BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan hidup manusia sehari-hari yang mutlak.Air
merupakan kebutuhan esensial bagi seluruh makhluk hidup dan merupakan habitat
yang secara alami sangat mudah tercemar oleh faktor biotik dan abiotik.Namun
demikian, air yang dibutuhkan merupakan air yang bersih, bebas dari
kontaminan.Salah satu syarat air minum adalah bebas dari bakteri koliform.
Koliform adalah suatu kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator
adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan,
susu dan produk susu. Adanya bakteri koliform di dalam makanan dan minuman
menunjukkan kemungkinan adanya mikroorganisme yang bersifat enteropatogenik
dan atau toksigenik yang berbahay bagi kesehatan.Koliform merupakan suatu grup
bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi yang
tidak baik terhadap air, makanan,, susu,dll. Koliform sebagai suatu kelompok
dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora,
aerobik dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan
asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35
Bakteri koliform dapat dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu koliform non
fekal, seperti Enterobacter aerogenes dan koliform fekal seperti Escherichia coli
yang merupakan bakteri yang berasal dari kotoran manusia dan kotoran hewan,
sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan dan tumbuhan
yang telah mati.
 Untuk mengetahui jumlah bakteri dalam air dapat digunakan metode TPC dan
MPN.Dan agar dapat digunakan sebagai air minum, maka air tersebut harus
memenuhi 3 syarat, yaitu nilai MPN koliform dan coli adalah 0 cell/ml, nilai TPC <
102 CFU/ml, dan bakteri patogen harus bernilai 0 atau nihil.

B. Tujuan
Tujuan praktikum ini untuk mempelajari cara pemerikaan air berdasarkan
metode TPC dan MPN
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Standar Air Minum yang Sehat menurut Peraturan Menteri Kesehatan

Republik Indonesia
Standar air minum di setiap negara berbeda-beda, hal ini didasarkan pada hal-
hal berikut :
kondisi dari masing-masing negara
perkembangan ilmu pengetahuan
perkembangan teknologi
Berdasarkan hal-hal tersebut maka dikenal beberapa standar air minum,
diantaranya adalah sebgai berikut:
1. American drinking water standard
2. British drinking water standard
3. W.H.O drinking water standard
Di Indonesia standar air minum yang berlaku di buat pada tahun 1975 yang
kemudian diperbarui pada tahun 1990 dan tahun 2002. Dimana dalam standar
tersebut dimuat:
Air minum adalah air yang melalui proses pengolahan atau tanpa proses pengolahan
yang memenuhi syarat kesehatan dan dapat langsung diminum. Hal inilah yang
secara prinsip membedakan kualitas yang harus dimiliki antar air bersih dan air
minum. Kualitas air minum setingkat lebih tinggi daripada kualitas air bersih ditinjau
dari beberapa komponen pendukungnya. Agar air dapat dikategorikan sebagai air
minum maka dipersyaratkan harus memenuhi ketentuan pemerintah berdasarkan
peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 416/MENKES/PER/IX/2002,
yang merupakan Standar Nasional Indonesia (SNI) air minum.
Dari pernyataan tersebut dapat dikatakan bahwa air bersih belum tentu dapat
diminum, karena air bersih belum tentu memenuhi kriteria air minum yang sehat,
sedangkan air minum merupakan air yang bersih dan kualitasnya setingkat lebih
tinggi dibandingkan dengan air bersih, air minum harus sesuai dengan parameternya
yaitu parameter fisis, kimiawi, biologis maupun radiologis.

