Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
MIKROBIOLOGI DASAR
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2008
KATA PENGANTAR
Tim Penyusun
TATA TERTIB PRAKTIKUM
Alat-alat elektrik
Mikroskop cahaya
Mikroskop stereo
Autoklaf elektrik
Incubator
Hot plate & stirrer
Colony counter
Biological Safety Cabinet (BSC)
Mikropipet
Bagian-bagian Mikroskop:
1. Eyepiece / oculars (lensa okuler)
Untuk memperbesar bayangan yang
dibentuk lensa objektif
2. Revolving nosepiece (pemutar lensa
objektif)
Untuk memutar objektif sehingga
mengubah perbesaran
3. Observation tube (tabung pengamatan
/ tabung okuler)
4. Stage (meja benda)
Spesimen diletakkan di sini
5. Condenser (condenser)
Untuk mengumpulkan cahaya supaya
tertuju ke lensa objektif
6. Objective lense (lensa objektif)
Memperbesar spesimen
7. Brightness adjustment knob (pengatur
kekuatan lampu)
Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu
8. Main switch (tombol on-off)
9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter)
Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar)
11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal)
Untuk menaikkan atau menurunkan object glass
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal)
Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)
Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus)
Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat
17. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser)
Untuk menaik-turunkan kondenser
Prosedur Operasi
1. Menyalakan lampu
a. tekan tombol on (8)
b. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan spesimen pada meja benda
a. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Jika meja
benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15)
b.Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan diperkirakan
memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal
(13) dan (14)
3. Memfokuskan
a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu
putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas
untuk mencari fokus
b.Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan, maka putar (2) pada
perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. kemudian
putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan fokusnya
c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi
Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa
objektif jika okus telah didapatkan
Perbesaran
4x 10x 40x 60x
objektif
Jarak A
29 6,3 0,53 0,29
(mm)
Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu, misal 40x, dan
ingin memutar objektif ke perbesaran 100x, maka meja benda tidak
perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan
menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil
antara cover glass dengan lensa objektif (lihat tabel diatas).
4. Tambahan
a. Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser, hal ini
akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar
yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata
b. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh
bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri
c. Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan
mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh)
Perbesaran total
Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran
lensa okuler dengan lensa objektif. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x
1 2 1 2
Prosedur operasi
1. Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5), jepit jika perlu
2. Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control
Knob (3) kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4)
3. Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar, putar Zoom Control Knob
(3) ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnya
Mikroskop ini memiliki pilihan perbesaran:
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang
digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan
yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC
(250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap
inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan
biasanya 15 menit untuk 121oC.
Cara Penggunaan :
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas
tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan
karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka
tutup harus dikendorkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap
yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih
dahulu.
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu
121oC.
5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf
dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup
(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’ dimulai
sejak tekanan mencapai 2 atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen
turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure
gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan
keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.
Inkubator (Incubator)
Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau
memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini
dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu.
Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042
misalnya adalah 10-70oC..
Hot plate stirrer dan Stirre bar
Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer)
berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan
pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini
dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses
homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet
Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS®
misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan
kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat
dipanaskan sampai 425oC.
Colony counter
Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan
koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena
adanya kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi
dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk
pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah
koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis
yang dapat di-reset.
Mikropipet tip
Cara Penggunaan :
1. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk
memastikan lancarnya mikropipet.
2. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet.
3. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke
dalam lagi.
4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm.
5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob
maka cairan akan masuk ke tip.
6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.
7. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal
mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip.
8. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip
akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan yang
berfungsi mendorong tip keluar.
Batang L (L Rod)
Batang L bermanfaat untuk
menyebarkan cairan di permukaan
agar supaya bakteri yang tersuspensi
dalam cairan tersebut tersebar
merata. Alat ini juga disebut
spreader.
Beaker Glass
Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Di
dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media media,
menampung akuades dll..
