HAL 6-7

GAMBAR 3. Administrasi G-CSF selama mobilisasi pengobatan pasca-CTX DC yang diinduksi

meningkat dalam ekspansi DC. C57BL / 6 tikus betina (n = 4 / grup) adalah i.p. disuntik dengan
PBS atau 4 mg / mouse CTX. Tikus dibiarkan tanpa perawatan lebih lanjut (grup: PBS dan CTX)
atau diobati dengan s.c. injeksi 5 mg / tikus G-CSF setiap hari selama 5 hari dari hari 1 hingga 5
(grup: PBS / G-CSF / d1–5 dan CTX / G-CSF / d1–5), dari hari 2 hingga 5 (grup: PBS / G-CSF /
d2–5 dan CTX / G-CSF / d2–5) atau dari hari ke 5 hingga ke 9 (grup: PBS /G-CSF / d5–9 dan
CTX / G-CSF / d5–9) dari PBS dan Perawatan CTX. Tikus berdarah setelah 7, 9, dan 12 d
perawatan PBS dan CTX untuk menentukan persentasenya (A) dan angka absolut (B) dari DC di
darah perifer. Jumlah absolut dari DC adalah dihitung dengan mengalikan angka persentase
CD11c + CD11b + sel dengan jumlah total PBMC. pA peningkatan signifikan (p, 0,05)
dibandingkan dengan hari 0. ppA penurunan signifikan (p, 0,05) dibandingkan dengan hari 0.

Administrasi G-CSF setelah pengobatan CTX ditambah DC ekspansi

Dalam pengaturan klinis, terapi CTX sering diikuti oleh pengobatan dengan faktor pertumbuhan,
khususnya G-CSF, untuk memperbaiki induksi leukopenia dengan memobilisasi HSC (2-4).
Untuk menentukan apakah pemberian 5 mg / tikus G-CSF setelah pengobatan CTX diubah
perluasan DC, tikus (n = 4 / grup) adalah i.p. disuntik PBS atau CTX, diikuti oleh s.c.
pengobatan dengan PBS atau 5 mg / tikus G-CSF untuk dua siklus perawatan yang berbeda: dari
hari 1 hingga 5 siklus atau hari 5 hingga 9 siklus setelah perawatan PBS atau CTX. Tikus
berdarah pada hari ke 7 (yaitu, 2 hari setelah siklus 1–5 dan di pertengahan siklus 5-9), hari ke 9
(yaitu, 4 hari setelah siklus 1–5 dan pada hari ke 9 dari siklus 5-9), dan hari 12 (yaitu, 7 hari
setelah siklus 1–5 dan 3 hari setelah siklus 5-9). Meskipun pengobatan kontrol (PBS-
diperlakukan) tikus dengan G-CSF lakukan tidak menyebabkan peningkatan yang signifikan
dalam persentase DC (Gambar 3A), secara signifikan meningkatkan angka absolut mereka saat
itu dianalisis 1 d, tetapi tidak 2 d, setelah perawatan G-CSF (Gbr. 3B). seperti yang diharapkan,
tikus yang diberi CTX menunjukkan persentase yang lebih tinggi (Gambar 3A) dan jumlah
absolut (Gambar 3B) DC dalam darah mereka pada hari 9 dan 12. Administrasi G-CSF setelah
pengobatan CTX diinduksi peningkatan sementara dalam jumlah absolut (Gambar 3A), tetapi
tidak persentase (Gambar 3A), dari DC. Efek ini muncul pada 24 jam injeksi kedua atau terakhir
G-CSF dari siklus perawatan 5-hari (Gambar 3B). Pengaruh G-CSF pada jumlah DC,
bagaimanapun, berkurang setelah 48 jam injeksi terakhirnya. Ini bisa menjelaskan mengapa
peningkatan jumlah DC ditampilkan hanya ketika itu dianalisis pada hari ke 7 atau 9 dalam
kelompok yang diobati dengan G-CSF dari hari ke 5 sampai 9 tetapi tidak ada pada hari yang
sama pada tikus yang dirawat dengan G-CSF dari hari 1 hingga 5. Hal ini semakin dikonfirmasi
oleh tidak adanya efek apa pun dari G-CSF pada nomor DC saat itu dianalisis pada hari ke 12
(yaitu, 7 hari setelah siklus “hari 1–5” dan 3 hari setelahnya Siklus “hari 5–9”. Efek serupa dari
perawatan G-CSF pada DC juga diamati pada persentase dan jumlah absolut dari Gr-1 + CD11b
+ sel (data tidak ditampilkan). Secara bersama sama, hasil ini menunjukkan bahwa ekspansi DC
yang diinduksi CTX dapat dilakukan secara sementara meningkat oleh administrasi G-CSF.

