PENDAHULUAN

Tolak ukur dalam memperisapkan antigen untuk imunisasi adalah mempresentasikan kepada
hewan uji bentuk antigen yang terkuat dan memberikan respon yang paling baik. Makalah ini berisi
tentang mempersiapkan protein, peptide dan hapten untuk imunisasi. Keputusan terbesar yang dibuat
adalah menilai seberapa murni antigen yang dibutuhkan untuk memulai pembuatan suatu vaksin.
Keputusan ini bergantung pada keguanaan antibody yang akan dibuat. Apabila dibutuhkan antibody
spesifik tingkat tinggi maka antigen harus dimurnikan sampai homogen. Apabila reaksi campur
dibolehkan, purifikasi berlebih mungkin tidak dibutuhkan. Apabila purifikasi optimal dibutuhkan,
tekhink standar seperti kromatografi kolom, ekstreaksi diferensial, dan fraksinasi subselular sangat
dibutuhkan. Saat menggunakan protein antigen, bila pada gel SDS poliakrilamid terlihat pita unik
yang menandakan protein yang diinginkan, maka gel tersebut bisa dibuat untuk tahap purifikasi.
Saat berbagai populasi antigen digunakan untuk pembuatan vaksin, respon antibody untuk beberapa
komponen dapat muncul. Bila semua komponen sama imunogenitasnya, maka antibody yang
dihasilkan juga memiliki distribusi kegunaan yang beragam. Namun apabila hasil imunogenitasnya
bervariasi, aka nada respon antibody dominan yang terbentuk.
 A. Antigen Murni

Memiliki antigen murni memberikan hasil terbaik untuk produksi antibodi. Namun, tidak semua
antigen murni akan memberikan respon yang baik, dan tidak ada tes untuk menentukan apakah antigen
akan imunogenik, selain tes empiris yang jelas pada persiapan dan pengujian sera. Selama antigen
lebih besar dari Kisaran ukuran minimal, sediaan harus diinokulasi pada hewan yang tepat dan sesuai.
Sekalipun hanya sejumlah kecil protein murni tersedia, saran terbaik adalah melanjutkan suntikan dan
tentukan imunogenisitas. Metode dan saran imunisasi memilih hewan yang benar ditemukan di bawah
ini.

Bergantung pada sumber antigen murni, masing-masing sediaan mungkin ada buffer yang tidak
biasa, pH tinggi atau rendah, atau denaturasi. Jika antigen tidak tersedia dalam bentuk murni, satu
metode sederhana untuk memurnikan antigen protein lebih lanjut adalah memisahkan sampel pada Gel
SDS-poliakrilamida. Antigen yang dimurnikan dengan cara ini sering menimbulkan tanggapan baik
dari antibodi karena antigen didenaturasi dengan rute ini.

Mendapatkan antigen menggunakan salah satu metode dan proses injeksi di bawah ini. Setelah
elektroforesis, pita protein yang diminati harus ditempatkan di gel, dan potongan gel dipotong untuk
injeksi. Berbagai metode identifikasi yang bisa digunakan, semua yang dirancang untuk menghindari
fiksasi protein berlebihan dalam matriks gel. Pilihan metode tergantung sebagian pada kelimpahan
polipeptida. Tiga metode yang umum digunakan: (1) pewarnaan strip samping dipotong dari tepi gel,
(2) pewarnaan cahaya dari gel itu sendiri, dan (3) menempatkan band dengan pelabelan radioaktif dari
antigen.

Pewarnaan strip potongan gel dari samping sangat berharga karena menghindari fiksasi gel. Saat
mengisolasi protein berlimpah itu terpisah dari band lain, metode pewarnaan strip samping sangat
berguna. Jika protein cukup melimpah, maka pewarnaan protein dalam gel dengan Coomassie blue
dapat digunakan sebagai alternatif, pita di dalam gel bisa jadi divisualisasikan dengan merendam gel
dalam natrium asetat atau klorida tembaga. Cara lain adalah dengan jika protein diberi radiolabeled
125
dengan 1, 32P, atau 35S, gunakan autoradiogram sebagai template untuk menentukan pita band yang
diminati.
 B. Coomassie BrIlliant Blue Staining

1. Setelah elektroforesis, gel harus dicuci dengan tiga atau empat kali air deionisasi

2. Tambahkan beberapa gel volume 0,05% Coomassie brilian biru R-250 disiapkan dalam air.

3. Inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar dengan digoyangkan.

4. Cuci gel dengan air selama beberapa berikutnya jam.

5. Bila band yang sesuai terlihat, cukai dengan pisau bedah. Kepekaan kira-kira 1-2 µg / band.

Protein dapat disuntikkan dalam gel poliakrilamida jika imunisasi akan dilakukan pada hewan
laboratorium yang lebih besar seperti kelinci. untuk protokol untuk menyiapkan irisan gel injeksi. Saat
menyuntikkan tikus atau hewan kecil lainnya, proteinnya harus elektroeluted sebelum digunakan.

