-1 dan 50 hingga 83 % dari sampel diinokulasi di 103 CFU g-1 terbukti positif. Pada
102 CFU g-1 C. fetus, C. hyointestinalis, and C. jejuni ( 17 hingga 50 persen dari sampel ) selain
C. coli terdeteksi oleh PCR. Dari kotoran sapi uninoculated, dipilih secara acak sebanyak 196
Campylobacter diisolasi ditemukan di empat yang umum digunakan di tiga media isolasi dalam
inkubasi.
Kelompok yang paling sering ditemukan adalah C. jejuni ( 152) dan C. lanienae ( 42),
tapi mengisolasi C. Janin. Janin, Arcobacter butzleri, dan. Skirrowii juga ditemukan. Frekuensi
isolasi Campylobacters cukup bervariasi terpantau di antara empat media dan tiga suhu inkubasi
yang diujikan. Dengan primer genus-specific, Campylobacter DNA itu terdeteksi di 75 persen
sampel kotoran, terjadi 8 persen peningkatan dibandingkan dengan yang diperoleh dari
sensitivitas isolasi mikrobiologi di empat media dan tiga suhu inkubasi yang diujikan. Dengan
primer bersarang, C. jejuni dan C. lanienae tersebut yang masing-masing terdeteksi 25 dan 67
persen dari sampel. Tidak ada DNA yang terlihat baik dari C. coli, C. janin, atau C.
hyointestinalis dideteksi pada kotoran sapi yang tidak diinokulasi. PCR lebih sensitif dari isolasi
mikrobiologi pada media untuk mendeteksi C. lanienae ( 17 % ) tetapi tidak C. jejuni.
Campylobacters yang beragam dan pengembangan langsung PCR tidak hanya akan
meningkatkan pemahaman tentang spesies Campylobacter yang beragam dan frekuensi
kemunculannya dalam kotoran, tetapi juga akan meningkatkan pengetahuan tentang peran
mereka dalam saluran pencernaan ternak dan dari sejumlah faktor yang mempengaruhi.

Cara Pembuatan
Perkembangan percobaan. Percobaan yang dilakukan untuk setiap tujuan disajikan pada
Gambar. 1. Untuk tujuan pertama (Gbr. 1A), DNA pengendalian internal dan primer untuk
mendeteksi spesies Campylobacter langsung dalam kotoran dikembangkan. Untuk tujuan kedua
(Gambar. 1B), sensitivitas PCR untuk memperkuat spesies ganjil-lobacter langsung dari kotoran
sapi diinokulasi dengan empat taksa itu com-dikupas dengan yang pengenceran plating. Khasiat
dari DNA ekstraksi kit komersial untuk menghapus inhibitor PCR juga dipastikan dengan
menggunakan DNA pengendalian internal dirancang untuk digunakan dengan Campylobacter
genus spesifik primer. Untuk ketiga ob-jective (Gambar. 1C), deteksi spesies Campylobacter
dalam kotoran sapi tanpa inokulasi dengan PCR dibandingkan dengan pengenceran plating.
Karena fre-quency tinggi isolasi C. lanienae, primer bersarang dikembangkan untuk takson ini
dan

kemudian

digunakan

dalam

PCR

multiplex

dengan

primer

untuk

C.

janin.

Tujuan 1. (i) Uji taksa dan budaya kondisi. Primer untuk mendeteksi DNA dari Campylobacter
genus, C. coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni langsung dalam kotoran sapi yang
dikembangkan (Tabel 1). Kami memilih ini taksa menjadi penyebab hubungan mereka dengan
spesies sapi. Untuk meningkatkan sensitivitas dan spec-ificity, primer untuk C. coli, C. janin, C.
hyointestinalis, dan C. jejuni yang bersarang atau seminested. Selanjutnya, C. coli dan C. jejuni
diuji

oleh

multipleks

PCR.