Ekspansi DCX pasca-CTX tidak bergantung pada Gr-1 + CD11b + ekspansi sel
Kinetika awal ekspansi dan kontraksi Gr-1 + CD11b + sel sebelum perluasan DC pada tikus
yang diobati dengan CTX dapat menunjukkan kontribusi mereka terhadap perluasan DC. Untuk
mengatasi kemungkinan ini, kami menguji dampak deplesi sistemik Gr-1 + CD11b + sel pada
ekspansi pasca-CTX DC menggunakan GEM. Konsisten dengan penelitian sebelumnya (27),
pengobatan tunggal dengan GEM pada hari ke 5 atau 8 setelah pengobatan CTX menghasilkan
hasil yang lengkap penipisan sel-sel Gr-1 + CD11b +, tetapi hanya untuk 3 d dan kemudian sel
cepat pulih ke level mereka sebelum injeksi GEM (Gbr. 4A). Kami menyuntikkan GEM 5 atau 8
hari setelah perawatan PBS atau CTX (puncak Gr-1 + CD11b + ekspansi sel) dan kemudian
dianalisis jumlah CD11c + CD11b + dan Gr-1 + CD11b + sel pada hari ke 12 pasca-CTX
pengobatan. Perawatan dengan GEM tidak berpengaruh signifikan pada
persentase Gr-1 + CD11b + (Gambar 4B, panel atas) atau CD11c + Sel CD11b + (Gbr. 4B, panel
bawah). Untuk lebih lanjut memeriksa kontribusi potensial dari Gr-1 + CD11b + sel untuk
ekspansi pasca-CTX DC, kami secara aktif mentransfer Gr-1 + CD11b + sel yang diurutkan dari
limpa 7-d tikus CTX-diperlakukan baik naif atau 7-d Tikus penerima CTX-diobati. Seperti
ditunjukkan pada Gambar. 4C, ditransfer Gr-1 + CD11b + sel muncul di darah perifer penerima
tikus. Angka rendah yang sama (∼7%) dari sel Gr-1 + CD11b + di darah perifer penerima naif
dan CTX yang didapat Ekspresi CD11c, menunjukkan bahwa sel Gr-1 + CD11b + bukan sumber
langsung atau prekursor untuk ekspansi CTX pasca-CTX. Adoptive transfer sel Gr-1 + tidak
berpengaruh pada peningkatan jumlah endogen DC pada tikus yang diobati dengan CTX (data
tidak ditampilkan).
CTX menginduksi DC untuk mengembangkan biak di BM dengan berikutnya proliferasi
dan ekspansi dalam darah perifer dan limpa
Untuk memahami apakah perluasan terapi pasca-CTX adalah karena proliferasi progenitor DC
sebelum dan / atau setelah mereka mobilisasi dari BM ke pinggiran, kami menganalisis
proliferasi DCs dalam darah, limpa, dan BM pada beberapa titik waktu pasca- Terapi CTX oleh
assay gabungan BrdU. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5A – F, baik persentase dan jumlah
mutlak BrdU + DC (CD11c + CD11b +) lebih tinggi pada BM 3 hari setelah pengobatan CTX
dibandingkan dengan jumlah mereka di kontrol (PBS-diperlakukan) tikus. Meskipun persentase
BrdU + DC per basis sel dalam darah perifer dan limpa pada titik waktu ini lebih tinggi dari pada
BM, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam jumlah bersepeda DC antara CTX- dan tikus
yang diobati PBS. Pada hari ke 6, Namun, persentase dan jumlah mutlak BrdU + DC tiba-tiba
meningkat dalam darah perifer dan limpa, tetapi tidak dalam BM, dan kemudian perlahan
menurun (Gambar. 5A – F). Hasil ini menunjukkan DC mungkin mulai berproliferasi di
pinggiran 3–4 hari sebelumnya puncak ekspansi mereka atau ekspansi DC itu mungkin
disebabkan oleh proliferasi progenitor DC di BM serta di pinggiran setelah mobilisasi mereka.
Untuk secara langsung mengatasi hipotesis ini, kami mentransfer tidak terpecah Sel BM dipanen
dari BM setelah 3 hari pengobatan CTX (yaitu, sebuah BM yang memiliki jumlah BrdU + DC
yang lebih tinggi) menjadi naif penerima (yaitu, tanpa lingkungan mikro pasca-CTX) atau ke
tikus yang diobati 2 hari sebelumnya dengan CTX (yaitu, dengan post-CTX yang sama
lingkungan mikro). Kemudian, kami menghitung frekuensi DC di darah perifer pada beberapa
titik waktu pada tikus penerima. Kami data menunjukkan bahwa jumlah sel BM yang sama
memperoleh fenotipe DC (CD11c +) dalam darah perifer PBS-dan CTX-diobati penerima
(Gambar 6A). Hasil serupa diperoleh ketika BM dipanen dari kontrol (PBS-diperlakukan) tikus
dipindahkan ke 3-d tikus CTX diperlakukan (data tidak ditampilkan). Data ini akan
menunjukkan DC berkembang setelah pengobatan CTX mungkin berasal dari dimobilisasi
progenitor DC di BM.
GAMBAR 4. Sel-sel Gr-1 + CD11b + tidak berkontribusi secara signifikan terhadap CTX yang
diinduksi Ekspansi DC. A, Menunjukkan pembentukan penipisan sel Gr-1 + CD11b + setelah
perawatan dengan GEM. C57BL / 6 tikus betina (n = 4 / grup) diobati dengan PBS atau 4 mg /
mouse CTX dan disuntikkan dengan atau tanpa 120 mg / kg GEM pada hari ke 5 pasca
pengobatan CTX. Suatu hari setelah GEM, tikus berdarah dan frekuensi sel-sel Gr-1 + CD11b +
dan DC dinilai oleh aliran cytometry. B, Menunjukkan ekspansi normal DC setelah GEM
diinduksi menipisnya sel Gr-1 + CD11b + pada tikus yang diobati CTX. CTX diobati tikus
disuntik dengan atau tanpa GEM 5 atau 8 d post-CTX pengobatan dan bled pada hari ke 12
setelah perawatan PBS atau CTX untuk menentukan persentase sel-sel Gr-1 + CD11b + dan DC.
C, Gr-1 + CD11b + sel diurutkan dari limpa Ly5.1 tikus yang diobati 7 hari sebelum CTX
diadopsi ditransfer ke penerima Ly5.2 tikus yang diobati 7 hari sebelumnya dengan PBS atau
CTX. Empat hari kemudian, tikus penerima dikorbankan dan persentase CD11c-
mengekspresikan donor Gr-1 + CD11b + sel ditentukan dalam PBLks, limpa, LN, dan hati.

