Spectrum masa (MS) dan resonansi magnetik nuklir (NMR)

diterapkan untuk makromolekul biologis

Hadiah Nobel Kimia untuk 2002 adalah untuk dibagi antara ilmuwan yang
bekerja pada dua metode yang sangat penting dari analisis kimia diterapkan
untuk makromolekul biologis: spektrometri massa (MS) dan resonansi magnetik
nuklir (NMR). Nobel John B. Fenn, Koichi Tanaka (MS) dan Kurt Wthrich (NMR)
telah merintis keberhasilan penerapan teknik mereka untuk makromolekul
biologis.
Makromolekul biologis adalah aktor utama dalam susunan kehidupan
apakah dinyatakan dalam makmur keragaman atau pada penyakit yang
mengancam. Untuk memahami biologi dan kedokteran pada tingkat molekuler di
mana identitas, karakteristik fungsional, arsitektur struktural dan interaksi
spesifik
biomolekul
merupakan
dasar
dari
kehidupan,
kita
perlu
memvisualisasikan
aktivitas dan interaksi makromolekul besar seperti protein. Untuk belajar, atau
menganalisis, molekul protein, prinsip pemisahan dan penentuan karakteristik
masing-masing
harus
dikembangkan.
Dua
teknik kimia yang paling penting yang digunakan saat ini untuk analisis
biomolekul yang spektrometri massa (MS) dan resonansi magnetik nuklir (NMR),
mata pelajaran tahun ini Hadiah Nobel penghargaan.
Spectrum masa (MS)
Kemampuan untuk molekul yang terpisah berdasarkan ukuran yang
berbeda dan beban pertama kali dijelaskan pada tahun 1912 oleh JJ Thompson
(pemenang Hadiah Nobel pada tahun 1906 untuk investigasi dari konduksi listrik
oleh gas) dan dinyatakan sebagai rasio massa / muatan dengan unit Thompson
(Th). Meskipun tahun pembangunan MS intens, tujuan menganalisis
makromolekul besar tetap sulit dipahami selama lebih dari 70 tahun. Ia segera
mengakui, bagaimanapun, bahwa proses akan terdiri dari persiapan kimia
molekul bermuatan dalam fase gas diikuti oleh pemisahan fisik ion dalam ruang
hampa. Untuk biomolekul tantangannya adalah untuk menemukan prosedur
yang layak untuk persiapan kimia sampel. Proses-proses yang akhirnya mampu
membuat biomolekul meninggalkan fase berair dan melayang-layang di fase gas
penggunaan terbuat dari kombinasi ingeneous pilihan bahan, energi, dimensi,
struktur dan lingkungan kimia.
Drive untuk melengkapi Bioscience dengan alat baru untuk mempelajari
identitas dan struktur, serta karakteristik fungsional, biomolekul besar sangat
meresap pengembangan teknik spektrometri massa dan metode. Sejarah
memainkan peran di sini, seperti dalam kebanyakan ambisi lintas disiplin, dan
ilmuwan terhambat oleh gagasan bahwa orang selalu harus volatilise molekul
pertama dan kemudian mengionisasi mereka. Selain itu, energi yang diperlukan
untuk melepaskan molekul itu biasa dipasok sebagai panas, dan molekul yang
mengandung "kelompok polar" perlu dimodifikasi secara kimia untuk menahan
dan memungkinkan panas-penguapan. Perkembangan digantikan satu sama lain,

tetapi setiap langkah marjinal dalam kaitannya dengan langkah raksasa

diperlukan untuk dapat menganalisis biomolekul besar utuh.
Salah satu terobosan besar awal, dijelaskan oleh M.S.B. Munson dan FH
Lapangan pada tahun 1966 [1], adalah penggunaan ionisasi kimia (CI), yang
untuk pertama kalinya memungkinkan untuk mengionisasi biomolekul thermolabil. Dalam CI, ion gas reagen berlimpah yang pertama kali dibentuk oleh debit
listrik dari gas pereaksi, dan ion pereaksi kemudian pada gilirannya mengionisasi
molekul diuapkan dari bunga. Desorpsi Plasma (PD), diperkenalkan pada tahun
1976 [2], menggunakan ion berenergi tinggi untuk desorb dan mengionisasi
molekul. Teknik ini mencapai beberapa keberhasilan tetapi tidak pernah terbukti
dapat diandalkan untuk massa molekul lebih besar dari 10 kiloDalton (kDa). Hal
ini dapat dibandingkan dengan berat molekul protein yang umum, mulai dari
beberapa ribu Dalton (Da) untuk hormon insulin (5734 Da), untuk seratus ribu Da
protein umum, dan sampai setidaknya 5 juta Da untuk enzim besar kompleks.
Diketahui bahwa pemboman ion akan menghancurkan biomolekul kecil.
Batu A disahkan ketika M. Barber et al. [3] menggambarkan keberhasilan
penggunaan lingkungan perlindungan kimia non-volatile sebelah molekul untuk
mengaktifkan senyawa polar dan termal labil bertahan proses ionisasi. Karya ini
menunjukkan bahwa percepatan atom (dan kemudian juga ion) dari misalnya
argon, cesium atau xenon dapat digunakan untuk penentuan massa biomolekul
kecil (yaitu mol. wt. <10 kDa) yang dikombinasikan dengan fragmentasi on-line
untuk penentuan struktur. Teknik ini, disebut pemboman atom cepat (FAB), dan
terkait erat matriks metode cair spektrometri massa ion sekunder (LSIMS) tidak
memecahkan masalah mencapai massa yang lebih tinggi tetapi memiliki
dampak yang besar pada harapan kesuksesan masa depan.