Strain referensi berikut ini digunakan untuk menguji primer yang kita devel-oped: Arcobacter
butzleri (ATCC 49616 [Koleksi Budaya Tipe Amerika]), A. cryaerophilus (ATCC 49942), C. coli
(HC 1111 [Kesehatan Kanada] dan ATCC 49941 ), C. concisus (ATCC 33237), C. janin subsp.
janin (ATCC 25936), C. janin subsp. venerealis (ATCC 19438), C. hyointestinalis subsp.
hyointestinalis (ATCC 35217), C. hyointestinalis subsp. lawsonii (NCTC 12901 [National
Collection of Type Budaya dan Pathogenic Jamur]), C. jejuni (HC 1102, HC 1104, HC 1115, HC
1108, ATCC 29428, ATCC 49943, dan ATCC 33291), C. lanienae (NCTC 13004) , C. lari (ATCC
35221), dan C. upsaliensis (LCDC 5424 [Laboratorium Pusat Pengendalian Penyakit]). Untuk
mendapatkan biomassa, semua isolat ditumbuhkan pada Campylobacter darah bebas agar base
selektif (dimodifikasi agar Campylobacter arang diferensial [CCDA]) (Oxoid, Nepean, Ontario,
Kanada) tanpa suplemen antibiotik atau brucella agar (Difco, Detroit, Mich.) Di 37 C dalam

stoples gas anaerobik (Oxoid). kondisi mikroaerofilik yang dihasilkan dengan CampyPak
Ditambah microaerophilic dengan katalis paladium (BBL, Becton Dickinson, Sparks, Md.).
(Ii) ekstraksi DNA genom dan metode PCR. DNA diekstraksi dari strain referensi dengan
menggunakan kit DNeasy (Qiagen Inc, Mississauga, Ontario, Kanada) menurut protokol pabrik.
Kondisi untuk amplifikasi primer 1 siklus pada 95 C selama 15 menit; 25 siklus 30 s pada 94
C, 90 s pada suhu anil (Tm), dan 60 s pada 72 C; dan ekstensi selama 10 menit pada 72 C.
Untuk reaksi multipleks, campuran terdiri dari total volume 20 l mengandung penyangga reaksi,
0,2 mM deoxynucleoside trifosfat, 2 mM MgCl2, 0,5 M masing-masing primer (Sigma-Genosys,
Oakville, Ontario, Canada), 0,2 g bovine serum albumin (Promega , Madison, Wis.), dan 1 U
dari Hotstar Taq polymerase (Qiagen). Setiap PCR dilakukan dengan total 2 l dari 10 5
pengenceran DNA genomik (500 ng l 1). Untuk amplifikasi bersarang dan seminested, kondisi
reaksi yang sama, dengan pengecualian bahwa 35 siklus yang digunakan, 1 l dari campuran
reaksi dari langkah amplifikasi primer digunakan sebagai template, dan albumin bovine serum
tidak termasuk dalam campuran reaksi . Semua produk PCR (10 l) dielektroforesis dalam Trisborat-EDTA-2% agarose gel (Invitrogen Corp, Burlington, Ontario, Canada), divisualisasikan
dengan noda-ing dengan ethidium bromida, dan dilihat di bawah sinar UV. Sebuah tangga 100bp (Pro-mega) digunakan untuk produk ukuran. The Tms digunakan dan estimasi ukuran produk
ditunjukkan

pada

Tabel

1.

Tujuan 2. (i) pembangunan pengendalian internal. Kontrol internal yang dirancang untuk
memperkuat kondisi PCR yang sama seperti yang dijelaskan untuk Campylobacter genus
spesifik primer set dibangun dengan menghapus sebuah fragmen dari C. jejuni (ATCC 49943)
gen 16S rRNA dengan strategi Denis et al. (10). penghapusan dicapai dengan PCR amplifikasi
gen

16S

rRNA

dengan

mutagenik

primer

C1228RIC

(5

-CATTGTAGCACGTGTGTCTCCCCAGGCGGTACACTTAA TG-3; urutan digarisbawahi

sesuai dengan C1228R). PCR amplifikasi template dengan primer C412F dan C1228RIC
menghasilkan produk 475-bp bukan sebuah produk 816-bp mengandung kedua C412F dan situs
primer C1228R. Produk 475-bp dikloning ke dalam vektor pGEM-T EASY (Promega) dan
berubah menjadi sel-sel Escherichia coli JM109. koloni berubah disaring untuk kehadiran
menyisipkan

oleh

PCR

amplifikasi

dengan

primer

C412F

VOL.