Ekspansi DCX pasca-CTX independen dari limpa atau integrin CD11b

Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1, CTX menginduksi peningkatan sistemik pada jumlah sel
Gr-1 + CD11b +, yang terjadi sebelum ekspansi DC. Selanjutnya, kontraksi dalam jumlah Gr-1 +
CD11b + sel dalam darah perifer juga terjadi sebelum Ekspansi DC, menunjukkan kemungkinan
kontribusi sel-sel ini peningkatan frekuensi DC. Karena limpa memendam kolam terbesar
(0,60%) dari sel-sel Gr-1 + CD11b + dan menunjukkan kontribusi splenopotensial sel-sel Gr-1 +
CD11b + untuk ekspansi pasca-CTX DC, kami secara aktif mentransfer Gr-1 + CD11b + sel
yang diurutkan dari limpa 7-d tikus CTX-diperlakukan baik naif atau 7-d Tikus penerima CTX-
diobati. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 4C, ditransfer Gr-1 + CD11b + sel muncul di darah
perifer penerima tikus. Angka rendah yang sama (∼7%) dari sel Gr-1 + CD11b + di darah perifer
penerima naif dan CTX yang didapat Ekspresi CD11c, menunjukkan bahwa sel Gr-1 + CD11b +
bukan sumber langsung atau prekursor untuk ekspansi CTX pasca-CTX. Adoptive transfer sel
Gr-1 + tidak berpengaruh pada peningkatan jumlah endogen DC pada tikus yang diobati dengan
CTX (data tidak ditampilkan).