C. Autoradiography
125 32
Autoradiograf yang memuaskan mudah diperoleh dari gel poliakrilamida yang mengandung 1, P,
35
atau aktivitas spesifik S yang tinggi. Seluruh persiapan protein bisa diberi label atau sampel bisa
dibubuhi dengan sejumlah kecil protein berlabel.

1. Setelah elektroforesis, pelat atas dilepaskan, dan gel pada piring bawah dibungkus erat dalam
bungkus plastik.

2. Tempatkan potongan pita atau label kecil di setiap sudut gel. Menandai masing-masing dengan
simbol kecil menggunakan tinta radioaktif. Biarkan tinta untuk mengering sepenuhnya. Sumber tinta
radioaktif yang baik adalah menambahkan 100 µl tinta India ke botol metionin yang kosong.
Radioaktif Metionin yang tersisa akan cukup untuk pelabelan.

3. Tempatkan sepotong film sinar-X di atas gel dan bukakan film. Dekat kontak sangat penting untuk
autoradiograf yang bagus, tapi juga penting jangan sampai mendistorsi gel. Jika gel disimpan di piring
dengan spacer atau jika spacer ditempatkan di sepanjang dua tepi gel spacer dapat digunakan untuk
menjaga kontak ketat dengan film X –ray tanpa mendistorsi gel. Film sinar-X ditempatkan di atas
pembungkus gel dan kemudian piring kaca lain diletakkan dengan hati-hati dari atas; sandwich kaca
dijepit dengan klip di atas gel spacer. Difusi pada gel poliakrilamida lambat, sehingga waktu
pemaparan meningkat sampai beberapa hari bisa diterima
4. Gunakan film yang terpapar sebagai panduan untuk cukai pita yang diinginkan. Sisa gel harus
diwarnai, dikeringkan, dikeringkan, dan diotorisasi untuk memeriksa keakuratan pemotongan.

Protein dapat disuntikkan dalam gel poliakrilamida jika imunisasi akan dilakukan pada hewan
laboratorium yang lebih besar seperti kelinci. Saat menyuntikkan tikus atau hewan kecil lainnya,
proteinnya harus elektroeluted sebelum digunakan.

D. Pengolahan Fragmen Gel untuk Imunisasi

Untuk suntikan, banyak pendekatan yang berbeda dapat digunakan untuk mengolah pecahan gel.
Pertama, fragmen gel bisa disuntik dengan protein utuh. Kedua, gel harus terfragmentasi sebelum
disuntikkan. Dua metode Biasanya digunakan: gel terfragmentasi dengan melewatkannya berulang-
ulang melalui semprit, atau seluruh irisan gel dikeringkan dan digiling menjadi bubuk. Suntikan
menggunakan seluruh fragmen gel sebaiknya hanya digunakan dengan hewan yang lebih besar seperti
kelinci. Untuk tikus atau hewan kecil lainnya, Metode lain harus digunakan. Ini termasuk
electroelution dari protein dan transfer elektroforesis protein ke membrane yang sesuai.

E. Fragmensi dari Gel Basah

1. Bilas potongan gel dalam air deionisasi selama beberapa menit. Tempatkan potongan gel pada
sepotong parafilm atau plastic pembungkus. Gunakan tepi kertas tissue untuk menghilangkan
kelebihan air dengan prinsip kapilarisasi.

2. Lepaskan plunger dari dua jarum suntik 5 ml. Tempat Fragmen gel pada salah satu tong.

3. Pasang kembali plunger dan letakkan stop kontak di laras jarum suntik kedua Menggunakan tekanan
kuat dan kencang pada plunger, dorong gel ke semprit kedua.

4. Ulangi proses setidaknya lima kali, semprot fragmen gel bolak-balik antara dua jarum suntik.

5. Tempatkan jarum 21-gauge ke stop kontak syringe, dan ulangi proses. Sejumlah kecil buffer
mungkin diperlukan untuk menjaga fragmen kecil yang lewat bolak-balik di antara jarum suntik.

Sampel sekarang siap untuk injeksi.

E. Lyophilization Of A Gel Slice

1. Bilas potongan gel dalam air deionisasi selama beberapa menit, lalu letakkan potongan gel pada
sepotong parafilm atau bungkus plastic. Gunakan tepi kertas tissue untuk menghilangkan kelebihan air
dengan prinsip kapilarisasi.

