BAB I

PENDAHULUAN

Dalam Biologi, sel adalah kumpulan materi paling sederhana yang dapat hidup atau
merupakan unit terkecil penyusun semua makhluk hidup. Tubuh makhluk hidup bersel
banyak memiliki bentuk dan susunan sel yang beranekaragam. Sel-sel itu berkelompok
membentuk massa dengan berbagai spesialisasi lapisan sel yang berbeda. Pada makhluk
hidup yang tubuhnya hanya terdiri dari satu sel, segala fungsi kehidupannya dilakukan oleh
sel tersebut (Tianaizta, 2013).
Semua sel dibatasi oleh suatu membran yang disebut dengan membran plasma
(membran sel),sementara daerah di dalam sel disebut sitoplasma. Di dalam sitoplasma
terdapat organel sel dan inti sel (nukleus). Setiap organisme tersusun atas salah satu dari
dua jenis sel yang berbeda yaitu sel prokariotik dan sel eukariotik (Tianaizta, 2013).
Sel tumbuhan dibatasi oleh dinding sel yang didalamnya terdapat tempat
berlangsungnya reaksi kimia yang diperlukan untuk kehidupan sel. Pengamatan tentang sel
hanya dapat dilihat menggunakan mikroskop. Dalam hal ini, mempelajari ukuran, dan bentuk
sel merupakan hal penting, namun tanpa memahami isi dari sel (unit sel) serta hubungannya
dengan sel-sel lain yang melapisinya tidak akan didapat pengetahuan yang mendalam tentang
sel itu sendiri (Damayanti, 2014).
Metode parafin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir
semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu
jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti
melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode parafin. Pembuatan preparat dengan
metode parafin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat
permanen, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan (Alfiandri, 2013).
Berdasarkan hal tersebut maka dilakukanlah percobaan ini, untuk membuat dan
mengamati preparat melintang dari tumbuhan dengan menggunakan metode parafin.
 BAB II
METODE PARAFIN

Suatu organisme baik tumbuhan maupun hewan adalah suatu unit kehidupan yang
lengkap. Jika terorganisasi benar maka organisme mempunyai susunan yang memiliki organ,
jaringan dan sel yang fungsi dan hubungannya merupakan ciri khas suatu individu maupun
spesies. Dalam bentuk kehidupan yang paling sederhana suatu organisme dapat terdiri dari
satu sel. Setiap organisme hidup ataupun hasil pertumbuhannya merupakan suatu sumber
yang penting sebagai bahan mikroteknik (Syahrir, 2013).
Tingkat kekerasan jaringan tumbuhan pada umumnya ditentukan oleh tingkat
pertumbuhannya, yang dalam hal ini berkaitan dengan derajat pengayuan (lignifikasinya).
Jaringan tumbuhan berbeda dengan jaringan hewan dalam satu hal penting yaitu bahwa setiap
sel tumbuhan terbungkus yang cukup tangguh yang terutama terdiri dari selulosa. Membran
tersebut berasal dari sel, sedangkan membran sitoplasma yang asli, yang sesuai dengan
membran luar pada sel hewan berada sedikit di sebelah dalam (Damayanti, 2014).
Mikroteknik atau teknik histologi ini akan dipelajari ilmu atau seni untuk
mempersiapkan organ, jaringan atau bagian yang lainnya untuk dapat diamati dan dipelajari
dengan lebih teliti. Pada umumnya untuk melihat jaringan atau organ ini dilakukan dengan
bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada dasarnya terlalu kecil
untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan
sebagian ataupun keseluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain diletakkan pada kaca
preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup yang direkatkan di atas
spesimen (Alyas, 2010).