B. Bakteri indikator keamanan air minum

Menurut Manik Widiyanti dan Putu Ristiati (2004)bakteri indikator sanitasi
adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan menunjukkan bahwa air atau
makanan tersebut pernah tercemar oleh feses manusia.
Dalam uji kualitas air, parameter baik fisika, kimia maupun biologi diperlukan.
Parameter biologis yang dipergunakan dalam uji kualitas air ini terutama adalah kadar
fecal coliform atau untuk lebih spesifik adalah kehadiran bakteri E.coli. Jika di dalam
air tanah tersebut terdapat bakteri E.coli maka virus, bakteri, parasit dan amoeba
lainnya bisa saja ada di dalam air tersebut. Tapi jika tidak ada bakteri E.coli
kemungkinan virus, bakteri atau parasit yang ada di sana merupakan kuman yang
non-patogen atau tidak berbahaya. Hal inilah yang menyebabkan E.coli dapat
digunakan sebagai parameter biologis pada uji kualitas air. Selain itu metode yang
digunakan untuk mendeteksi adanya E.coli relatif lebih sederhana dan lebih
representatif dibandingkan deteksi mikroba perairan lainnya.
Escherichia (Escherichia coli) merupakan salah satu kelompok bakteri yang
dihindari kehadiranya dalam air minum dan makanan lainnya. Kehadiran elompok
bakteri ini digunakan sebagai indikator suatu produk telah tercemar oleh materi fekal,
yaitu materi yang berada bersama feses atau kotoran manusia. Hal ini disebabkan
habitat alami kelompok bakteri ini adalah didalam tinja manusia dan hewan berdarah
panas lainya.
Coliform merupakan suatu kelompok bakteri yang digunakan sebagai
indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air,
susu segar, dan produk olahan susu. Adanya bakteri coliform didalam makanan atau
minuman menunjukkan kemungkinan hidupnya mikroorganisme yang bersifat
enteropatogenik/toksigenik yang sangat berbahaya bagi kesehatan manusia. Jenis-
jenis dari kelompok ini antara lain adalah Aerobacter dan Klebsiella .
Berdasarkan asal dan sifatnya, kelompok bacteri Coliform dibagi menjadi dua
golongan, yaitu :
1. Coliform fekal: Escherichia Coli yang berasal dari tinja manusia.
2. Coliform non fekal: Seperti Aerobacter dan Klebsiella , yang bukan berasal
dari tinja manusia, tetapi dimungkinkan berasal dari sumber lain. Atau
ditemukan pada hewan atau tanaman yang telah mati dan termasuk dalam
golongan Enterobacter aerogenes.

C. Sifat umum bakteri koliform

1. Hanya hidup pada usus manusia dan binatang. Merupakan bakteri
berbentuk batang gram negatif yang bergerak menggunakan flagel peritrik
dan tidak berspora.
2. Bersifat aerob atau anaerob fakultatif, memfermentesi lactosa, glukosa,
sukrosa, maltosa dan manitol dengan membentuk asam dan gas.
Karakteristik khasnya adalah mampu memfermentasi
media indol dan merah methyl (indol dan merah methyl positif), akan tetapi
tidak mampu memfermentasi media VP dan Citrat (Voges
Proskauer dan Citrat negatif) dan tumbuh pada pembenihan biasa.
3. Berbentuk batang gemuk pendek, berukuran panjang 2,4 m dan lebar 0,4
m hingga 0,7 m, gram negatif tak bersimpai dan bergerak aktif.
4. Pertumbuhan pada biakan cair menunjukkan kekeruhan setelah diinkubasi
selama 8 - 24 jam.
5. Bakteri ini dapat bertahan berbulan-bulan pada tanah dan di dalam air,
tetapi dapat dinaktifkan dengan pemanasan pada suhu 600C selama 20
menit, atau dengan pemberian chlorin berkadar 0,5 - 1 ppm. Bakteri ini
peka terhadap streptomisin, tetrasiklin, kloramfenikol, furadantin dan asam
nalidiksat.
D. Perbandingan Standar Air Minum menurut WHO, Inggris, dan Amerika
Setiap negara memiliki standar air minum yang berbeda-beda, adapun
perbandingan standar air menurut neraga Amerika, Inggris, India dan Indonesia
disajikan dalam tabel 1. berikut ini.
Tabel 1. Perbandingan standar air minum menurut Amerika, Inggris, India dan
Indonesia
No Spesies USA1 UK2 India3 RI4 Dampak5 Keterangan5
2 Fecal coliform dan E. 0/100 0/100 0/100 0/100 Beresiko Tercemar
coli ml ml ml ml tinggi limbah ekskresi
terhadap hewan dan
kesehatan manusia (tinja)
anak dan
manusia
dengan sistem
imun yang
rendah,
infeksi
saluran
pencernaan
(diare, kejang,
mual, sakit
kepala dll)
5 Total coliform 0/100 0/100 0/100 0/100 Bakteri yang Ditemukan
ml ml ml ml berbahaya secara alamiah
bagi di lingkungan
kesehatan