2. Transfer potongan gel ke wadah yang sesuai dan liofilisasi selama 24 sampai 48 jam

3. Keluarkan irisan gel kering ke adukan semen dan alu dan giling menjadi bubuk halus. Transfer
bubuk ke tabung reaksi.

4. Tambahkan volume air sebanyak setengah volume gel asli. Inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam.

Sampel sekarang siap untuk injeksi

F. Elektroelusi Antigen Protein dari Agar Poliakrilamid

1. Transfer potongan gel yang mengandung protein Anda ke tabung dialisis bersih yang mengandung
1,0 ml 0,2 M Tris / asetat (pH 7,4), 1,0% SDS, 100 mM dithiothreitol per 0,1 gram gel polyacrylamide
basah.

2. Letakkan tabung dialisis melintang pada ruang horizontal elektroforesis . Penyangga yang sedang
berjalan adalah SO mM Tris / asetat (pH 7,4), 0,1% SDS, 0,5 mM sodium thioglycolate. Jalankan pada
100 volt (sekitar 100 mA).

3. Setelah 3 jam, buka salah satu ujung tabung dialisis dan lepaskan gel pita. Stain band dengan
Coomassie biru untuk memastikan elektroforesis sudah selesai Kembalikan tabung dan dialihkan
dengan beberapa Perubahan terhadap 0,2 M sodium bicarbonate, 0,02% SDS.

4. Keluarkan larutan protein dan lyophilyze. Resuspend protein sebaik mungkin dalam 10 ml air
(panas jika perlu) dan lyophilize untuk kedua kalinya

S. Resuspend dalam 0,1 volume volume gel asli dalam air. Memeriksa kemurnian dengan
elektroforesis dan pewarnaan biru Coomassie.

Sampel sekarang siap untuk injeksi.

 G. HAPTEN

Banyak bahan kimia kecil dapat digunakan untuk meningkatkan antibodi, jika memang begitu
ditambah dengan molekul protein yang lebih besar. Senyawa kecil itu diketahui sebagai haptens,
sementara protein yang dengannya mereka digabungkan disebut pembawa (carrier). Para haptens
sendiri berperan sebagai epitop untuk mengikat antibodi pada permukaan sel-B, dan pembawa
memberikan situs pengikatan kelas 11-reseptor -T -cell. Secara umum, haptens harus digabungkan
untuk pembawa larut seperti albumin serum sapi (BSA) atau keyhole limpet hemacyanin (KLH).
Mekanisme kopling akan bervariasi pada masing-masing hapten, tapi banyak reagen kopling
bifungsional termasuk reagen yang terdaftar pada Tabel S.S akan sangat membantu. Juga, teknik
koplingnya peptida sintetis untuk pembawa dapat diterapkan Secara umum, kira-kira 1 mol hapten per
SO asam amino pembawa adalah rasio kopling yang masuk akal

H. PEPTIDA SINTETIK

Penggunaan peptida sintetis sebagai imunogens menjadi teknik penting dalam penjelasan sifat respon
antibody. Baru-baru ini, semakin banyak urutan DNA DAN urutan protein yang sesuai telah diketahui,
peptida sintetis telah digunakan untuk mempersiapkan antibodi spesifik untuk protein yang sebelumnya
tidak dikarakterisasi. Peptida biasanya disintesis dengan menggunakan teknik fase padat dipelopori
oleh Merrifield. peptida sintetis dimurnikan dan digabungkan ke protein pembawa, dan konjugasi ini
kemudian digunakan untuk mengimunisasi hewan. Dalam kasus ini, peptida berfungsi sebagai haptens
dengan protein pembawa, memberikan situs untuk pengikatan reseptor kelas Il-T -cell yang baik.
Konjugat pembawa peptide jarang gagal mendapatkan respons karena toleransi. Akibatnya, peptida
biasanya dapat dilihat sebagai epitop, dan antisera tingkat tinggi biasanya dipersiapkan. Secara
karakteristik, antibodi ini akan berikatan baik untuk protein denaturasi, tapi mungkin atau mungkin
tidak mengenali protein orang asli.

