Transformasi Vektor Mutan

Vektor yang telah diinsersikan gen mutan kemudian ditransformasikan ke dalam sel
inang untuk selanjutnya digunakan dalam tahap berikutnya. Tranformasi vektor mutan
kedalam sel inang dapat dilakukan dengan beberapa cara, metode yang paling umum digunakan
untuk transformasi vektor mutan kedalam sel inang adalah metode Heat Shock (kejutan panas)
dan elektroporasi

Metode Heat Shock merupakan metode paling sederhana di mana bakteri E. coli yang
akan ditransformasi diinkubasi pada larutan yang mengandung kation divalen (umumnya
magnesium klorida, kemudian kalsium klorida pada kondisi dingin, yang kemudian dipaparkan
pada pulsa heat shock). Dengan adanya perbedaan tekanan di antara bagian luar dan bagian
dalam sel bakteri, akan terjadi induksi untuk membuat celah sehingga DNA plasmid superkoil
dapat masuk ke bagian dalam sel. Bakteri E. coli memiliki permukaan yang bermuatan negatif
akibat adanya fosfolipid dan lipopolisakarida, sehingga digunakan kation divalen yang
berfungsi untuk melindungi muatan negatif DNA agar dapat melekat pada permukaan E. coli.
Pemaparan E. coli pada larutan kation divalen yang bertemperatur dingin akan
melemahkan struktur permukaan E. coli dan mempengaruhi porositas membran sel sehingga
pada saat terjadi lonjakan temperatur, membran selnya menjadi tidak selektif terhadap molekul
asing (permeabel terhadap DNA plasmid), sehingga produk ligase (plasmid rekombinan) dapat
masuk ke dalam bakteri E. coli. Selanjutnya, pemaparan heat shock akan membentuk
ketidakseimbangan termal pada kedua sisi membran sel, sehingga DNA plasmid dapat masuk
melalui pori-pori sel atau dinding sel yang dirusak tersebut.
Lonjakan temperatur yang tiba-tiba (kejutan panas) menyebabkan dinding dan
membran sel bakteri E. coli mengalami perubahan, sehingga ia cenderung akan menerima
plasmid rekombinan yang asing baginya (DNA dapat lewat dengan mudah). Bakteri yang
mudah dilewati DNA disebut bakteri kompeten. E. coli akan bersifat kompeten jika ia sedang
tumbuh dengan sangat cepat (berada pada fase log, dibanding pada fase-fase lainnya). Maka
dari itu, tahap transformasi genetik sebaiknya dilakukan saat E. coli berada dalam fase log.
Uji Keberhasilan Mutasi

Uji Ekspresi Protein