Tantangan di tahun 1980 adalah bagaimana menemukan cara untuk menganalisis

senyawa dengan berat molekul tinggi dengan spektrometri massa dan membuat spektrometri
massa menjadi detektor yang kuat untuk teknik pemisahan cair. Pengenalan electrospray (ES)
dan desorpsi soft laser (SLD) metode dapat memenuhi kedua kebutuhan. Ledakan yang
dihasilkan dari aplikasi dapat examplified oleh demonstrasi bahwa teknik ES begitu ringan
bahwa bahan virus dapat bertahan hidup setelah proses [4] ionisasi electrospray (ESI).
Metode SLD memungkinkan akses mudah ke bermuatan tunggal ionisasi biomolekul utuh
dalam matriks kompleks. Karena secara signifikan meningkatkan sensitivitas dan kemudahan
penggunaan dibandingkan dengan desorpsi plasma konvensional, keuntungan yang cepat
dalam popularitas ditunggu metode ini.
electrospray ionisasi
Percobaan awal oleh fisikawan John Zeleny pada tahun 1917 didahului
deskripsi pertama oleh Malcolm Dole tahun 1968 [5] dari prinsip electrospray,
termasuk model biaya residu (CRM) yang telah bertahan sebagai penjelasan
utama untuk proses ESI misterius. Menurut model ini, tetesan dibebankan
menguap ke titik di mana jumlah biaya elektrostatik menjijikkan di permukaan
menjadi relatif begitu besar untuk ukuran tetesan bahwa ledakan ("Rayleigh
ledakan") terjadi. Ini menghasilkan sejumlah tetesan kecil yang juga memiliki

permukaan yang mengandung biaya elektrostatik. Dalam percobaan awal Dole

digunakan gas inert untuk memfasilitasi yang desolvation dalam analisis
spektrometri massa relatif tinggi polystyrene berat molekul.
Terobosan ini didefinisikan dengan baik dari ESI datang pada tahun 1988
di sebuah simposium di San Francisco, ketika John Fenn disajikan identifikasi
polipeptida dan protein berat molekul 40 kDa [6]. Fenn menunjukkan bahwa
akurasi berat molekul dari 0,01% dapat diperoleh dengan menerapkan metode
sinyal-averaging dengan beberapa ion yang terbentuk dalam proses ESI. Temuan
itu berdasarkan perkembangan yang dimulai pada tahun 1984 [7] di
laboratorium Fenn ini di Yale, ketika electrospray dan spektrometri massa
berhasil dikombinasikan untuk pertama kalinya. Fenn menggunakan
pengetahuannya ekspansi bebas jet untuk meningkatkan metode Dole, dengan
counterflow gas untuk desolvation, menghilangkan re-solvasi ion makromolekul
yang terbentuk. Penemuan ini diikuti oleh hasil dari kelompok penelitian Rusia
(Aleksandrov dkk.) [8].
Proses electrospray diatur oleh sejumlah besar parameter kimia dan fisik
yang bersama-sama menentukan kualitas proses. Its awal dan akhir dapat
didefinisikan oleh rangkaian listrik yang menggerakkan semprot dari tetesan
cairan bermuatan (Gambar 1). Dalam proses ini biomolekul dimulai sebagai
sebuah entitas atau kompleks, biasanya diisi dan dilarutkan dalam lingkungan
yang kaya air. Pada akhir proses yang biomolekul yang sama diwakili dan
dipanen melalui orifice dari analisa massa sebagai rangkaian ion multicharged
'telanjang'. Dalam ruang hampa, ion biomolekuler kemudian secara selektif
dianalisis menurut rasio massa / muatan mereka.