E. Metode Total Plate Count

Total Plate Count merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan
jasad renik, dengan prinsip jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada
medium agar maka sel jasad renik tersebut akan berkembang biak dan membentuk
koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop
(Fardiaz, 1992). Keuntungan menggunakan metode Total Plate Count dalam
menghitung jumlah koloni pada medium agar adalah sebagai berikut:
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
2. Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung secara langsung
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai penampakan
pertumbuhan spesifik.
Selain keuntungan yang dimiliki seperti tersebut di atas, metode Total Plate
Countjugamemiliki kelemahan seperti yang termuat dalam Fardiaz (1992), yaitu:
1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena
beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni
2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang
berbeda.
3. Jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang nampak dan jelas, tidak menyebar.
4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan
koloni dapat dihitung.
Prinsip dari Total Plate Count adalah menumbuhkan sel mikroorganisme yang
masih hidup pada media agar, sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa
menggunakan mikroskop. Metode ini merupakan metode yang paling sensitif untuk
menentukan jumlah mikroorganisme.Dengan metode ini, kita dapat menghitung sel
yang masih hidup, menentukan jenis mikroba yang tumbuh dalam media tersebut
serta dapat mengisolasi dan mengidentifikasi jenis koloni mikroba tersebut.
Pada metode ini, teknik pengenceran merupakan hal yang harus
dikuasai.Sebelum mikroorganisme ditumbuhkan dalam media, terlebih dahulu
dilakukan pengenceran sampel menggunakan larutan fisiologis.Tujuan dari
pengenceran sampel yaitu mengurangi jumlah kandungan mikroba dalam sampel
sehingga nantinya dapat diamati dan diketahui jumlah mikroorganisme secara
spesifik sehingga didapatkan perhitungan yang tepat.
 Pengenceran memudahkan dalam perhitungan koloni (Fardiaz, 1993). Menurut
Waluyo (2005), tahapan pengenceran dimulai dari membuat larutan sampel sebanyak
10 ml (campuran 1 ml/1gr sampel dengan 9 ml larutan fisiologis). Dari larutan
tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan kedalam 9 ml larutan fisiologis
sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dari pengenceran 10-2 diambil lagi 1 ml dan
dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan
pengenceran 10-3, begitu seterusnya sampai mencapai pengenceran yang kita
harapkan. Secara keseluruhan, tahap pengenceran dijelaskan dalam gambar berikut
ini.
Total Plate Count dapat dibedakan dalam dua cara yaitu metode tuang (pour
plate) dan metode permukaan (surface plate) (Fardiaz, 1993).
1. Metode Tuang (Pour Plate)
Teknik Pour plate adalah teknik penanaman mikroorganisme dengan
mencampurkan inoklum sampel dengan medium padat yang masih berbentuk cair
sehingga kumpulan sel akan tersebar merata ke seluruh media. Pencampuran
inokulum ke seluruh media otomatis dapat menungkatkan jumlah sampel
yangdimasukkan dalam luasan cawan petri yang sama dibandingkan spread plate.
Cara ini cocok untuk menumbuhkan mikroorganisme yang tidak terpengaruhi
pertumbuhannya oleh keberadaan oksigen misalnya anaerob fakultatif. Koloni yang
terbentuk umumnya kecil dan kompak sehingga meminimalkan perebutan nutrisi.
Koloni menghasilkan gas dalam metabolismenya akan menimbulkan retakan kecil
pada agar dan penampakan koloni menjadi kurang terlihat jelas karena tenggelam
dalam agar.
Dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan tersebut
dipipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet 1 ml atau 1,1 ml. Sebaiknya waktu
antara dimulainya pengenceran sampai menuangkan ke dalam cawan petri tidak
boleh lebih lama dari 30 menit. Kemudian ke dalam cawan tersebut dimasukkan
agar cair steril yang telah didinginkan sampai 47-50 0C sebanyak 15-20 ml. Selama
penuangan medium, tutup cawan jangan dibiarkan dibuka terlalu lebar untuk
menghindari kontaminasi dari luar. Segera setelah penuangan cawan petri
digerakkan di atas meja secara hati-hati, untuk menyebarkan sel-sel secara merata,
yaitu dengan gerakkan melingkar atau gerakan seperti angka delapan.Setelah agar
memadat, cawan-cawan tersebut dapat diinkubasikan di dalam incubator dalam
posisi terbalik (Fardiaz, 1993).
2. Metoda Permukaan (Surface/Spread Plate)
Prinsip teknik Spread plate adalah menumbuhkan mikroorganisme dari suatu
larutan ke
permukaan

menggunakan spreading-spatula, L-rod atau drigalsky spatula (selanjutnya alat ini