69,

2003

PCR

deteksi

Campylobacter

pada

TINJA

BOVINE

3439

dan C1228. Plasmid DNA diekstraksi dengan kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Plasmid-IC
yang linierisasi oleh pencernaan dengan enzim NcoI (Pro-mega). enzim telah dihapus oleh dua
ekstraksi dengan resin Strataclean (Stratagen) menurut protokol pabrik. Konsentrasi linierisasi
plasmid-IC telah disesuaikan untuk 700 eksemplar l 1 di 10 mM Tris-Cl (pH 8,5) buffer, dan
plasmid-IC

disimpan

pada

20

sampai

digunakan.

(Ii) Ekstraksi DNA dari kotoran sapi. Sebuah QIAamp DNA tinja minikit (Qiagen) digunakan
untuk mengekstrak DNA dari 200 5 mg kotoran sapi sesuai dengan protokol pabrik untuk isolasi
DNA dari kotoran untuk deteksi patogen. Secara singkat, prosedur yang terlibat lisis sel bakteri
dalam feces di ASL penyangga, adsorpsi kotoran ke InhibitEX reagen, dan pemurnian DNA pada
kolom berputar. Sebelum ekstraksi, pengendalian internal ditambahkan ke setiap sampel pada
tingkat 10 l per 200 mg kotoran. Diekstraksi DNA disimpan pada 20 C sampai diproses.
(Iii) Inokulasi. Tinja dikumpulkan dari sapi di Lethbridge, Alberta, Kanada. sampel kotoran yang
ditentukan untuk menjadi negatif untuk Campylobacter DNA atau yang menghasilkan amplikon
lemah dengan Campylobacter 16S genus spesifik rRNA primer gen yang dipilih. sampel tinja
yang bebas dari DNA ganjil-lobacter yang jarang diperoleh, dan situasi ini mengharuskan
penggunaan kotoran yang terkontaminasi, meskipun tinja mengandung sejumlah kecil
campylobacters. Subsamples sampel tinja disimpan pada 20 C sampai diperlukan. sampel tinja
yang

dicairkan

sekali.

Isolat yang digunakan untuk menyuntik kotoran termasuk C. coli ATCC 49941, C. janin ATCC
25936, C. hyointestinalis ATCC 35217, dan C. jejuni ATCC 49.943 (yaitu, pengobatan takson).
Semua bakteri ditumbuhkan selama 24 jam pada 37 C. Dalam replikasi 1, C. coli, C. janin, dan
C. jejuni ditumbuhkan pada brucella agar, sedangkan C. hyointestinalis ditumbuhkan pada
CCDA. Dalam ulangan 2 dan 3, baik C. janin dan C. hyointestinalis ditumbuhkan pada CCDA,
dan spesies lainnya ditanam di brucella agar. Dalam semua kasus, media produksi biomassa tidak
diubah

dengan

antibiotik.

Untuk

memperoleh biomassa, sel tergores dari media dan ditangguhkan di steril brucella kaldu (Difco).

Kekeruhan (A600) dari suspensi diatur ke 0,5 (ini mewakili kepadatan sel sekitar 2 109 CFU ml
1), dan enam 10-kali lipat pengenceran serial disusun brucella kaldu (yaitu, inokulum),
mewakili-ing rentang dari kepadatan sel sekitar 103-109 CFU ml 1 (yaitu, pengobatan
kepadatan). Untuk menghitung kepadatan sel di suspensi, pengenceran penyebaran jumlah piring
dibuat di kedua brucella agar (C. coli dan C. jejuni) atau CCDA (C. fetus dan C. hyointestinalis).
Tinja diinokulasi dengan masing-masing perlakuan takson pada tingkat 2 ml per 18 g (berat
basah) dari tinja untuk setiap kepadatan; steril brucella kaldu digunakan untuk kontrol. Segera
setelah penambahan inokulum, tinja yang dicampurkan dengan spatula logam. Penelitian
dilakukan pada tiga kesempatan terpisah (yaitu, ulangan). Untuk setiap ulangan, dua sampel
disiapkan

(misalnya,

subsamples).