Tetesan awal biasanya memiliki muatan positif. Makromolekul terprotonasi

atau terdeprotonasinya dibebaskan sebagai konten yang kaya air dari tetesan

menguap. Dalam ion makromolekul telanjang memasuki analyzer massa muatan

ini biasanya dimanifestasikan sebagai negara variabel protonasi di situs protondiakses. Hasil proses ion dengan berbagai biaya dalam kisaran 2 hingga 40 atau
bahkan lebih tinggi. Dalam analisis yang mengamati seri reguler puncak
mencerminkan rasio massa / muatan. Hal ini menambah kompleksitas
interpretasi spektrum massa dan awalnya bingung ilmuwan ketika hasil pertama
disajikan. Fenn menyadari, bagaimanapun, bahwa kompleksitas ini sangat
menambah informasi dan dapat digunakan untuk keuntungan untuk
meningkatkan
keakuratan penentuan berat molekul. Rahasia terungkap dalam teori biaya
beberapa yang dijelaskan oleh Fenn pada tahun 1987 [9]. Teori ini menunjukkan
bahwa negara-negara berbeda muatan bisa ditafsirkan sebagai pengukuran
independen berat molekul dan metode rata-rata berdasarkan solusi dari
persamaan simultan dapat memberikan estimasi molecularweight akurat untuk
molekul besar.
Dalam Gambar 1, protein berat molekul 47.342 Da dianalisis dengan ESI.
Hasil Proses di lebih dari 50 puncak dari pola biaya yang sesuai. Dihasilkan rasio
massa / muatan sama 1-2000 Th dan dengan demikian dapat dengan mudah
dianalisa dalam analisa massa. Pola biaya hanya dapat deconvoluted dan massa
protein bermuatan bertekad untuk akurasi jauh lebih tinggi daripada jika
interpretasi data didasarkan pada ion tunggal.
Itu awal dipahami bahwa sensitivitas proses itu tidak meningkat aliran
massa yang tinggi. Dari arus mikroliter / menit, peningkatan sensitivitas telah
divisualisasikan
dengan
menurunkan
aliran ke nanolitre / arus menit [10-11]. Sensitifitas tingkat attomole biasanya
dicapai dalam aplikasi aliran rendah ini. Keuntungan selanjutnya adalah bahwa
dengan pilihan yang tepat dari kondisi, ESI dapat menjadi yang paling invasif
dari semua metode ionisasi. Bahkan memungkinkan studi kompleks molekul
yang hanya memiliki interaksi non-kovalen lemah, seperti protein-protein, enzimsubstrat atau kompleks protein-ligan.
Laser desorpsi lunak (SLD)
Selama tahun 1980 beberapa kelompok mencoba untuk memecahkan
masalah penguapan / ionisasi spektrometer massa menggunakan sinar laser
sebagai sumber energi. Dengan berfokus sinar ke tempat kecil dari sampel cair
atau padat, satu berharap untuk dapat menguap sebagian kecil dari sampel dan
masih menghindari degradasi kimia. V.S. Letokhov di Moskow menunjukkan
bahwa metode ini bisa bekerja untuk molekul kecil tapi polar, seperti asam
amino. Pendekatan ini dikembangkan lebih lanjut oleh M. Karas dan F. Hillenkamp
di Mnster. Pada tahun 1985, para ilmuwan ini menunjukkan bahwa matriks
menyerap dapat digunakan untuk volatilise molekul analit kecil, tetapi tidak
berhasil awal untuk molekul besar.
Sebuah terobosan untuk metode desorpsi laser aplikasi untuk biomolekul
besar dilaporkan di sebuah simposium di Osaka pada tahun 1987, ketika Koichi
Tanaka di Shimadzu Corp di Kyoto disajikan hasil analisis spektrometri massa

protein utuh. Dalam dua publikasi dan kuliah di 1987-1988, Tanaka disajikan
ionisasi protein seperti chymotrypsinogen (25.717 Da), Carboxypeptidase-A
(34.472 Da) dan sitokrom c (12.384 Da) [12-14].

Rantai yang hilang untuk membuat pekerjaan Laser desorpsi untuk

makromolekul besar adalah kombinasi yang tepat dari energi laser dan panjang
gelombang dengan absorbansi dan perpindahan panas sifat dari / matriks fisik
kimia ditambah struktur molekul analit dalam matriks ini. Tanaka menunjukkan
bahwa ion makromolekul gas dapat dibentuk dengan menggunakan energi
rendah (nitrogen) laser, sebuah fakta yang tidak diharapkan pada saat itu tapi
dengan cepat setelah itu mengilhami para ilmuwan laser yang desorpsi. Prinsip
SLD diilustrasikan pada Gambar 2, menunjukkan sinyal-sinyal dari singly- dan ion
molekul bermuatan ganda dan protein klaster-ion dengan muatan tunggal.
Sebuah sinar laser nitrogen memiliki panjang gelombang 330 nm, yang
tidak diserap oleh asam amino aromatik protein dan peptida. Hal ini penting
untuk menghindari fragmentasi. Tanaka fisik / matriks kimia (gliserol yang
mengandung partikel koloid) belum dikembangkan lebih lanjut, tetapi berbagai
jenis fisik matriks / kimia telah, dan terus disajikan. Salah satu matriks tersebut
digunakan dalam ionisasi desorpsi pada (DIOS) metode silikon, di mana matriks
fisik dengan luas permukaan yang ekstrim dan laser tinggi radiasi absorptivitas
adalah tumbuh bunga [15].
Sebuah versi yang berkembang pesat dari teknik SLD, saat ini dominan,
menggabungkan
dengan
makromolekul kepentingan dalam molekul rendah berat kristal matriks dengan
maksimal penyerapan disesuaikan dengan panjang gelombang dari pulsa laser. ,