disebut spreader). Koloni diharapkan akan tumbuh di permukaan agar dengan
menyerap nutrisi dari medium pertumbuhan dibawahnya. Kelebihannya adalah
mikroorganisme tidak terpapar pada suhu dimana agar masih cair sehingga
memungkinkan didapatkannya jumlah yang lebih tinggi dari volume yang sama
dibandingkan dengan pour plate dan juga memudahkan untuk pengamatan
morfologi koloni yang lebih jelas dan sangat cocok untuk menumbuhkan
mikroorganisme aerob.
Pada pemupukan dengan metode permukaan, agar steril terlebih dahulu
dituangkan ke dalam cawan petri dan biarkan membeku. Setelah membeku dengan
sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada
permukaan agar tersebut. Sebuah batang gelas melengkung (hockey stick)
dicelupkan ke dalam alcohol 95% dan dipijarkan sehingga alcohol habis
terbakar.Setelah dingin batang gelas tersebut digunakan untuk digunakan untuk
meratakan contoh di atas medium agar dengan cara memutarkan cawan petri di atas
meja. Selanjutnya inkubasi dan perhitungan koloni dilakukan seperti pada metode
penuangan. Tetapi harus diingat bahwa jumlah contoh yang ditumbuhkan adalah
0,1 ml, jadi harus dimasukkan dalam perhitungan total count (Fardiaz, 1993).
 Pada gambar diatas dapat anda lihat bahwa pada metode goresan atau spread
plate, bakteri hanya tumbuh pada permkaan media yang digores saja, sementara
pada metode cawan tuang atau pour plate, bakteri tumbuh tidak hanya di permukaan
media saja tetapi diseluruh bagian media.

Cara Penghitungan Koloni Bakteri

Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran
dilakukan secara decimal. Sebagai contoh misalnya penetapan jumlah koloni pada
susu. Pengenceran awal 1:10 = 10-1 dibuat dengan cara mengencerkan 1 ml susu ke
dalam 9 ml larutan pengencer, dan dilanjutkan dengan pengenceran yang lebih tinggi
misalnya sampai 10-5 atau 10-6, tergantung pada mutu susunya. Semakin tinggi jumlah
mikroba yang terdapat di dalam susu, semakin tinggi pengenceran yang harus
dilakukan. Jika setelah inkubasi misalnya diperoleh 62 koloni cawan yang
mengandung pengenceran 10-4, maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut (1
ml larutan pengenceran dianggap mempunyai berat 1 gr).Kerusakan bahan oleh
mikroba disebabkan oleh adanya pemecahan komponen makanan oleh Mikroba
seperti karbohidrat, protein, lemak dan H2O2 dan lain-lain.
Kebanyakan microbe dapat menggunakan karbohidrat sebagai sumber energi.
Masing-masing mikroba berbeda dalam kemampuannya untuk menggunakan
berbagai kerbohidrat, dan dalam caranya memecah karbohidrat. Tergantung dari
spesiesnya, hasil-hasil akhir dari pemecahan karbohidrat oleh mikroba dapat berupa
asam-asam organic (asam laktat, asetat, butirat atau propionate), produk-produk
netral (aseton, butyl alcohol, etil alkohol), dan bermacam-macam gas (metana,
hydrogen, karbondioksida). Terbentuknya hasil-hasil akhir dari pemecahan
karbohidrat tersebut dapat dilihat melalui beberapa pereaksi.Tiap-tiap petri dish dari
pengenceran berbeda dihitung jumlah koloninya kemudian dimasukkan kedalam
rumus sebagai berikut:
Angka kuman/Total Plate Count (TPC) untuk sampel yang diberikan:
= (a-k) x b + (a-k) x b
2
 = ....per ml/gram
Keterangan:
a= jumlah koloni
b= pengenceran
k= bakteri yang tumbuh pada kontrol
Sedangkan data yang dilaporkan sebagai Standard Plate Count (SPC) harus
mengikuti peraturan sebagai berikut (SNI 01-2897-1992):
1) Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni
antara 30-300 koloni.

2) Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau 300
maka hitunglah jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor
pengencerannya .
3) Bila cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan
jumlah koloni antara 25-250 hitunglah jumlah koloni dari masing-masing
tingkat pengenceran, dikalikan dengan faktor pengencerannya dan rata-rata
jumlah koloni dari kedua pengenceran tersebut.
4) Bila hasil perhitungan diatas, pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi
diperoleh jumlah koloni rata-rata 2kali jumlah koloni rata-rata pengenceran
dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran yang lebih rendah.

5) Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Total Plate Count
dinyatakan sebagai <1 dikalikan faktor pengenceran terendah.

6) Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni 250, dipilih cawan dari
tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa bagian atau
sector (2,4, atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sector
Contoh :
Pengenceran Cawan I (1 Sektor) Cawan II (1 Sektor)
10-2 100 150
10-3 175 200

Selanjutnya, Total Plate Countdidapatkan dari hasil jumlah koloni dikalikan

dengan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua cawan dan
dikalikan dengan faktor pengenceran .
 Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 40 x 104 cfu/ml
Bagan untuk mempersingkat syarat SPC

Cara Menghitung dan Membulatkan Angka

Dalam melaporkan jumlah koloni atau jumlah koloni perkiraan hanya 2 angka
penting yang digunakan, yaitu angka yang pertama dan kedua. Pembulatan angka
keatas dengan cara menaikkan angka kedua menjadi angka yang lebih tinggi jika
angka ketika adalah 6,7,8,atau 9. Gunakanlah angka 0 pada masing-masing angka
pada digit berikutnya. Pembulatan angka kebawah bila angka ketiga adalah 1,2,3,
atau 4. Bila angka ketiga adalah angka 5, maka bulatkanlah keatas jika angka kedua
merupakan bilangan ganjil atau bulatkan kebawah bila angka kedua merupakan
bilangan genap.

F. Metode MPN
Metode MPN merupakan salah satu metode perhitungan secara tidak langsung.
Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu:
1. Uji Pendugaan (presumptive test),
2. Uji Konfirmasi (confirmed test),
3. Uji Kelengkapan (completed test).
Dalam metode MPN, pengenceran harus dilakukan lebih tinggi daripada
pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung larutan hasil
pengenceran tersebut mengandung satu sel jasad renik. Beberapa tabung mungkin
mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel.
Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa
tabung yang dinyatakan sebagai tabung positif sedang tabung lainnya negatif.Metode
MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang
berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan
melakukan pengenceran terlebih dahulu (Fardiaz, 1996).
Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan
pertumbuhan Coliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah Coliform
dalam sampel yang diuji. Uji positif akan menghasilkan angka indeks. Angka ini
disesuaikan dengan tabel MPN untuk menentukan jumlah Coliform dalam sampel
(Pakadang, 2010).
Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk
padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut.Metode
MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya
dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad
renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif
dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam
tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad
renik pembentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga atau
lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang
lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih banyak (Fardiaz, 1996).
Untuk metode MPN (most probable number) digunakan medium cair dalam
wadah berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan jumlah tabung yang
positif yaitu tabung yang mengalami perubahan pada mediumnya baik itu berupa
perubahan warna atau terbentuknya gelembung gas pada dasar tabung durham. Pada
metode perhitungan MPN ini digunakan bentuk tiga seri pengenceran, yang pertama
10-1, 10-2 dan 10-3.Kemudian dari hasil perubahan tersebut dicari nilai MPNnya pada
tabel nilai MPN, dan untuk jumlah bakterinya maka digunakan rumus (Gobel, 2008).
Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari tiga seri tabung
berbeda dengan tabel lima seri tabung. Kombinasi yang dipilih mulai dari
pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif sedangkan
pada pengenceran yang berikutnya ada tabung yang negatif.Kombinasi yang diambil
terdiri dari tiga pengenceran.Jika pada pengenceran yang keempat atau seterusnya
masih diketemukan tabung yang hasilnya positif, maka jumlah tabung yang positif
tersebut harus ditambahkan pada angka kombinasi yang ketiga sampai mencapai
jumlah maksimum (Volk, 1993).
Beberapa jenis bakteri selain Coliform juga memiliki sifat fermentatif, sehingga
diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya
Coliform dengan bantuan medium selektif diferensial.Uji kelengkapan kembali
meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan
pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri Coliform seperti, berbentuk batang, gram
negatif, tidak-berspora. Output metode MPN adalah nilai MPN.Nilai MPN adalah
perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony
forming unit) dalam sampel.Namun, pada umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai
perkiraan jumlah individu bakteri.Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau
per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap
nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Lim,
1998).
 Uji penduga merupakan uji positif untuk menentukan bakteri Coliform.Media
yang digunakan ialah media Lactose Broth. Bakteri dapat menggunakan laktosa
sebagai sumber karbon, namun ada pula sebagian bakteri enteric yang tidak dapat
melakukannya.Kaldu laktosa mengandung surface tension depressant yang menekan
pertumbuhan bakteri gram positif dan memacu bakteri gram negatif terutama
bakteri Coliform.Hasil uji penguat yang positif atau meragukan menyatakan bahwa
sampel air tidak layak untuk diminum. Uji penguat memerlukan media selektif dan
diferensial seperti Eosin-Biru Metilen atau ENDO agar yang akan diinokulasi dari
tabung laktosa yang positif. Uji pelengkap, uji ini merupakan tahap akhir analisis
bakteri dari contoh air.Uji pelengkap dilakukan dengan pewarnaan gram (Volk, 1993).
 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Adapun waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum pemeriksaan air dengan
menggunakan metode MPN dan TPC adalah :
Hari/Tanggal : Selasa-Senin / 9-15 Mei 2017
Waktu : 16.00 WIB - selesai
Tempat: Laboratorium Mikrobiologi Universitas Nasional Jakarta