(Iv) Deteksi spesies Campylobacter oleh dilusi plating. Untuk menghitung campylobacters dalam
tinja

diinokulasi

plating

mikrobiologi

konvensional,

2,5 g tinja ditempatkan di 22,5 ml phosphate-buffered saline (130 mM natrium klorida, 10 mM

bufer natrium fosfat [pH 7,2]) dalam tabung Falcon 50-ml (Diamed, Missassauga, Ontario,
Kanada), dan suspensi itu vortexed pada pengaturan maksimum selama 1 menit. Suspensi
diencerkan dalam pengenceran seri 10 kali lipat, dan 100 l tersebar di CCDA mengandung
selektif suplemen SR115E (Oxoid). Kultur diinkubasi microaerophilically pada 37 C seperti
dijelaskan di atas. Koloni dicacah di pengenceran menghasilkan 20-200 CFU setelah 48 jam, dan
CFUs per gram tinja (segar dan bobot kering) dihitung. Untuk menentukan bobot kering tinja,
dua aliquot tinja (sekitar 20 g masing-masing) dikeringkan pada 50 C selama 72 jam. Kami
mengamati tidak ada perbedaan kadar air (kadar bahan kering berkisar 19,1-19,8%) di antara
sampel tinja, sehingga CFUs disajikan per gram berat basah. Nilai rata-rata (CFU per gram)
untuk dua subsamples untuk setiap perlakuan pengobatan takson dan kepadatan digunakan untuk
menghitung

rata-rata

secara

keseluruhan

dan

SEM

untuk

tiga

ulangan.

(V) deteksi langsung dari spesies Campylobacter dengan PCR. DNA diekstraksi dari dua
subsamples untuk setiap perlakuan takson dan pengobatan kepadatan dengan minikit DNA tinja
seperti dijelaskan di atas. Amplifikasi C. coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni DNA
dicapai dengan primer PCR primer dan bersarang atau seminested tercantum dalam Tabel 1.
Dalam semua kasus, reaksi dan amplifikasi kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas

adalah digunakan, dengan pengecualian bahwa 2 l dari DNA tinja digunakan sebagai template.
Proporsi rata-rata sampel positif untuk dua subsamples untuk setiap perlakuan pengobatan takson
dan kepadatan digunakan untuk menghitung rata-rata secara keseluruhan dan SEM (n 3).
Tujuan 3. (i) Koleksi feses. Tinja yang aseptik dikumpulkan dari delapan sapi perah Holstein
pada tiga kesempatan terpisah (yaitu, ulangan) di ca. interval 2 minggu. Semua ternak yang
digunakan adalah sapi awal-laktasi yang diberi ransum campuran keseluruhan yang terdiri dari
barley, alfalfa, dan silase jagung. sampel tinja diperoleh fol-melenguh memberi makan pagi.
ARA. 2. Perbandingan 16S (29) dan 23S rDNA primer devel-oped dalam penelitian ini untuk
mendeteksi C. hyointestinalis. Lane 1, 100-bp penanda berat molekul (band gelap berada di 500
bp); jalur 2, 16S primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis HBF; jalur 3, 16S primer
dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis HBE; lane 4, 16S primer dengan C.
hyointestinalis subsp. hyointestinalis ATCC 35217; lane 5, 16S primer dengan C. hyointestinalis
subsp. lawsonii NCTC 12901; jalur 6, 23S primer dengan C. hyointestinalis subsp.
hyointestinalis HBF; lane 7, 23S primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis HBE;
jalur 8, 23S primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis ATCC 35217; jalur 9, 23S
primer dengan C. hyointestinalis subsp. lawsonii NCTC 12901. Sebuah amplikon tidak diamati
dalam

(Ii)

salah

Deteksi

satu

spesies

reaksi

kontrol

Campylobacter

negatif,

oleh

dan

plating.

perawatan

Pada

ini

setiap

telah

dihapus.

tanggal

koleksi,

2,5 g kotoran dari setiap sapi dihentikan di 22,5 ml phosphate-buffered saline oleh vortexing
seperti dijelaskan di atas, dan 100 l masing-masing suspensi tersebar di masing-masing empat
media yang tes. Media terdiri dari (i) ganjil-Line agar (Dalynn Biologicals) (28); (Ii) Karmali
agar (Oxoid) (22) dengan suplemen selektif CM935 (Oxoid); (Iii) CCDA dengan selektif
suplemen SR115E; dan (iv) Preston agar, terdiri dari CM689 campylobacter dasar (Oxoid), 50 ml
segaris darah kuda (SR48; Oxoid) liter 1, dan selektif suplemen SR117E (Oxoid). Culmembangun struktur ditumbuhkan microaerophilically pada 30, 35, dan 40 C seperti dijelaskan
di atas. Pada 48-dan 72-h interval, CFUs spesies Campylobacter dicacah berdasarkan morfologi