Laser desorpsi ionisasi (MALDI) teknik matriks-dibantu ini diterapkan untuk

protein [16] muncul tak lama setelah terobosan awal Tanaka. Teknik MALDI
disajikan oleh M. Karas dan F. Hillenkamp menggunakan laser YAG di 266 nm dan
matriks kimia asam nikotinat. Matriks fisik / kimia yang berbeda dan panjang
gelombang yang kemudian disajikan, affording teknik SLD sangat banyak relung
berguna, termasuk analisis protein dan oligonukleotida.
Satu keuntungan dari pendekatan, diakui awal, adalah untuk mengizinkan
utuh rendah biaya makromolekul transfer ke fase gas. Bahwa hal itu juga
memberikan hasil yang baik dengan sampel yang terkontaminasi telah
membantu penerimaan teknik untuk molekul besar, meskipun kontaminasi dan
kimia matriks yang sama ini biasanya menghambat kegunaannya untuk senyawa
ukuran sedang dengan berat molekul dan konsentrasi rendah dari makromolekul.
Kombinasi SLD dalam bentuk MALDI dengan waktu-of-flight spektrometri
massa
deteksi telah paling penting bagi penentuan berat molekul makromolekul
biologis. Ini adalah hari landasan proteomik.
Perkembangan terakhir dan aplikasi dari MS
Beberapa lima tahun yang lalu, spektrometri massa definitif menyeberangi
perbatasan untuk biokimia. Cara umum yang menyediakan tekad, identifikasi
dan tingkat jejak analisis struktural memiliki banyak aplikasi di bidang biokimia.
Hal ini telah menjadi alternatif yang menarik untuk Edman sequencing,
sebelumnya dominan, dan memiliki kemampuan yang tak tertandingi untuk
mengidentifikasi modifikasi posttranscriptional dan interaksi non-kovalen di
untuk studi mengikat misalnya antigen-antibodi untuk mengidentifikasi ligan
untuk reseptor yatim. Sebuah perkembangan penting adalah menunjukkan
kegunaan teknik MS untuk identifikasi protein setelah 2-D gel pemisahan
elektroforesis dan setelah pemisahan cairan. Dengan minat baru dalam
perangkat microfabricated untuk persiapan sampel, aliran rendah (nano-aliran)
teknik sedang dikembangkan untuk pemanfaatan optimal dari waktu dan
sensitivitas.
Aplikasi untuk membantu aliran tinggi sampel oleh gas-kecepatan tinggi
"pneumatik dibantu" ESI telah, di sisi lain, awalnya menjadi lebih populer. Hal ini
memungkinkan untuk memperpanjang laju aliran pelarut dan pilihan komposisi
elektrolit, konsentrasi dan potensi listrik yang diperlukan untuk ESI baik
disesuaikan dengan liquid-pemisahan konvensional aplikasi MS. Seperti telah
disebutkan, menggabungkan pemisahan cairan aliran rendah dan analisis
spektrometri massa masih tetap pertandingan yang ideal dalam analisis
biomolekuler. Kopling pemisahan dalam seri sebelum ESI dan SLD pada saat ini
pendekatan yang menarik untuk alat kimia peringatan dini medis diagnostik.
Sederhana pemisahan on-line sebelum ESI juga menarik untuk meningkatkan
ketahanan
dan informasi data dari proses ESI. Dengan cara ini garam sisa dan senyawa
elektroaktif ditambahkan untuk kelarutan atau untuk memungkinkan pemisahan
dapat dihapus dalam waktu dari proses ESI. Sebuah keunggulan komparatif

pendekatan SLD adalah bahwa metode ini kurang terpengaruh oleh kotoran
sampel.
Dalam mengikuti tren pergeseran paradigma di pertengahan 1980-an,
dengan
pengenalan
dua melengkapi proses ionisasi lunak (ESI dan SLD), teknik telah matang
menjadi alat yang layak untuk analisis biomolekul dan banyak kelas-kelas lain
dari molekul. Pergeseran paradigma ini adalah apa yang telah menyebabkan
spektrometri massa ke bidang lain selain fisika dan kimia.