Pinset
Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk
mengambil benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan
cakram antibiotik.
pH Indikator Universal
berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal
ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada
media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH
indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna
kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan.
Media pertumbuhan :
a. Pengertian dan fungsi
b. Bahan-bahan media pertumbuhan
b.1 Bahan dasar
b.2 Nutrisi atau zat makanan
b.3 Bahan tambahan
b.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
c. Macam-macam media pertumbuhan
c.1 Berdasarkan sifat fisik
c.2 Berdasarkan komposisi
c.3 Berdasarkan tujuan
d. Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth
e. Pembuatan Potato Dextrose Agar
Sterilisasi :
1. Pengertian sterilisasi
2. Macam-macam sterilisasi
a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)
b. Sterilisasi secara fisik
Pemanasan
- Dengan api langsung
- Panas kering
- Uap air panas
- Uap air panas bertekanan
Penyinaran UV
c. Sterilisasi secara kimia dengan larutan disinfektan
3. Prosedur/Teknik aseptis
a. Mensterilkan meja kerja
b. Memindahkan biakan (streak)
c. Menuang media
d. Pipetting
4. Prinsip cara kerja autoklaf
5. Sterilisasi dengan cara penyaringan
6. Tyndalisasi
7. Sterilisasi dengan udara panas
8. Prinsip kerja Biological Safety Cabinet
Pengertian
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda
dari semua bentuk kehidupan.
Macam-macam sterilisasi
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik,
fisik dan kimiawi.
1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori
sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada
saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas,
misal nya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara
langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.
b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas
kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer,
tabung reaksi dll.
c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang
mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak
terjadi dehidrasi.
d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf
Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya
untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety
Cabinet dengan disinari lampu UV
3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara
lain alkohol.
Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik
aseptis
Isolasi Mikroorganisme:
a. Pengertian
b. Teknik Pengambilan sample
c. Isolasi dengan cara pengenceran
1) Teknik preparasi suspensi
Swab
Rinse
Maserasi
2) Teknik pengenceran bertingkat
3) Teknik penanaman
Dari suspensi (spread dan pour plate)
Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation)
d. Prosedur isolasi bakteri dari sampel
e. Prosedur isolasi jamur dari sampel
Pengertian
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi
terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri
inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat
dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
b.2 Goresan T
Cara kerja :
Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag
pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan
yang sempurna
Lakukan hal yang sama pada daerah 3
B.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant)
Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu
dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung
banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari
goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah
menjadi koloni tunggal.
Faktor lingkungan :
a. pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
b. pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme
c. pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme
d. pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni
mikroorganisme
a. Bakteri
a.1 mengamati morfologi koloni bakteri
a.1.1 pada media cawan
a.1.2 pada agar miring
a.1.3 pada agar tegak
a.1.4 pada media cair
a.2 mengamati morfologi sel bakteri
a.2.1 dengan pewarnaan sederhana
a.2.2 dengan pewarnaan negatif
a.2.3 dengan pewarnaan gram
a.2.4 dengan pewarnaan endospora
a.3 mengamati motilitas bakteri
a.3.1 pengamatan langsung
a.3.2 pengamatan tidak langsung
b. Yeast
b.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan)
b.2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana)
c. Kapang
c.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan)
c.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slide culture)
Bakteri
A. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri
Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu
jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan
kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media
untuk dikenali ciri koloninya.
Cara Kerja :
Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran
Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak
lurus
Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation
Tumbuhkan biakan pada media NB
Small (kecil)
Moderate (sedang)
Large (besar)
Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen
intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang
dapat terlarut dalam media
Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati
koloni.