CTX menginduksi DC untuk berkembang biak di BM dengan berikutnya proliferasi dan

ekspansi dalam darah perifer dan limpa
Untuk memahami apakah perluasan terapi pasca-CTX adalah karena proliferasi progenitor DC
sebelum dan / atau setelah mereka mobilisasi dari BM ke pinggiran, kami menganalisis
proliferasi DCs dalam darah, limpa, dan BM pada beberapa titik waktu pasca- Terapi CTX oleh
assay gabungan BrdU. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5A – F, baik persentase dan jumlah
mutlak BrdU + DC (CD11c + CD11b +) lebih tinggi pada BM 3 hari setelah pengobatan CTX
dibandingkan dengan jumlah mereka di kontrol (PBS-diperlakukan) tikus. Meskipun persentase
BrdU + DC per basis sel dalam darah perifer dan limpa pada titik waktu ini lebih tinggi dari pada
BM, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam jumlah bersepeda DC antara CTX- dan tikus
yang diobati PBS. Pada hari ke 6, Namun, persentase dan jumlah mutlak BrdU + DC tiba-tiba
meningkat dalam darah perifer dan limpa, tetapi tidak dalam BM, dan kemudian perlahan
menurun (Gambar. 5A – F). Hasil ini menunjukkan DC mungkin mulai berproliferasi di
pinggiran 3–4 hari sebelumnya puncak ekspansi mereka atau ekspansi DC itu mungkin
disebabkan oleh proliferasi progenitor DC di BM serta di pinggiran setelah mobilisasi mereka.
Untuk secara langsung mengatasi hipotesis ini, kami mentransfer tidak terpecah Sel BM dipanen
dari BM setelah 3 hari pengobatan CTX (yaitu, sebuah BM yang memiliki jumlah BrdU + DC
yang lebih tinggi) menjadi naif penerima (yaitu, tanpa lingkungan mikro pasca-CTX) atau ke
tikus yang diobati 2 hari sebelumnya dengan CTX (yaitu, dengan post-CTX yang sama
lingkungan mikro). Kemudian, kami menghitung frekuensi DC di darah perifer pada beberapa
titik waktu pada tikus penerima. Kami data menunjukkan bahwa jumlah sel BM yang sama
memperoleh fenotipe DC (CD11c +) dalam darah perifer PBS-dan CTX-diobati penerima
(Gambar 6A). Hasil serupa diperoleh ketika BM dipanen dari kontrol (PBS diperlakukan) tikus
dipindahkan ke 3-d tikus CTX-diperlakukan (data tidak ditampilkan). Data ini akan
menunjukkan DC berkembang setelah pengobatan CTX mungkin berasal dari dimobilisasi
progenitor DC di BM.

Ekspansi DCX pasca-CTX independen dari limpa atau integrin CD11b

Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1, CTX menginduksi peningkatan sistemik pada jumlah sel
Gr-1 + CD11b +, yang terjadi sebelum ekspansi DC. Selanjutnya, kontraksi dalam jumlah Gr-1 +
CD11b + sel dalam darah perifer juga terjadi sebelum Ekspansi DC, menunjukkan kemungkinan
kontribusi sel-sel ini peningkatan frekuensi DC. Karena limpa memendam kolam terbesar
(0,60%) dari sel Gr-1 + CD11b + dan menunjukkan splenomegali (Gambar 6B), kami ingin
mengevaluasi apakah penghapusan ini kompartemen limfoid berdampak ekspansi pasca-CTX
DC. Untuk akhir ini, tingkat DC ditentukan di periferal darah tikus splenektomi yang diobati
dengan CTX dibandingkan dengan Tikus WT yang diobati dengan PBS dan CTX. Penghapusan
limpa tidak secara signifikan mengubah kinetika atau puncak ekspansi DC yang bersirkulasi
diinduksi oleh pengobatan CTX (Gambar 6B); menunjukkan itu limpa bukan niche yang
potensial untuk diferensiasi atau ekspansi DC pasca-CTX diperluas. Integrin tertentu khususnya
VLA-4 telah ditemukan terlibat dalam mobilisasi HSC (4). Demikian pula, studi terbaru
menyarankan peran untuk CD11b integrin (33). Karena pasca-CTX sel-sel DC dan Gr-1 +
CD11b diperluas menunjukkan tingkat tinggi Ekspresi CD11b, kami menguji peran integrin ini
menggunakan CR32 / 2 tikus yang kekurangan CD11b. Jadi, WT dan CR32 / 2 tikus adalah i.p.
diobati dengan PBS atau 4 mg / mouse CTX dan persentase DC dalam darah perifer diukur pada
hari 2, 6, 10, dan 14. Menariknya, pengobatan CTX pada mencit WT dan CR32 / 2 diinduksikan
pola serupa ekspansi DC, menunjukkan bahwa ekspresi CD11b oleh DC mungkin tidak
diperlukan untuk perluasan DC setelah pengobatan CTX (Gambar 6C)