Resonansi magnetik nuklir (NMR)

Fenomena NMR pertama kali terdeteksi eksperimental oleh Felix Bloch dan
Edward Purcell (Nobel Fisika, 1952) pada tahun 1946. Pada awal 1950-an
pergeseran kimia ditemukan yang menunjukkan bahwa sinyal NMR dilakukan
informasi tentang lingkungan kimia dari inti dipelajari. Hal ini mendorong
perkembangan kuat NMR sebagai alat analisis dalam kimia, namun dengan
kelemahan penting dari sensitivitas rendah. Sensitivitas potensi NMR secara
dramatis meningkat dengan penemuan bahwa Fourier transform metode dapat
diterapkan untuk NMR. Alih-alih perlahan merekam spektrum di frekuensi
domain, pulsa frekuensi radio yang diterapkan untuk sampel dan tanggapan
tergantung waktu-dipantau. Sebagai langkah terakhir respon waktu itu Fourierdiubah untuk memberikan spektrum NMR sebagai fungsi frekuensi. Transformasi
Fourier metode menyebabkan lebih cepat merekam sinyal, dan juga membuka
jalan bagi dua dan multidimensi teknik NMR. Perkembangan yang sangat penting
ini didasarkan terutama pada karya Richard Ernst (Nobel Kimia, 1991).
Selama tahun 1970-an, studi NMR semakin ditangani masalah biokimia.
Sensitivitas yang lebih besar dan resolusi adalah karena metodologi serta
perkembangan teknis, seperti percobaan dua dimensi dan ketersediaan magnet
stabil dengan bidang kuat. Para ilmuwan mulai merenungkan penggunaan NMR
untuk mempelajari sifat rinci dari makromolekul biologi.
Sejak saat itu, resolusi tinggi NMR telah menjadi alat yang paling penting
untuk mempelajari struktur, dinamika dan interaksi molekul makromolekul
biologis dalam larutan air. Saat ini, NMR berdiri disamping kristal tunggal difraksi
sinar-X sebagai metode utama untuk menentukan struktur tiga dimensi protein
dan asam nukleat. Struktur protein yang pertama belajar di resolusi atom
ditentukan oleh kristalografi sinar-X untuk mioglobin pada tahun 1957 oleh Max
Perutz (Nobel Kimia 1962, bersama dengan John Kendrew). Biologi struktural
sejak telah mengalami pertumbuhan yang luar biasa. NMR kontribusi dimulai
sekitar tahun 1985. Dari total 14.734 atom koordinat set yang disimpan di
Protein Data Bank oleh Mei 2002, 2763 atau sekitar 20% telah ditentukan oleh
NMR. Sebagian besar struktur telah diperoleh dengan kristal tunggal difraksi

sinar-X, dan hanya beberapa dengan teknik lain seperti elektron atau difraksi
neutron.
Selain resolusi tinggi NMR untuk studi kimia molekul dalam gerakan yang
cepat dalam larutan, perkembangan yang sangat signifikan juga muncul dalam
beberapa dekade terakhir dalam teknik solid-state NMR dan magnetic resonance
imaging (MRI). Solid-state NMR memungkinkan studi majelis molekul besar dan
bergerak, meskipun resolusi yang jauh lebih rendah daripada di solusi-NMR. MRI
yang ada di balik kamera magnet digunakan di banyak rumah sakit untuk
pencitraan diagnostik. Bidang ini tidak akan dijelaskan lebih lanjut di sini.
NMR penentuan struktur
Perkembangan NMR sebagai metode yang kuat dalam biologi struktural
telah melibatkan sejumlah langkah penting: identifikasi parameter NMR berguna
untuk menentukan struktur molekul; pengembangan metode untuk tugas
terpercaya dari banyak resonansi dalam spektrum NMR untuk inti masing-masing
dalam makromolekul tersebut; pengembangan metode untuk mengukur jumlah
yang cukup parameter struktur terkait untuk memberikan informasi yang
dibutuhkan untuk penentuan struktur yang unik; dan akhirnya, pengembangan
teknik komputasi yang bisa menerjemahkan parameter struktural ke dalam
struktur
tiga
dimensi
yang
unik.
Kurt
Wthrich
telah
merintis semua langkah ini.
Parameter yang paling penting untuk penentuan struktur berdasarkan
NMR adalah peningkatan Overhauser nuklir (NOE) efek. Ini memberikan
informasi tentang jarak antar atom antara inti dekat dalam ruang. Observasi dan
kuantifikasi efek NOE antara proton di dekat tetap menjadi dasar penentuan NMR
berbasis struktur tiga dimensi.