koloni dan penampilan mikroskopis. koloni sewenang-wenang dipilih dianggap campylobacters

dipindahkan ke media yang sama dari mana mereka telah diisolasi dan melesat untuk kemurnian.
Koloni dipilih berdasarkan penampilan koloni dan frekuensi kejadian. Semua strain disimpan di
brucella kaldu diubah dengan 30% gliserol pada 20 dan 80 C sampai diidentifikasi. Dalam
kebanyakan kasus, pengelompokan berdasarkan penampilan koloni dan morfologi bertekad
untuk menjadi monotaxic (berdasarkan identifikasi strain perwakilan), dan rata-rata CFU per
gram

dan

SEM

(n

3)

dihitung

untuk

setiap

takson.

(Iii) Identifikasi spesies Campylobacter. identifikasi presumtif dari iso-lates pulih dari kotoran
sapi dicapai dengan baik karakter fisiologis dan molekuler. Semua isolat mengalami koloni PCR
dengan Campy-lobacter genus spesifik, C. coli-C. jejuni, C. fetus-C. lanienae, dan C.
hyointestinalis set primer utama (Tabel 1). Jika diperlukan, Campylobacter isolat juga diuji
dengan primer untuk C. helveticus, C. lari, C. mucosalis, C. sputorum, dan C. upsaliensis (Tabel
2). Kami juga menguji set primer C. hyointestinalis dari Linton et al. (29) (Tabel 2) tapi
ditinggalkan primer ini ditetapkan untuk satu set dijelaskan pada Tabel 1. sama reaksi dan
amplifikasi kondisi seperti yang dijelaskan di atas digunakan, dengan pengecualian bahwa
template DNA terdiri dari 1 l dari suspensi yang mengandung 24- sel 48-h-lama isolat yang akan
diidentifikasi. Untuk setiap mengisolasi, sel-sel dari koloni tunggal yang seragam ditangguhkan
di 100 l steril brucella kaldu di 96-baik piring mikro dengan tusuk gigi steril atau kiat pipet.
kontrol positif terdiri dari sel-sel dari strain referensi, dan kontrol negatif terdiri dari brucella
kaldu

sendiri.

Kemampuan strain untuk menghasilkan katalase dan H2S, untuk mengurangi nitrat dan nitrit,
dan untuk menghidrolisis hippurate dan indoxyl asetat dan kepekaan mereka terhadap asam
nalidiksat (30 g; BBL) dan sefalotin (30 g; BBL) ditentukan seperti yang dijelaskan oleh Logan
et Al. (31). Selain itu, C. strain janin diuji untuk kemampuan mereka untuk tumbuh pada brucella
agar yang mengandung 1% glisin. Untuk strain Arcobacter, kemampuan untuk tumbuh di
oksigen

atmosfer,

pada

brucella

agar

yang

mengandung

3440 Inglis DAN KALISCHUK APPL. MENGEPUNG. Microbiol.

1%

glisin,

ARA. 3. Dampak konsentrasi DNA genom C. jejuni L102 terhadap ekspresi amplikon
pengendalian internal. Lane 1, 100-bp mo-lecular penanda berat (band gelap berada di 500 bp);
jalur 2, 10 1 pengenceran; jalur 3, 10 2 pengenceran; lane 4, 10 3 pengenceran; lane 5, 10 4
pengenceran; jalur 6, 10 5 pengenceran; jalur 7, ada template; jalur 8, tidak ada kontrol internal.

dan agar MacConkey ditentukan. Untuk C. jejuni dan C. lanienae, enam dan tujuh strain
sewenang-wenang

dipilih

menjadi

sasaran

tes

fisiologis,

respec-masing.