Ekspansi DCX pasca-CTX tergantung pada induksi Jalur pensinyalan CCR2 / CCL2 dan
Flt3 / Flt3L
Karena sel BM dari tikus yang diberi CTX memunculkan DC (Gambar 6A), kami menganalisis
ekspresi kinetik dari berbagai array kemokin dan faktor pertumbuhan di BM (data tidak
ditampilkan). Antara faktor-faktor ini, pengobatan CTX secara signifikan meningkatkan ekspresi
dari chemokines CCL2, CCL3, CCL4, dan CCL12 (Gbr. 7A) dan faktor pertumbuhan M-CSF,
GM-CSF, dan Flt3L (Gambar 7B). Ringkasan ekspresi gen yang sebenarnya serta lipat
meningkat dalam ekspresi gen kemokin dan pertumbuhan ini faktor dalam BM yang dipanen
setelah 3, 6, 9, 12, dan 14 d CTX Perlakuan ditunjukkan pada (Gambar 7C) relatif terhadap
mereka yang di BM yang dipanen dari tikus kontrol (PBS-diperlakukan; hari 0). Secara bersama-
sama, data ini akan menunjukkan pentingnya faktor-faktor ini dalam pengamatan CTX-induced
DC expansion. Untuk langsung menguji kemungkinan ini, kami mengikuti kinetika ekspansi DC
pada tikus yang kekurangan CCR1 (berikatan dengan CCL3), CCR2 (berikatan dengan CCL2
dan CCL12), CCR5 (berikatan dengan CCL3 dan CCL4), CCL3, atau Flt3L. Menariknya, DC
ekspansi secara signifikan dibatalkan pada tikus kekurangan CCR2, CCL3, dan Flt3L (Gambar
8A). Karena kekurangan dalam Flt3L menghasilkan hampir satu penghapusan mutlak ekspansi
DC, kami menguji dampak dari Defisiensi Flt3L pada tanggapan sel T CD8 pasca vaksinasi.
Menggunakan model transfer mouse adopsi pmel-1, kami baru saja didirikan bahwa DC pasca-
CTX diperluas diperlukan untuk primeboost tersebut vaksinasi dengan gp100 / poli-I: C rejimen
selama limfopenik dan restorasi (yaitu, puncak ekspansi DC) fase pengobatan pasca CTX untuk
menginduksi sel T CD8 + Ag yang spesifik dan pemberantasan melanoma (24). Oleh karena itu,
kami menggunakan model transfer adopsi pmel-1 ini dan vaksinasi prime-boost rejimen pada
CTX yang diprakarsai penerima WT dan Flt3L2 / 2. Dengan demikian, WT dan Flt3L2 / 2 tikus
diperlakukan dengan PBS atau CTX dan secara aditif ditransfer 1 hari kemudian dengan 1 3 106
sel naive pmel-1 dan kemudian prima dan ditingkatkan dengan gp10025–33 6 poli-I: C pada
hari-hari 2 dan 12, masing-masing, posttreatments. Tikus-tikus dikorbankan 3 d setelah
meningkatkan untuk menganalisis jumlah sel-sel pmel-1. Konsisten dengan penelitian terbaru
kami (24), vaksinasi prime-boost dari CTX yang diobati Tikus penerima WT secara signifikan
meningkatkan ekspansi sel pmel-1. Namun demikian, rejimen vaksinasi prime-boost yang sama
menginduksi ekspansi marginal sel-sel pmel-1 pada CTX yang diobati Flt3L2 / 2 tikus penerima,
menunjukkan penurunan ∼6 kali lipat dalam jumlah sel pmel-1 (Gambar 8B). Sebaliknya, hanya
∼1,5 kali lipat penurunan ekspansi sel pmel-1 diamati pada PBS yang diinduksi Tikus penerima
WT (Gbr. 8B). Dari catatan, administrasi poli-I: C sendiri menjadi penerima CTX- pre kondisi
tanpa vaksinasi mengalami peningkatan marjinal tetapi tidak signifikan dalam angka-angka dari
sel pmel-1 yang ditransfer. Secara bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa Flt3L adalah
faktor pertumbuhan penting yang diperlukan untuk perluasan DC fungsional diperluas setelah
pengobatan CTX.