Dua keuntungan paling penting dari antibodi anti-peptida adalah bahwa mereka dapat segera
dipersiapkan setelah menentukan urutan asam amino protein (baik dari sekuensing protein atau dari
Sekuensing DNA) dan daerah protein tertentu ditargetkan khusus untuk produksi antibodi. Konversi
cepat dari informasi sekuens DNA terhadap antibodi memiliki potensi yang sangat besar dalam aplikasi
biologi molekular. Begitu pula dengan produksi sitespecific antibodi memiliki implikasi langsung
untuk studi fungsional dan klinis

Masalah utama yang dihadapi saat menyiapkan anti peptide Antibodi adalah apakah mereka akan
mengenali protein asli. Pengujian yang membutuhkan atau mendapatkan keuntungan dari antibodi anti-
pribumi, seperti imunopresipitasi, banyak teknik pewarnaan sel, atau pemurnian immunoaffinity, akan
berhasil hanya bila urutan peptida ditampilkan di permukaan molekul asli dalam konformasi mirip
dengan peptida- pembawa konjugasi Karena itu, keberhasilan produksi antipeptida Antibodi sering
ditentukan oleh kemampuan penelitian.

Perkirakan lokasi urutan peptida tertentu dalam struktur protein tiga dimensi. Karena ukurannya,
peptida mungkin tidak bersifat imunogenik sendiri. Untuk mendapatkan respons antibodi secara
langsung, harus mengandung semua fitur imunogen, terutama mereka harus memiliki epitop B-sel dan
sebuah situs untuk pengikat reseptor kelas II-T -cell. Beberapa peptida, bahkan yang sangat kecil
sekalipun, mengandung kedua situs ini dapat digunakan tanpa pembawa.

Memilih Urutan Peptida yang Tepat

Dengan sintesis, kopling, dan imunisasi yang hati-hati, kebanyakan urutan dapat digunakan untuk
menginduksi antibodi spesifik untuk peptida itu sendiri. Mengingat urutan mana yang akan digunakan,
kebanyakan orang sebenarnya ingin tahu seberapa besar kemungkinan antibodi anti-peptida akan
mengenali protein asli Pekerjaan awal menunjukkan bahwa peptida yang mengandung asam amino
hidrofilik dan residu prolin lebih cenderung terpapar pada permukaan protein asli dibandingkan urutan
lainnya, dan banyak peptide telah disiapkan dengan menggunakan kriteria tersebut. Dalam menilai
nilai kriteria ini, hidrofilisitas diperlukan tapi tidak cukup untuk memprediksi lokasi permukaan dari
urutan tertentu. Saat ini, urutan saran yang masuk akal untuk memilih urutan peptida adalah:

1. Jika memungkinkan, gunakan lebih dari satu peptida.

2. Gunakan urutan terminal karboksil jika hidrofilik dan jika Kelompok kopling yang sesuai tersedia
atau bisa ditambahkan.

3. Gunakan rangkaian amino-terminal jika bersifat hidrofilik dan jika sesuai kelompok kopling tersedia
atau bisa ditambahkan.

4. Gunakan daerah hidrofilik internal; Mungkin menggunakan peptida lagi.

Ukuran Peptida Peptida sintetis terkecil yang secara konsisten akan menghasilkan antibody yang
mengikat protein asli adalah 6 residu panjangnya. Tanggapan untuk Peptida yang lebih kecil biasanya
lemah atau tidak akan mengenali protein, baik dalam keadaan asli atau denaturasi. Sejak epitop
terbentuk daerah yang lebih kecil telah dilaporkan, batas bawahnya mungkin mencerminkan kesulitan
mengenali peptida yang lebih kecil yang digabungkan pembawa. Dengan peptida dari 6 asam amino
atau sedikit lebih besar, jawabannya berbeda. Beberapa akan menghasilkan antibodi yang baik dan
beberapa tidak. Umumnya, peptida kira-kira 10 residu harus digunakan sebagai batas bawah kopling
Strategi Coupling

Saat memilih urutan peptida sintetis, salah satu faktor itu yang sering dilupakan adalah metode kopling.
Kebanyakan metode kopling bergantung pada adanya amino bebas, sulfhidril, fenolik, atau karboksilat.
Kelompok amino bebas yang digunakan untuk kopling akan ditemukan rantai samping lisin atau residu
amino-terminal. Kelompok sulfulfat ditemukan pada rantai samping sistein, kelompok fenolik pada
tirosin, dan gugus asam karboksilat pada asam aspartat, asam glutamat, dan residu karboksi-terminal.
Metode kopling sebaiknya digunakan link itu peptida ke pembawa melalui terminal karboksi atau
amino residu. Saat menyiapkan antibodi terhadap daerah terminal karboksi Dari protein, kopling harus
dilakukan melalui amino ujung peptida. Begitu pula dengan coupling untuk terminal amino fragmen
harus dilakukan melalui daerah karboksi-terminal peptida. Untuk fragmen internal, pertimbangan
utama adalah bahwa peptida digabungkan dengan ujung dan tidak melalui residu pusat.

