Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam

danmenumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba

adalahmemisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari
campuranbermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan
dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu
koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu
jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan murni atau biakan
aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal
sebagai biakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang
dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan
dua-jenis
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya
kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang
paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di
jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini
dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan
kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000).
Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan
metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta
micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah
teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang
sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu species
dapat dipisahkan (plezar, 2006)
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan
nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor
seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.
Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus
mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor
lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle,
2007)
Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain, seperti tempat
untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Agar
tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali
digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap
 pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba (Suriawiria, 2005). Beberapa indikasi
pembiakan pada laboratorium mikrobiologi meliputi:
1. Pengasingan (isolasi) mikroba pada biakan bakteri
2. Menunjukan sifat khas mikroba.
3. Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu.
4. Untuk mendapatkan bahan biakan yang cukup untuk membuatantigen dan
percobaan serologi lainnya.
5. Menentukan kepekaan kuman terhadap antibiotik.
6. Menghitung jumlah kuman
7. Mempertahankan biakan mikroba.
 Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam
danmenumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba
adalahmemisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari
campuranbermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan
dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu
koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu
jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan murni atau biakan
aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal
sebagai biakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang
dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan
dua-jenis
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya
kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang
paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di
jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini
dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan
kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000).
Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan
metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta
micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah
teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang
sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu species
dapat dipisahkan (plezar, 2006)
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan
nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor
seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.
Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus
mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor
lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle,
2007)
Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain, seperti tempat
untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Agar
tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali
digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap
 pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba (Suriawiria, 2005). Beberapa indikasi
pembiakan pada laboratorium mikrobiologi meliputi:
1. Pengasingan (isolasi) mikroba pada biakan bakteri
2. Menunjukan sifat khas mikroba.
3. Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu.
4. Untuk mendapatkan bahan biakan yang cukup untuk membuatantigen dan
percobaan serologi lainnya.
5. Menentukan kepekaan kuman terhadap antibiotik.
6. Menghitung jumlah kuman
7. Mempertahankan biakan mikroba.
 Mikroorganisme apathogen (misal Escherichia coli) maupun pathogen sering
dijumpai di perairan terbuka (sungai) yang digunakan secara umum oleh masyarakat.
Di banyak tempat PDAM mengandalkan air sungai sebagai sumber bahan baku air
minum.(Esapmsi, 2012)
Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang
berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa
bakteri, khamir, kapang dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di
lingkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan
beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni
yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian
misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang
telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai
untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).
Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal
dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita
harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan
medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari
terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga
biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni
(Dwidjoseputro, 1990).
Untuk meumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel
(inokulum) dipindahkan (diinokulasi) kedalam media dengan perlakuan khusus untuk
mempertahankan kemurnian dari biakan. Pada waktu inokulasi, jarum yang
digunakan untuk memindahkan mikroba harus dipijarkan diatas api segera sebelum
dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini menghancurkan setiap bentuk
kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindah (Sutedjo, 1997).
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan suatu jenis mikroba dengan
mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam -macam mikroba. Hal ini dapat
dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat karena dalam padat sel-sel
mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada
tempatnya (Mulyani, 1991).
Terdapat beberapa mikroorganisme memerlukan keadaan yang sangat khusus,
misalnya tidak ada O2 sama sekali (kondisi anaerob), sedikit O2 (microaerofilik),
mutlak ada O2 (aerob), ada/tidak ada O2 (fakultatif).
 Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam
medium diantaranya adalah (Lay, 1994) :
1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun
untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang
biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan
baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.
Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan
permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran
mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum
terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores.
2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang
telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel-
sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di
antara cawan – cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas
permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun
tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi.
Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena
semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telah dan identifikasi mikroorganisme,
memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme
saja.Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara
mengisolasi mikroba, yaitu (Admin, 2008) :
1. Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan
mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari
organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut
setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode
isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang.
Metode gores kuadran ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya
mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel.Metode agar tuang,
berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar
 yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran
tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni
yang terpisah di atas permukaan atau di dalam cawan.
2. Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat
tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.
Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran.
Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.
3. Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme
berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair.
Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali.
Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat
halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