B. Alat dan Bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan sebagai berikut:
1. Alat:
1) Gelas Erlenmeyer 250 mL berisi 99 mL larutan fisiologis steril
2) Cawan petri steril
3) Pipet 1 mL steril
4) Lampu spritus
5) Penangas air
6) Pipet ukur 10 ml, 1 ml
7) Cawan petri steril
8) Rak tabung
9) Tabung reaksi
10) Gelas ukur 10 ml
11) Tabung durham
12) Lampu spirtus
13) Inkubator suhu 35oC dan suhu 44,5oC
14) Object Glass
15) Mikroskop

2. Bahan
1) Sampel air kran
2) Alcohol 70%
3) Larutan media NA steril
4) Medium Brilliant Green Lactase Bilebroth (BGLB)
5) Medium LB dengan tabung durham
 6) Medium NA miring
7) Zat warna pewarna Gram

C. Cara Pengambilan Sampel Air Kran

Pengambilan sampel air kran yang akan diperiksa diambil dengan botol yang
telah disterilkan terlebih dahulu.
1. Membiarkan air kran terbuka selama 2-3 menit, kemudia ditutup kembali
2. Memanaskan mulut kran dengn lampu spritus sampai uap air keluar
3. Membersihkan mulut kran dengan alcohol 70%
4. Membuka kran kembali
5. Membiarkan air mengalir beberapa saat
6. Membuka tutup botol dengan tangan kiri dan botol di tangn kanan
7. Memanaskan mulut botol dengan nyala api
8. Mengisi botol dengan air secukupnya
9. Memanaskan mulut botol kembali dengan nyala api kemudia tutup kembali
D. Cara Kerja Metode Total Plate Count
Adapun cara kerja perthitungan mikroba menggunakan metode Total Plate
Count dengan metode tuang sebagai berikut:
a. Mencairkan Natrium Agar tegak dalam penangas air, kemudian didinginkan
hingga suhunya mencapai 45-50oC
b. Mengidentifikasi setiap tiga cawan petri dan gelas Erlenmeyer berisi 99 mL
larutan fisiologis dengan 10-2, 10-4 dan 10-6
c. Memasukkan sampel air kran sebanyak 1 mL ke dalam gelas Erlenmeyer 10-2
d. Menghomogenkan gelas Erlenmeyer 10-2
e. Mengambil sampel air pada pengenceran 10-2 sebanyak 4 mL menggunakan
pipet steril
f. Masukkan ke masing-masing 1 mL ke dalam gelas Erlenmeyer 10 -4 dan ketiga
cawan petri 10-2
g. Menghomogenkan gelas Erlenmeyer 10-4
h. Mengambil sampel air pada pengenceran 10-4 sebanyak 4 mL menggunakan
pipet steril
i. Masukkan ke masing-masing 1 mL ke dalam gelas Erlenmeyer 10 -6 dan ketiga
cawan petri 10-4
j. Menghomogenkan gelas Erlenmeyer 10-6
k. Mengambil sampel air pada pengenceran 10-6 sebanyak 3 mL menggunakan
pipet steril
l. Masukkan ke masing-masing 1 mL ke dalam ketiga cawan petri 10-6
m. Menuangkan NA hangat ke dalam masing-masing cawan petri
n. Menghomogenkan cawan-cawan petri dengan cara diputar-putar hingga
tersuspensi dengan baik
o. Setelah NA memadat, diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam
p. Mengamati dan menghitung koloni yang tumbuh pada setiap pengenceran
E. Cara Kerja Most Probable Number (MPN)
1. Uji Penduga (Presumtive Test) :
a. Menginokulasikan 10 ml sampel air kedalam 5 tabung medium LB ganda
(seri I)
b. Menginokulasikan 1 ml sampel air kedalam 5 tabung medium LB tunggal
(seri II)
c. Menginokulasikan 0,1 ml sampel air kedalam 5 tabung medium LB tunggal
(seri III)
d. Menginokulasikan semua tabung pada suhu 35oC
e. Setelah 24 jam, apabila terbentuk asam dan gas, maka reaksinya adalah
positif.
f. Tabung yang belummenunjukkan adanya gas diinkubasikan lebih lanjut (24
jam)
g. Mengamati dan mencatat hasil uji pendugaan ini pada sebuah tabel.