Untuk isolat dugaan diidentifikasi sebagai C. janin, C. lanienae, A. butzleri, atau A. skirrowii,
gen 16S rRNA lengkap atau sebagian dibariskan. Gen 16S rRNA diamplifikasi dengan PCR
dengan primer eubacterial UNI27F dan UNI1492R (Tabel 2). Untuk semua amplifikasi,
campuran PCR yang sama dan kondisi amplifikasi seperti yang dijelaskan di atas untuk koloni
PCR digunakan. Untuk mendapatkan urutan parsial untuk gen 16S rRNA, primer UNI338F dan
UNI1100R digunakan (Tabel 2) dengan siklus sequencing kit reaksi siap ABI PRISM Big Dye
Terminator (Applied Biosystems, Foster City, California.). Sebelum sequencing, kelebihan zat
warna telah dihapus dengan Qiagen DyeEx berputar kit. Urutan diperoleh dengan ABI PRISM
377 sequencer DNA otomatis. Contigs dibangun dengan menggunakan Staden (Medical
Research Council, Laboratorium Biologi Molekuler, Cambridge, Inggris), dan semua urutan
dibandingkan langsung dengan Na-nasional Pusat Informasi Bioteknologi (NCBI) GenBank
basis

data

nukleotida

nonredundan

dengan

menggunakan

BLASTN.

Urutan nukleotida untuk isolat dugaan diidentifikasi C. lanienae (L52) yang selaras dengan data
diambil dari GenBank dengan menggunakan multialign-ment Program Clustal W (40), dan
keberpihakan yang disempurnakan secara visual dengan menggunakan GeneDoc (www.psc.edu /
Biomed / genedoc). Urutan (GenBank nomor aksesi) untuk C. concisus (L04322), C. curvus
(L04313), C. janin subsp. janin (M65012), C. janin subsp. venerealis (M65011), C. gracilis
(L04320), C. hyointes-tinalis subsp. hyointestinalis (AF097681, AF097689 [type], dan
AF097691), C. hyointestinalis (AF219235 dan M65010), C. hyointestinalis subsp. lawso-nii
(AF097683 dan AF097685 [type]), C. lanienae (AB076675, AB076677, AF043423, dan

AF043425 [type]), C. mucosalis (L06978), C. rektus (L04317), C. sputorum (L04319), dan C.

jejuni

subsp.

jejuni

(L04315)

dimasukkan

dalam

analisis.

Urutan Data dianalisis dengan menggunakan program yang ada di program PHYLIP (13).
Perkiraan filogenetik didasarkan pada metode untuk menentukan jarak tetangga-bergabung,
kekikiran maksimum, dan kemungkinan maksimum. Di-Vergence (atau jarak) untuk setiap
pasangan urutan dihitung dengan menggunakan DNA-DIST dengan Kimura model dua
parameter. Program TETANGGA digunakan untuk memperkirakan filogeni dari matriks jarak.
DNAPARS dieksekusi untuk melakukan analisis maksimum-kekikiran, dan DNAML digunakan
untuk analisis kemungkinan maksimum. Dukungan untuk cabang internal dalam pohon re-timbul
semata-mata diperoleh dengan analisis bootstrap. Sebanyak 1.000 bootstrap ulangan untuk 16S
DNA ribosom (rDNA) Data yang dihasilkan dengan menggunakan SEQBOOT, mayoritas-aturan
pohon konsensus dibangun dengan menggunakan program CONSENSE, dan pohon-pohon
divisualisasikan dengan menggunakan TreeView (http: //taxonomy.zoology .gla.ac.uk / batang /
rod.html).
(Iv) deteksi langsung dari spesies Campylobacter dengan PCR. Untuk setiap sapi pada setiap
kesempatan, sebuah aliquot tinja diinokulasi dengan pengendalian internal, DNA diekstraksi
dengan tinja minikit DNA, campuran PCR dan kondisi amplifikasi didirikan, dan produk PCR
divisualisasikan seperti dijelaskan di atas. Karena isolasi sering C. lanienae pada Karmali agar,
primer berdasarkan gen 16S rRNA dikembangkan untuk takson ini (Tabel 1) dan digunakan
ARA. 4. Multiplex PCR untuk mendeteksi spesies Campylobacter dalam kotoran sapi. Lane 1,
100-bp penanda berat molekul (band gelap berada di 500 bp); jalur 2, DNA dari kotoran tanpa
inokulasi diperkuat dengan Campylobacter genus spesifik primer set; jalur 3, DNA dari uninoculated kotoran diperkuat dengan Campylobacter genus spesifik primer set (perhatikan
amplikon genus lemah dan amplikon pengendalian internal pada 465 bp); lane 4, DNA dari
kotoran tanpa inokulasi diperkuat dengan C. jejuni-C. coli multipleks bersarang set primer
(perhatikan amplikon C. jejuni pada 413 bp); lane 5, DNA dari kotoran tanpa inokulasi diperkuat
dengan

C.

janin-C.