Banyak cara dalam pembuatan preparat jaringan tumbuhan, diantaranya adalah

dengan metode parafin. Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam
jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini. Kebaikan-kebaikan
metode ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metode beku
atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi
dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang
bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh
lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode parafin juga memiliki
kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang
besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim
akan larut dengan metode ini (Alyas, 2010).
 Metode parafin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir
semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu
jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti
melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode parafin. Pembuatan preparat dengan
metode parafin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat
permanen, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan (Muarib, 2012).
Irisan utuh suatu spesimen sangat bermanfaat bagi studi pembelajaran. Dengan
adanya preparat utuh maka dapat diamati bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada
dalam satu preparat. Dalam pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau awet agar
sewaktu-waktu dapat diamati kembali. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini
tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan
pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang
bagus dan zat warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Muarib,
2012).
Karakteristik tumbuhan yang akan diambil spesimennya juga menentukan waktu pada
tahap-tahap pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih pada suatu tahap pengecatan akan
mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu gelap dan mungkin warna lainnya menjadi
kurang atau bahkan hilang. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini tergantung pada
lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan
parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat
warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Alyas, 2010).

Parafin

( Sumber: http://www.google.com )
 Metode parafin merupakan salah metode histoteknik yang umum digunakan untuk
menyiapkan sediaan sayatan. Metode ini berupa embedding dengan menggunakan lilin (wax).
Kelebihan dari metode parafin yaitu irisan dapat jauh lebih tipis daripada menggunakan
metode beku atau metode seloidin. Dengan menggunakan metode beku, tebal irisan rata-rata
di atas 10 mikron, tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapati rata-rata 6
mikron pada penyayatan hewan dan 10 mikron untuk penyayatan tumbuhan. Irisan-irisan
yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode parafin. Proses
penyiapan sayatan dengan metode parafin jauh lebih cepat dibandingkan metode seloidin.
Kekurangan metode parafin yaitu menyebabkan jaringan menjadi keras, mengerut, mudah
patah; tidak dapat digunakan untuk membuat sediaan jaringan-jaringan yang besar; dan
melarutkan sebagian besar enzim (Suntoro 1983). Tahapan penyiapan sediaan menggunakan
metode parafin meliputi: (1) penyiapan material, (2) fiksasi, (3) pencucian, (4) dehidrasi, (5)
penjernihan, (6) infiltrasi parafin, (7) penanaman parafin (embedding), (8) penyayatan, (9)
afiksing, (10) deparafinisasi, dan (11) pewarnaan.

Tahap penyiapan meliputi penyiapan alat dan bahan, dan penyiapan sampel. Sampel
yang telah disiapkan langsung dimasukkan ke dalam wadah yang berisi cairan fiksasi. Fiksasi
bertujuan mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat
sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya, mencegah autolisis dan
menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan
kombinasi cairan fiksatif (Dewi 2006). Fiksasi adalah dasar pembuatan sediaan histologi
yang baik. Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak dapat diperbaiki lagi pada
tahapan selanjutnya. Hasil akhir sediaan histologi yang baik sangat tergantung pada cara
melakukan fiksasi (Mughniati 2015). Fiksatif yang umum digunakan untuk memproses
sediaan tumbuhan adalah FAA.

Pencucian (washing) dapat dilakukan sebelum dan setelah fiksasi serta setelah
pewarnaan. Pencucian umunya memerlukan waktu yang lebih lama daripada fiksasi.
Pencucian bertujuan menghilangkan cairan maupun bahan yang masih tertinggal pada
jaringan yang tidak terikat jaringan maupun berlebihan sifatnya (Dewi 2006). Pencucian
dilakukan 2 kali dalam waktu 3 jam dengan akohol 50%. Jumlah larutan dipakai hannya tepat
menutupi bahan.

Dehidrasi adalah proses pengeluaran air dari dalam jaringan menggunakan bahan-
bahan kimia tertentu. Kesalahan yang terjadi saat dehidrasi dapat mengakibatkan
terhalangnya proses penanaman dalam parafin (embedding) yang merupakan proses lanjutan
setelah dehidrasi. Misalnya, jaringan yang terlalu lama didehidrasi akan menjadi keras dan
rapuh. Dehidran yang paling umum digunakan dalam metode parafin adalah alkohol, dioksan,
N-butil alkohol, minyak anilin dan minyak bergamot (Dewi 2006).