2. Uji Penguat (Confirmed Test) :

Tahap 1:
a. Menginokulasikan secuplikan biakan dengan jarum inokulasi dari setiap
tabung uji penduga yang positif, masing- masing kedalam 2 tabung
medium BGLB.
b. Menginkubasi satu seri BGLB yang telah diinokulasikan pada suhu 350C
dan satu seri lain pada suhu 44,5oC.
c. Mengamati terbentukya asam dan gas setelah 24-48 jam, dan bila perlu
warku inkubasi diperpanjang lagi.
d. Mengamati dan mencatat hasil dalam tabel.
Tahap 2:
a. Mencairkan agar Endo, menuangkan ke cawan Petri steril, membiarkan
sehingga mengeras.
b. Mengambil secuplikan biakan dengan jarum inokulasi dari tabung BGLB
yang menunjukkan reaksi positif, dan menginokulasi kedalam medium agar
Endo dengan cara menggoreskannya (Penipisan Koch)
c. Setelah 24 jam, mengamati adanya koloni bakteri yang berwarna hijau
metalik

3. Uji Pelengkap (Completed test)

a. Menginokulasikan koloni yang berwarna merah metalik kedalam medium
LB dan NA.
b. Melakukan pewarnaan Gram dan Spora dari biakan yang ditumbuhkan
pada MA miring, setelah umurr biakan 24 jam.
c. Mengamati adanya asam dan gas dalam tabung LB yang diinokulasikan
dengan koloni yang berwarna hijau metalik.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Metode Total Plate Count (TPC)

Cawan Petri
No Pengenceran
1 2 3
-2
1 10 6 0 3
2 10-4 7 0 2
3 10-6 0 0 7

Telah dilakukan pemeriksaan air kran PMI Jakarta menggunakan metoda Total
Plate Count, dengan pengenceran 1 ml kedalam 10 ml larutan fisiologis, pengenceran
dilakukan untuk mempermudah menghitung jumlah koloni yang terdapat pada media.
Pengenceran dibuat 10-1,10-2 dan 10-3. Kemudian melakukan penanaman bakteri
koliform dengan teknik pour plate dimana pengenceran sampel di tuangkan pada 3
cawan petri yang berbeda terlebih dahulu kemudian Nutrien Agar dituangkan juga.
Cara ini cocok untuk menumbuhkan mikroorganisme yang tidak terpengaruhi
pertumbuhannya oleh keberadaan oksigen misalnya anaerob fakultatif. Koloni yang
terbentuk umumnya kecil dan kompak sehingga meminimalkan perebutan nutrisi.
Hasil perhitungan koloni menunjukkan tidak adanya koloni yang tumbuh sama
sekali pada setiap tabung masing-masing pengenceran, baik pengenceran 10-2, 10-4,
dan 10-6. Menurut pelaporan data sesuai SPC (Standar Plate Count) menyatakan
bahwa bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Total Plate Count
dinyatakan sebagai <1 dikalikan faktor pengenceran terendah.Sehingga jumlah koloni
mikroorganisme pervolume sampel adalah < 1 x 102sel/ml

B. Metode Most Probable Number (MPN)

 Telah dilakukan pemeriksaan air kran PMI Jakarta menggunakan metoda
Most Probable Number (MPN). Terdapat tuga dasar uji pada metoda MPN
diantaranya adalah uji penduga (presumptive test), uji penguat ( confirmed test) dan
uji pelengkap (completed test).

1. Uji Penduga

Uji penduga merupakan uji positif untuk menentukan bakteri Coliform.Media

yang digunakan ialah media Lactose Broth. Bakteri dapat menggunakan laktosa
sebagai sumber karbon, namun ada pula sebagian bakteri enteric yang tidak dapat
melakukannya.Kaldu laktosa mengandung surface tension depressant yang menekan
pertumbuhan bakteri gram positif dan memacu bakteri gram negatif terutama bakteri.
Dalam uji penduga diinokulasikan 10 ml sampel air kedalam 5 tabung medium LB
ganda (seri I), kemudian diinokulasikan 1 ml sampel air kedalam 5 tabung medium
LB tunggal (seri II), dan diinokulasikan 0,1 ml sampel air kedalam 5 tabung medium
LB tunggal (seri III). Selanjutnya semua tabung diinkubasi pada suhu 35 o c selama 24
jam. Setelah 24 jam diamati apakah ada asam dan gas yang terbentuk. Apabila
terdapat tabung yang belum terbentuk asam dan gas diinkubasi lebih lanjut selama 24
jam dan kemudian diamati kembali