Opaque (tidak dapat ditembus cahaya), Translucent (dapat ditembus cahaya
sebagian), Transparant (bening)
Irregular Raised
Spindle Convex
Filamentous
Umbonate
Rhizoid
Entire
Lobate
Undulate
Serrate
Felamentous
Curled
3 4
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut
merupakan berbagai bentuk sel bakteri
Bentuk Contoh jenis
Coccus (sphere) Neisseria, Veillonella, Enterococcus
Coccobacilli Moraxella, Acinetobacter
Bacilli, (rod), rounded ends Escherichia, Lactobacilus, clostridium
Vibrio (curved) Vibrio, Bdellovibrio, Ancylobacter dll
Bacilli (Rod), blunt end Bacillus
Helical (spirillum) Spirochaeta, Spirillum, campylobacter
Diplococcus Neisseria, Moraxela
Streptococcus Streptococcus
Streptobacillus Bacillus, Mycobacterium
Staphylococcus Staphylococcus
Tetrad (Gaffkya) Deinococci, pediococcus, micrococcus
Sarcina (cuboid packets) Sarcina
A.3. Pewarnaan Gram
Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua
yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding
sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.Berikut merupakan prosedur
pewarnaan Gram:
Cara Kerja : Dampak/Hasil
1.Buat preparat ulas (smear) yang Sel bakteri tertempel pada permukaan
telah difiksasi dari bakteri gram kaca (object glas)
positif misal Bacillus subtilis dan
gram negatif misal Escherichia coli
2.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh
pewarna utama pada kedua preparat , permukaan sel bakteri gram positif dan
usahakan semua ulasan terwarnai dan negatif
tunggu selama ± 1 menit
3.Cuci dengan akuades mengalir
4.Teteskan mordant (lugol,s iodine) Adanya lugol’s iodine menyebabkan
lalu tunggu ± 1 menit adanya ikatan CV dengan iodine yang
akan meningkatkan afinitas pengikatan
zat warna oleh bakteri. Pada gram
positif dapat terbentuk CV iodin-
ribonukleat pada dinding sel
5.Cuci dengan akuades mengalir
6.Beri larutan pemucat (ethanol 96%/ Penetesan etanol absolut menyebabkan
aseton) setetes demi setetes hingga terbentuknya pori-pori pada gram
etanol yang jatuh berwarna jernih. negatif yang memiliki banyak lapisn
Jangan sampai terlalu banyak lemak (lipid larut dalam etanol),
(overdecolorize) sehingga komplek CV-iodine akan
lepas dari permukaan sel gram negatif,
sedangkan pada gram positif CV-iodine
tetap menempel di dinding sel, sel
gram negatif menjadi bening
7.Cuci dengan akuades mengalir
8.Teteskan counterstain (safranin) dan Safranin akan mewarnai sel gram
tunggu selama ± 45 detik negatif menjadi berwarna merah,
sedangkan gram positif tidak
terpengaruh. Counterstain hanya
berfungsi sebagai pengontras saja
9.Cuci dengan akuades mengalir
10.Keringkan preparat dengan kertas
tissue yang ditempelkan di sisi ulasan
(jangan sampai merusak ulasan) lalu
biarkan mengering di udara.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb:
Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang
mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai
berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif
tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam
penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine
secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak
lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel
menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan
menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan
sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang
memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan
Arthrobacter.
Penambahan safranin
C. Mengamati motilitas
C.1 Pengamatan Langsung
Cara Kerja :
Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.coli ke object glass
(sebaiknya dari biakan cair). Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan
jarum inokulum lalu ditambah akuades satu tetes, ratakan.
Tutup dengan cover glass
Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak. Bakteri akan
tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati jangan
salah membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau
bergerak terkena aliran air.
Yeast / Khamir
A. Mengamati morfologi koloni yeast
Tanam biakan yeast (dapat berupa
Sacharomyces cereviceae atau Candida
albicans) pada PDA dengan cara streak
quadrant.
Inkubasi selama 2x24 jam.
Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciri-ciri morfologi koloni
hampir sama dengan ciri morfologi bakteri.
Kapang / Jamur
Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus
berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala
(myselium). Hifa dapat berekat (septat) dengan inti
tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat).
Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti
benang (filamentous) yang pertumbuhannya
membentuk lingkaran. Morfologi koloninya dapat
dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada
beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur,
seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus
mycoides. Koloni kapang memiliki keragaman warna
yang muncul dari sporanya.
1 skala okuler = Jarak yang diketahui antara 2 garis pada mik. Objektif
(O.D = Okuler Division) Jarak skala pada mikrometer okuler
= 10 X Skala Ob (µm)
Skala Ok
Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer
objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer
objektif maka beberapa 1 skala okuler.
Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler
pada tabung lensa okuler.
Tentukan perbesaran yang digunakan, (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar
perbesaran dari skala mikrometer objektif.
Setelah fokus didapat, kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer
objektif dan okuler.
Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang
berhimpit lagi.
Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.
- Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan
angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial),
missal 2,3 X 104, bukan 2,34 X 104. pembulatan keatas dilakukan pada
angka seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima, missal 2,35 X 104
menjadi 2,4 X 104, atau 2,34 X 104 menjadi 2,3 X 104.
- Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran terendah yang dilaporkan.
-
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
15 1 0 1,5X103 Semua <30
- Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran tertinggi yang dilaporkan.
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
TNTC TNTC 358 3,6X106 Pngc.trtgg(10-4)
TNTC 325 18 3,3X105 Pngc.trtgg(10-3)
- Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang
berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni
pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2, maka jumlah yang dilaporkan
adalah nilai rata-rata. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan
terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan
pengenceran terendah.
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
4
295 40 5 3,5X10 40.000/29.500<2
140 35 1 1,4X104 35.000/14.000>2
- Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo), maka jumlah
angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masing-
masing setelah diperhitungkan.
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
175 15 5 (17.500+20.800)/2 15 dan 20 <30
208 20 2 = 1,9X104
135 45 5 (13.500+16.500)/2 45.000/13.500>2
45.000/10.500>2
4
165 45 8 = 1,5X10 Dilap. Pengc.
terendah
275 35 5 (27.500/35.000)/2=a 27.500/35.000<2
28.500/40.000<2
(28.500+40.000)/2=b
285 40 7 Dilap. Hasil
(a+b)/2 = 3,3X104
rata-rata
25 dan 28 <30
(29.000+30.000)/2 =
290 25 5 meskipun
3X104
305>300
305 28 0
Bagan alur persyaratan SPC
a.1.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count.
Misal :
didapatkan kombinasi jumlah tabung positif :
321 maka jumlah bakteri coliform adalah
150 sel/100 ml.
B. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)
Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu
dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat
yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah
cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu
sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu.
Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak
besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu
kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak
besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1
mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut
sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.
Luas kotak sedang :
=pxl
= 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2 jadi misalnya diperoleh:
Volume kotak sedang : 20 sel dalam satu kotak sedang
= 0,04 mm2 x 0,1 mm maka jumlah sel keseluruhan :
= 0,004 mm3 = 20 x (1/4) x 106
Karena 1 ml = 1cm2 = 5 x 106 sel/ml
Maka :
= 0,004 mm3
= 0,000004 cm3
= 4x10-6 ml
Sel/ml :
= jumlah sel/4x10-6 ml
= (jumlah sel/4) x 106
= jumlah sel x (¼) x 106
= jumlah sel x 2,5 x 105
Kotak sedang :
Konsentrasi
Waktu terpapar
Jenis mikroba
Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat mikroba hidup
Beberapa jenis disinfektan diantaranya adalah:
Jenis Keterangan
Senyawa fenol : Merusak membran sel
Fenol Mendenaturasi protein
Cresol Konsentrasi kerja : 2-5%
Hexaclhorophene
Recorcinol
Thymol
Alkohol : Pelarut lemak
Ethyl Denaturasi dan koagulasi protein
Isopropil Konsentrasi kerja : 50-75%
Senyawa halogen : Agen oksidasi
Senyawa chlorin : Presipitasi protein
Sodium hipochlorite Klorin bereaksi dengan air membentuk
Chloramine asam hipoklorit yang bersifat bakterisidal
Senyawa iodine :
Povidone-iodine
(betadine)
Logam berat : Bereaksi dengan gugus SH (sufihidril) pada
Senyawa Hg enzim yang menyebabkan denaturasi.