Gambar 3.
a) Prinsip untuk tugas berurutan dari proton backbone (HN dan H) dalam empat
residu berturut-turut (abcd) dalam protein, berdasarkan spektroskopi NMR dua
dimensi. NMR spektrum digambarkan sebagai kontur peta dengan resonansi
frekuensi bersama kedua sumbu, dan dengan representasi dari satu dimensi
proton spektrum sepanjang diagonal. Hanya wilayah frekuensi yang berisi HN
dan H resonansi ditampilkan.
Catatan pertama dua jenis spektrum NMR dua dimensi: spektrum COSY, yang
memberikan crosspeaks antara resonansi dari proton terikat karbon yang
berdekatan atau nitrogen, dan spektrum NOESY, yang memberikan crosspeaks
antara resonansi dari proton dekat dalam ruang. Kemudian paste bersama-sama
bagian atas spektrum NOESY dengan bagian bawah spektrum COSY, sehingga
mereka bertepatan di diagonal, memberikan diagram konektivitas.
Sekarang menganggap bahwa kita tahu (atau kira) bahwa crosspeak Cosy milik
residu, sehingga frekuensi untuk HN dan H dikenal untuk residu ini. Sekarang
pergi secara vertikal ke puncak diagonal, kemudian horizontal sampai bertemu o
dalam spektrum NOESY. Pergi vertikal ke arah diagonal untuk mencari frekuensi
resonansi HN residu b. Terus horizontal untuk l dalam spektrum COSY, vertikal ke
diagonal dan Anda telah menentukan resonansi frekuensi H untuk residu b.
Kami sekarang telah ditugaskan dua resonansi backbone proton residu b dan
dapat terus menuju c dan d. Resonansi untuk proton dalam sidechains masing
dapat dengan mudah ditemukan di daerah lain dari spektrum dua dimensi,
setelah H-urutan yang spesifik untuk setiap residu diketahui. Akhirnya, akan
ada sejumlah tersisa crosspeaks NOESY, yang tidak digunakan dalam prosedur
penugasan. Berikut salah satu crosspeak seperti digambarkan oleh antara HN
residu dan HN residu d. Ini berisi informasi yang proton ini dekat dalam ruang,
biasanya kurang dari 5a terpisah. Ini adalah contoh dari jenis informasi struktural
yang digunakan untuk model struktur tiga dimensi molekul. Dalam sebuah studi
yang nyata, ada redundansi kondisi kedekatan seperti antara pasangan proton,
dan struktur dimodelkan harus memenuhi semua kondisi ini.
b) Sebuah contoh tugas nyata menunjukkan dua dimensi NOESY gabungan /
Cosy diagram konektivitas untuk protein BPTI (Bovine Pankreas Trypsin Inhibitor)
dalam larutan air deuterated. Residu yang ditunjukkan adalah bagian dari sheet sekunder
struktur, yang menimbulkan pola spiral karakteristik dalam prosedur penugasan.
Strategi untuk tugas berurutan telah digariskan oleh Wuthrich dkk. pada tahun
1981. Dari ref. 17 dan Wuthrich, K. NMR protein dan asam nukleat, p. 147,
lihat daftar bacaan lebih lanjut.
Pada akhir 1970-an Wuthrich mengembangkan cara baru untuk
menerapkan metode NMR dua dimensi untuk makromolekul, sebagian
bekerjasama dengan Richard Ernst. Namun, rintangan yang paling penting
adalah untuk menetapkan resonansi proton dalam makromolekul tersebut. Tugas
berurutan berdasarkan pengamatan NOE sepanjang tulang punggung protein
dikembangkan oleh Wuthrich dalam serangkaian publikasi lama setelah 1980

[17-22]. Metode ini didasarkan pada penggabungan

spektroskopi berkorelasi (Cosy) dan dua dimensi
(NOESY), seperti digambarkan pada Gambar 3.

hasil dua dimensi

spektroskopi NOE

Pada tahun 1985 Wuthrich melaporkan penggunaan metodologi untuk

menentukan struktur tiga dimensi protein kecil dalam larutan, proteinase
inhibitor IIA, dari banteng mani plasma, BUSI IIA [23]. Banyak kendala struktural,
terutama jarak pengamatan NOE, dicatat dan metode matematika berdasarkan
metrik geometri jarak matriks [24] digunakan untuk menghitung struktur tiga
dimensi untuk protein berdasarkan kendala ini. Sehingga langkah terakhir dalam
pengembangan metode yang dapat diandalkan untuk NMR berbasis penentuan
struktur untuk makromolekul biologis telah dicapai. Metode ini kuat dalam arti
bahwa dihasilkan struktur biasanya lebih ditentukan oleh kelebihan eksperimendiamati kendala struktural. Gambar 4 menggambarkan struktur ditentukan untuk
BUSI IIA dan juga menunjukkan skematis bagaimana struktur NMR diturunkan
sering disajikan.