Tabung
No. Pengenceran
1 2 3 4 5
1. 10 ml + + + + +
2. 1,0 ml + + - + -
3. 0,1 ml + - - - -

Dari hasi pengamatan dapat dilihat bahwa semua tabung yang berisi lactose broth dan
10 ml air menunjukkan terbentuknya asam dan gas, maka dikatakan reaksinya adalah
positif. Sedangkan dalam tabung lactose broth dan 1 ml air menunjukkan reaksi
 positif pada tabung 1, 2, dan 4. Kemudian dalam tabung lactose broth dan 0,1 sampel
air menujukkan reaksi positif pada tabung 1 saja.

2. Uji penguat ( Confirmed test )

Beberapa jenis bakteri selain Coliform juga memiliki sifat fermentatif, sehingga
diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya
Coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali
meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan
pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri Coliform seperti, berbentuk batang, gram
negatif, tidak-berspora. Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah
perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony
forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya nilai MPN juda diartikan
sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100
mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada
setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi.
Dalam uji penguat semua tabung reaksi dari uji penduga yang dinyatakan positif
diinokulasi masing-masing ke dalam dua tabung medium BGLB, kemudian satu seri
diinkubasi pada suhu 35o C dan seri lainnya diinkubasi pada suhu 44,5 o C, setelah 24
jam diamati apakah terbentuk asam dan gas.
Suhu 35oC

Suhu 44,5 oC duplo pertama

Tabung
No. Pengenceran 1 2 3 4 5
I II I II I II I II I II
1. 10 ml + - + - + - + - + -
2. 1,0 ml + - + - - - + - - -
3. 0,1 ml + - - - - - - - - -

Dari tabung BGLB yang menujukkan reaksi positif yaitu terbentuknya asam dan gas
kemudian di inokulasikan kedalam medium agak endo dengan cara penipisan koch
dan kemudian setelah 24 jam diamati koloni bakteri yang berwarna hijau metalik

3. Uji Pelengkap ( Complete test )

Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan

mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-
ciri Coliform seperti, berbentuk batang, gram negatif, tidak-berspora. Output metode
MPN adalah nilai MPN.Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth
unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun, pada
umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri.Satuan
yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram.
Uji pelengkap dilakukan dengan uji indol, merah metil, voges proskauer, dan sitrat.
Uji indol

N Tabung
Pengencera
o. Uji 1 2 3 4 5
n
I II I II I II I II I II
10 mL
1 Indol 1,0 mL + +
0,1 mL +
10 mL
2 MR-VP 1,0 mL + +
0,1 mL +
10 mL
3 Sitrat 1,0 mL + +
0,1 mL +
4 LB 10 mL
1,0 mL + +
0,1 mL +
DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

(http://yayanajuz.blogspot.com/2012/06/laporan-mengukur-kualitasairdengan
html) Di akses pada tanggal 5 Mei 2017
Fardiaz. 1996. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT Radja Grafindo Persada.
Jakarta. (http://dunia-mikro.blogspot.com/) Di akses pada tanggal 5 Mei 2017
Gause. 1946. Media Pertumbuhan Mikroorganisme. Rajawali Press. Jakarta.
(http://anyleite.wordpress.com/category/laporan-praktikum-mikrobiologi/) Di
akses pada tanggal 5 Mei 2017
Gobel. 2008. Mikrobiologi Umum Dalam Praktek. Universitas Hasanuddin,
Makassar.(http://rahdie.blogsome.com/) Di akses pada tanggal 5 Mei 2017
http://bloomadailmu.blogspot.co.id/2014/04/uji-kualitas-air menggunakan-
metode-mpn.html
https://www.academia.edu/12162205/LAPORAN_MIKROBIOLOGI_LINGK
UNGAN_UJI_KUALITAS_AIR
https://www.academia.edu/8843677/Mikrobiologi_air?auto=download
http://matakuliahbiologi.blogspot.co.id/2012/04/mikrobiologi-air-minum.html
Yulneriwarni dan Noverita. 2014. Teknik Laboratorium Mikrobiologi. Jakarta