Senyawa Zn
Senyawa Cu dll.
Agen aktif permukaan : Menciptakan tegangan permukaan yang
Sabun rendah
Detergen Merusak membran sel
emulsifier Memindahkan sel secara mekanis
Senyawa kationik : Tegangan permukaan yang rendah
Senyawa amonium
kuartener
benzalconiumclhoride
Senyawa anionik : Daya kerja sama dengan senyawa aktif
Sodium Tertradecyl permukaan
Sulphate
Asam (H+) Merusak dinding sel dan membran sel
Basa (OH-) Koagulasi protein
Pewarna : Memiliki avinitas terhadap asam nukleat
Crystal Violet
Cara kerja :
Inokulasikan E. coli dan Bacillus sp. Pada NA cawan sengan streak kontinyu.
Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan (alkohol 70%,
LysoI 5%, betadin, dan hipoklorit 5%). Setelah diangkat, sisa tetes larutan yang
berlebihan pada kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena
dikhawatirkan larutan akan meluas di permukaan agar jika larutan terlalu
banyak.
Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. Tekan dengan
pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar.
Inkubasi selama 48 jam pada 37 0C.
Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya, bandingkan daya kerja
berbagai disinfektan.
Pengujian pengaruh daya oligodinamik
Logam-logam berat seperti Hg, Cu, Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel
meskipun hanya dalam kadar rendah. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut
bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan
denaturasi. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah
disebut daya oligodinamik.
Cara Kerja :
Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan NA dengan streak kontinyu
Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset
Inkubasi 370C selama 48 jam
Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang
jernih atau tidak ada pertumbuhan
Cara menginterpretasikan :
Ukur diameter zona hambat (zona jernih)
Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk
Eryhtromycin.
Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik
Eryhtromycin.
Resistent : tahan
Intermediate : medium
Susceptible : peka
AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME
Uji Amilolitik
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas
polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik.
Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis
menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa.
Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk
ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan
bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media.
Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati
digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan
bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada
media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada
amilum yang berbentuk spiral.
Cara Kerja :
Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.coli dan Bacillus
sp. secara streak.
Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC
Setelah selesai inkubasi, tetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga
seluruh permukaan media terkena.
Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan
hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.
Uji Lipolitik
Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah
mikroorganisma. Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim
lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam
lemak.
Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase
diantaranya adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar, Rodhamine Agar
dan Spirit Blue Agar. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator
yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis
lemak.
Cara Kerja :
Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada media Tributyrin Agar dengan
indikator neutral red
Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan
reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.
Uji proteolitik
Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam
bentuk kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan
monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis
Cara Kerja :
Inokulasikan Bacillus sp. Dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA)
Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling
koloni.
Uji Oksidase
Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama
respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom
oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif
anaerob, dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai
akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi.
Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi
yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini
merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi
oksidatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylenediamine
dihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga
akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda
(warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri
uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa
uji yang dilakukan negatif.
Cara Kerja :
Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan
diinokulasikan pada Object glass.
Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas.
Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi
Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak
terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru
muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi.
Uji Katalase
Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme
menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang
sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada
mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif
aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik.
= slant dan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna tidak
terjadi fermentasi karbohidrat, sedangkan pepton yang ada digunakan untuk
sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan
pH karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping metabolisme
protein. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi
aerobik peptone, sedangkan warna merah pekat tampak di semua media
maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun
anaerob.
= slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa
produksi gas hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi
laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi
glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat
langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Media
mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa
dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara
cepat menjadi basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning
tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih
untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.
= slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas telah terjadi
fermentasi glukosa, laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa
memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk
substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang
ditandai warna kuning setelah 24 jam.