Gambar 4.
Salah satu dari tiga dimensi struktur solusi NMR pertama ditentukan oleh
Wuthrich, pada tahun 1985. Dari ref. 23.
a) Sebuah pandangan skematis dari topologi dari tulang punggung
polipeptida dari BUSI IIA (bull plasma seminal proteinase inhibitor IIA). Struktur
dihitung dengan geometri jarak, dari berbagai kendala jarak yang diperoleh dari
dua dimensi NOESY spektrum dan tambahan kendala struktural seperti sudut
torsi. Struktur tersebut merupakan rata-rata dari beberapa struktur dihitung
yang memenuhi kendala struktural.
b) Satu set lima struktur tulang punggung BUSI IIA, dihitung dengan
geometri jarak menggunakan kendala jarak NOE. Struktur dihitung seperti yang
digunakan untuk menghitung struktur rata disajikan sebagai Gambar. 4a.
Tulang punggung protein digambarkan pada Gambar 4b diperoleh dari
perhitungan berulang (biasanya sekitar 20: di sini 5 disajikan) bahwa semua

memenuhi kriteria matematika yang dibutuhkan oleh geometri jarak. Perjanjian

keseluruhan antara perhitungan adalah ukuran ketepatan penentuan struktur.
Bagian dari molekul yang tampak sangat teratur seringkali sangat mobile.
Mobilitas mereka bervariasi dan rentang waktu dan amplitudo gerak mereka
adalah parameter yang menggambarkan dinamika molekul. Dinamika dan
struktur tiga dimensi yang diambil bersama-sama sangat penting untuk
bagaimana molekul akan dapat berinteraksi dengan molekul lain di
lingkungannya. Menggunakan NMR, adalah mungkin untuk mendapatkan rinci
Informasi eksperimental pada dinamika molekul (lihat di bawah).
Biologi struktural NMR berbasis sehingga mendapatkan momentum di
tengah tahun 1980-an, saat beberapa peneliti lain menggunakan dan
mengembangkan lebih lanjut teknik NMR baru yang menjadi tersedia dalam hal
metode baru dan ditingkatkan spektrometer. Pada tahun 1985, kelompok R.
Kaptein di Utrecht menerbitkan sebuah struktur NMR yang diturunkan dari lac
represor headpiece [25]. Pada waktu yang sama, metode NMR serupa digunakan
untuk menentukan struktur solusi oligonukleotida. Yang pertama, pada tahun
1986, adalah dari hairpin DNA [26]. Sebuah bukti penting dari prinsip datang
pada tahun 1986 ketika NMR dan kristalografi sinar-X yang digunakan secara
independen untuk memecahkan struktur protein baru, yang dari inhibitor amilase Tendamistat. Struktur tiga dimensi yang hampir sama dalam hal lipatan
global rantai polipeptida yang ditunjukkan dalam publikasi yang menyertainya
[27, 28].
Perkembangan terakhir dan aplikasi dari NMR
The 1990's melihat perkembangan lebih lanjut kaya studi NMR berbasis
makromolekul biologis. Isotop pelabelan molekul dengan inti 15N NMR-aktif dan
13C telah menjadi prosedur standar, tumbuh keluar dari metode untuk ekspresi
protein rekombinan pada bakteri inang. Kemungkinan pelabelan isotop juga telah
menyebabkan perkembangan teknik NMR tiga dimensi heteronuklir, terutama
melalui karya A. Bax, National Institutes of Health (NIH). Teknik-teknik baru telah
sangat diperbesar repertoar NMR untuk biomakromolekul, dan telah
menyediakan misalnya prosedur tambahan untuk tugas resonansi. Relaksasi
heteronuklir memberikan dasar untuk studi NMR dinamika molekul dalam
makromolekul, menunjukkan bahwa bagian-bagian dari sebuah molekul yang
muncul tidak teratur dalam penentuan struktur sering dikaitkan dengan
mobilitas tinggi. Perilaku dinamis dari molekul merupakan karakteristik penting,
terutama untuk memahami interaksi molekul dan pengakuan molekul. NMR
berdiri di garis terdepan sebagai metode untuk memberikan informasi kuantitatif
spesifik tentang aspek dinamis dari makromolekul biologi. NMR juga telah
muncul sebagai alat penting untuk studi lipat protein, yaitu bagaimana tidak
terstruktur mencapai rantai protein kesetimbangan struktur tiga dimensi dalam
proses tergantung waktu.
Saat ini, satu-kristal difraksi sinar-X, metode lama grand tiga dimensi
penentuan struktur, dapat memberikan struktur tiga dimensi makromolekul
biologis yang sangat besar dan rakitan dengan resolusi atom yang sangat baik.