Penjernihan bertujuan menggantikan tempat dehidran dalam jaringan yang telah

mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih. Penjernihan
dilakukan menjelang proses penanaman atau sebelum dilakukan penyayatan. Penjernihan
menyebabkan jaringan menjadi transparan. Xylol merupakan penjernih yang paling sering
digunakan karena murah, bekerja cepat, membuat jaringan cepat menjadi transparan, cepat
menyingkirkan dan mengganti kedudukan dehidran dari proses dehidrasi. Keuntungan lain
dari xylol yaitu mudah digantikan oleh parafin saat proses infiltrasi dan cepat menggantikan
kedudukan parafin dalam proses deparafinisasi selama proses pewarnaan (Dewi 2006).

Infiltrasi adalah usaha menyisipkan media penanaman (embedding media) parafin ke

dalam jaringan dengan cara menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing
agents) dengan parafin. Sebelum dilakukan infiltrasi, jaringan harus sudah bebas dari cairan
penjernih karena sisa cairan penjernih dapat mengkristal dan menyebabkan jaringan menjadi
mudah robek saati disayat dengan miktrotom. Proses infiltrasi parafin dilaksanakan dan
dilangsungkan dalam dua cara, yaitu dengan oven biasa dan oven vakum (Dewi 2006).

Contoh Preparat Metode Parafin

( Sumber: http://www.nature.com )

Penanaman (embedding) merupakan proses memasukkan atau menanam jaringan ke

dalam blok-blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan penyayatan dengan mikrotom.
Keuntungan memakai parafin dengan titik lebur rendah adalah jaringan tidak mudah menjadi
rapuh/garing. Jenis parafin yang umum dipakai sebagai agen embedding antara lain parafin
cair panas yang memiliki titik lebur 56o-59o C, parafin histotek khusus (tissue mat) dengan
suhu 56 oC, dan paraplast yang merupakan campuran parafin murni dengan beberapa polimer
plastik. Parafin dengan titik lebur rendah umumnya dipakai untuk jaringan embrional.
Keuntungan memakai paraplast yaitu paraplast sifat parafin yang lebih elastis sehingga tidak
mudah robek ketika dipotong dengan mikrotom dan sediaan menjadi lebih mudah dipotong
(Mughniati 2015).

Mikrotom Putar

( Sumber: http://www.google.com )

Proses penyayatan mencakup berbagai cara yang dapat menghasilkan sayatan tipis.
Penyayatan sediaan parafin tumbuhan umumnya menggunakan mikrotom. Langkah-langkah
penyayatan parafin menggunakan mikrotom antara lain meliputi: (1) perekatan blok parafin
yang mengandung preparat pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok parafin
beserta blok parafin kemudian diletakkan pada holder mikrotom dan dikunci dengan kuat; (2)
peletakkan pisau mikrotom kedudukan pisau dan pengaturan sudut pisau. Umunya sudut
kemiringan pisau berkisar 20-30 derajat; (3) pengaturan ketebalan sayatan yang diinginkan,
umunya sayatan menggunakan ketebalan antara 5-7 mikrometer; (4) pemotongan blok parafin
yang dilakukan secara teratur dan ritmis; (5) pemindahan pita parafin yang mengandung
jaringan menggunakan kuas ke dalam waterbath yang temperaturnya diatur pada temperatur
37-40oC. Sayatan dibiarkan beberapa saat hingga pita parafin mengembang; (6) pempelan
pita parafin pada kaca objek yang telah dilapisi dengan gliserin; (7) peletakkan kaca objek
yang berisi pita parafin di atas hotplate yang diatur pada temperatur 40-45C (Mughniati
2015).
 Hasil Pengamatan Mikroskop Metode Parafin

Perbesaran: 400 x

Afiksasi merupakan proses pelekatan atau penetapan sayatan jaringan pada kaca
preparat dengan bantuan media perekat tertentu. Setelah afiksasi dilakukan, jaringan dapat
diproses dengan pewarnaan. Pewarnaan bertujuan mempertajam dan memperjelas berbagai
elemen jaringan, terutama sel-sel, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.
Jaringan yang tidak diwarnai akan terlihat transparan sehingga sukar dilakukan penelaahan
melalui mikroskop. Pewarnaan akan memperjelas detail suatu jaringan sehingga mudah untuk
dipelajari (Dewi 2006). Pewarnaan yang umum digunakan pada metode parafin tumbuhan
adalah pewarnaan ganda eosin-fastgreen.