Untuk menumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel
(inokulum) dipindahkan (diinokulasi) ke dalam media dengan perlakuan khusus untuk
mempertahankan kemurnian dari biakan . Dalam waktu inokulasi harus dipijarkan
di atas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini
menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat
pemindah . Bagian jarum yang dipanaskan tidak terbatas pada bagian ujungnya saja
tetapi termasuk pula bagian bawahnya (Mulyono, 1992).
Seperti semua bentuk kehidupan lain, mikroba membutuhkan zat-zat hara dan
lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Pertama-tama media harus mangandung
senyawa-senyawa hara yang penting untuk pertumbuhan mikroba. Disamping itu
media harus juga memberikan lingkungan yang cocok bagi pertumbuhan seperti pH,
tekanan osmosis, oksigen dan lain-lain. Pada umumnya semua media untuk
pertumbuhan mikroba terdapat dalam dua bentuk yaitu media cair (Broth Media) dan
media Padat (Solid Media) (Mulyani, 1991).
Sifat-sifat umum suatu koloni:
a. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya berupa suatu titik, ada pula yang
melebar sampai menutup permukaan medium.
b. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang, ada tepi yang rata, ada
tepinya yang tidak rata.
c. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium, ada
pula yang timbul, yaitu menjulung tebal diatas permukaan medium.
d. Halus-kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaanya halus saja, ada yang
permukaanya kasar tidak rata.
e. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaanya mengkilat, ada yang
permukaanya suram.
f. Warna. Kebanyakan koloni bakteri itu berwarna keputihan atau kekuning-kuningan,
akan tetapi ada juga kolini yang kemerah-merahan, coklat, jingga, biru, hijau dan
ungu.
g. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang lunak seperti mentega
ada yang keras dan kering (Dwidjoseputro, 2005).
Populasi bakteri tumbuh sangat cepat ketika mereka ditambahkan dan
disesuaikan dengan gizi dan kondisi lingkungan yang memungkinkan mereka untuk
berkembang. Melalui pertumbuhan ini, berbagai jenis bakteri kadang memberi
penampilan yang khas. Beberapa koloni mungkin akan berwarna, ada yang berbentuk
lingkaran, sementara ada yang bentuknya tidak teratur. Karakteristik koloni (bentuk,
ukuran, margin, elevasi, warna, permukaan, konsistensi) yang diistilahkan sebagai
“morfologi koloni”. Morfologi koloni adalah cara para ilmuwan dapat mengidentifikasi
bakteri secara makroskopis, berikut adalah beberapa macam pertumbuhan koloni
berdasarkan morfologinya : (Devacurii, 2012)
1. Pertumbuhan pada Cawan Petri
Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
1.1 Ukuran; pinpoint/punctiform (titik)
Small (kecil)
Moderate (sedang)
Large (besar)
1.2 Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler,
beberapa jenis lain memproduksi pigmen
ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media
1.3 Bentuk :
Circular: bulat,bertepi
Irregular : tidak beraturan, bertepi
Spindle
Filamentous
 Rhizoid: bentuk sseperti akar, pertumbuhan menyebar
1.4 Elevasi (ketinggian pertumbuhan koloni bakteri)
Flat: ketinggian tidak terukur, nyaris rata dengan medium
Raised: ketinggian nyata terlihat, namun rata pada seluruh permukaan
Convex: bentuk cembung seperti tetesan air
Umbonate: bentuk cembung dibagian tengah lebih menonjol
1.5 Permukaan
Halus mengkilap
Kasar
Berkerut
Kering seperti bubuk
1.6 Margins
Entire : Tepian rata
Lobate: tepian berlekuk
Undulate: tepian bergelombang
Serrate: Tepian bergerigi
Felamentous: tepian seperti benang-benang
2. Pertumbuhan pada Agar Miring
Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus.Ciri
koloni berdasarkan bentuk:
3. Pertumbuhan pada Agar Tegak
Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam
media agar tegak.Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :
Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 :
4. Pertumbuhan pada Media Cair
Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2