Struktur baru ini melaporkan mewakili berat molekul sampai dengan urutan
megaDa dalam kasus yang ekstrim. Dibandingkan dengan struktur ini kristal
tunggal besar, struktur solusi NMR umumnya menyangkut molekul yang lebih
kecil, biasanya di bawah 30 kDa, dan mereka sering kurang tepat. Namun,
perkembangan terakhir telah maju juga perbatasan NMR. Dengan Trosy dan
CRINEPT teknik [29, 30], juga dipelopori oleh Wuthrich et al., Sekarang mungkin
untuk menetapkan resonansi dan mempelajari perakitan protein besar seperti
900 kDa, seperti yang ditunjukkan dalam studi terbaru dari pendamping molekul
GroEL-Groes kompleks [31]. Metode baru untuk mencapai presisi yang lebih
besar dalam struktur NMR ditentukan juga telah muncul, terutama oleh
pengamatan kopling dipolar residual yang diinduksi oleh keselarasan parsial
media keselarasan tertentu, seperti yang dijelaskan oleh N. Tjandra dan A. Bax
[32].
Pengetahuan tentang struktur tiga dimensi makromolekul biologis adalah
fundamental bagi pemahaman kita tentang proses kehidupan. NMR memberikan
pengetahuan ini struktur dalam larutan air mendekati kondisi fisiologis. Hal ini
dapat diterapkan di mana kristal tunggal sulit diperoleh, biasanya molekul
dengan bagian teratur dan sangat fleksibel. Salah satu contoh dari kelas ini
molekul adalah protein prion. Konsep prion sebagai agen infektif baru
disampaikan oleh Stanley Prusiner (Nobel Kedokteran, 1997). Konstituen utama
dari prion adalah protein prion, yang bisa eksis dalam bentuk seluler jinak atau
mengalami transisi ke-penyakit terkait, 'scrapie', bentuk. Bentuk scrapie terkait
dengan penyakit neurodegenerative tertentu, yang meliputi bovine spongiform
encephalopathy (BSE, "Penyakit sapi gila"), scrapie pada domba dan penyakit
Creutzfelt-Jacob yang terkait pada manusia. Struktur NMR dari bentuk acara
seluler jinak yang satu setengah dari tulang punggung protein prion memiliki
struktur solusi yang memerintahkan sedangkan setengah lainnya adalah sangat
mobile, coil diperpanjang. Gambar 5 menunjukkan struktur dari bentuk seluler
jinak dari protein prion murine ditentukan oleh Wuthrich [33].

Gambar 5. NMR struktur protein prion rekombinan murine, ditentukan oleh

Wuthrich pada tahun 1997. (Dari ref. 33). Pertama struktur wellordered dari
fragmen yang terdiri dari residu C-terminal 121-231 ditentukan. Kemudian
protein utuh 23-231 dipelajari dan ditemukan bahwa 23-126 segmen N-terminal
terbentuk diperpanjang, coil sangat fleksibel dengan mobilitas tinggi. Protein
prion dari spesies lain, termasuk sapi dan protein manusia, memiliki struktur
serupa dengan segmen N-terminal fleksibel.
Struktur gabungan dan informasi dinamis diilustrasikan pada Gambar 5
merupakan karakteristik dari NMR ditentukan struktur tiga dimensi. Dalam kasus
protein prion dapat menyebabkan pemahaman tentang proses yang membawa
transisi dari bentuk jinak dari protein ke bentuk scrapie-penyakit yang
berhubungan.
Aplikasi praktis langsung dari NMR biomacromolecular di farmasi industri
Penelitian meliputi skrining studi ketika protein sangat penting sedang
dipertimbangkan sebagai target obat baru. Protein terkena berbagai molekul
kecil, lead potensi obat baru. Ketika molekul kecil tertentu berinteraksi dengan
makromolekul tersebut, NMR makromolekul akan berubah. Jika resonansi dari
makromolekul yang telah ditetapkan, juga memungkinkan untuk menentukan
residu terlibat dalam interaksi, dan potensi penggunaan molekul kecil dalam
pengembangan obat lebih lanjut dapat dinilai.
Pernyataan akhir
Lima tahun terakhir telah melihat munculnya "omics dunia" dalam ilmu
kehidupan, dicontohkan oleh konsep-konsep baru seperti genomik, proteomik
atau metabonomics. Aspek baru konsep-konsep ini adalah pandangan global dan
investigasi skala besar, berbeda dengan pandangan reduksionistik berorientasi

masalah yang berlaku dalam studi sebelumnya. Sekarang mungkin untuk

menggambarkan seluruh genom dari organisme. Demikian pula, seluruh
rangkaian protein yang muncul pada tahap tertentu dalam sel hidup setidaknya
bisa dipertimbangkan, bahkan jika tidak secara kuantitatif dijelaskan, dan sama
harus dalam memegang prinsip aliran total produk metabolik. Kemungkinankemungkinan baru sebagian karena pengembangan metodologi baru, yang
spektrometri massa dan NMR diterapkan untuk makromolekul biologis adalah
contoh penting. Namun, berdampingan dengan perusahaan skala besar baru
pemetaan sifat molekul organisme hidup, tetap ada kebutuhan yang meningkat
untuk pemahaman yang lebih dalam bagaimana proses biokimia terjadi pada
tingkat molekul rinci. Di dunia ini ilmu biokimia fundamental, spektrometri massa
dan NMR diterapkan untuk makromolekul biologis antara pilar penting untuk
meningkatkan pemahaman tentang proses kehidupan.