Strategi termudah untuk memanipulasi jenis kopling adalah menambahkan asam amino ekstra baik
pada terminal amino atau karboksil sederhana, kopling satu arah ke carrier. Setiap metode kopling itu
berpotensi bisa mengikat residu internal harus dihindari. Demikian pula, metode kopling harus dipilih
yang akan mengikat hanya satu asam amino, jika memungkinkan beberapa situs penggandengan
dimungkinkan, seharusnya begitu dilokalisasi ke terminal amino atau karboksil, dan kopling harus
disesuaikan untuk menghubungkan hanya melalui satu situs per peptide rata-rata. Penting untuk diingat
bahwa seringkali lebih mudah untuk digunakan peptida berbeda dari skema kopling yang rumit.

Memilih Carrier yang tepat

Banyak protein pembawa yang berbeda dapat digunakan untuk kopling dengan peptida sintetis. Dua
yang paling umum digunakan adalah keyhole limpet hemacyanin (KLH) dan albumin serum sapi
(BSA). Keduanya bekerja dengan baik dalam kebanyakan kasus, namun masing-masing memiliki
kekurangan. Karena ukurannya yang besar, KLH lebih cenderung mengendap saat cross-linking, dan
ini bisa terjadi membuat penanganan KLH sulit dalam beberapa kasus. Di sisi lain, BSA adalah sangat
mudah larut, namun seringkali merupakan imunogen yang baik dengan sendirinya. Untuk kebanyakan
tujuan, baik pembawa akan memadai. Gunakan mana saja yang lebih mudah.

Tiga pembawa lain yang digunakan sesekali adalah ovalbumin, albumin serum serum, atau serum
serum albumin. Ovalbumin bisa jadi digunakan sebagai pembawa yang baik untuk sebagian besar
tujuan. Ini juga pilihan yang baik untuk pembawa kedua saat memeriksa antibodi yang spesifik untuk
peptida itu sendiri dan bukan pembawa. MSA atau RSA dapat digunakan bila respon antibodi terhadap
molekul pembawa harus dijaga seminimal mungkin.
 I. Persiapan antigen dari vector overekspresi Bakteri

Bila antibodi dibutuhkan untuk gen kloning, yang sangat baik sumber antigen adalah overexpression
pada bakteri. Beragam daerah pengkodean dapat diekspresikan pada bakteri baik pada protein fusi atau
sendiri. Ada sejumlah vektor yang tersedia untuk kedua jenis kloning, beberapa di antaranya tercantum
dalam Lampiran IV. Untuk protein fusi, vektor yang memproduksi protein fusi J3 -galactosidase atau
tryptophan (trpE) adalah yang paling umum digunakan, namun banyak lainnya tersedia baik. Untuk
ekspresi protein full-length pada bakteri, ada koleksi vektor yang luas tersedia, didorong oleh berbagai
bakteri atau promotor virus. Beberapa di antaranya akan menghasilkan ekspresi yang bisa diinduksi,
beberapa ekspresi konstitutif sepenuhnya. Metode untuk kloning fragmen ini bisa ditemukan di salah
satu manual kloning molekuler, seperti Sambrook et Al. (1989). Untuk protein lebih dari 10.000 dalton,
dianjurkan agar klon full-length disiapkan bila memungkinkan.

Setelah memasukkan daerah pengkodean ke dalam vektor, dua langkah harus dilakukan diambil
sebelum isolasi berskala besar. Persyaratan pertama adalah menentukan berat molekul protein yang
baru diekspresikan, dan kedua adalah untuk menentukan apakah protein yang diekspresikan masuk
sebuah badan inklusi. Menentukan berat molekul dilakukan oleh membandingkan pola protein pada gel
SDS-polyacrylamide satu dimensi dari bakteri mengekspresikan atau tidak mengekspresikan protein
yang diminati. Bakteri dengan atau tanpa plasmid dibandingkan bersama dengan sampel disiapkan
dengan atau tanpa induser, jika plasmid memiliki promotor yang dapat diinduksi. Protein yang tidak
bisa dilihat Band individu pada gel biasanya tidak akan menghasilkan hasil yang cukup tinggi untuk
membuat pemurnian mungkin Jadi, jika band tidak bisa dideteksi teknik ini, ubah vektor yang
digunakan untuk ekspresi dan / atau periksa konstruksi. Strategi ini juga bisa digunakan untuk
menentukan poin waktu untuk induksi protein maksimal untuk memungkinkan koleksi jumlah antigen
yang lebih besar. Kedua, untuk mengetahui apakah protein itu ditemukan dalam tubuh inklusi,
melisiskan sel dengan lisozim seperti di bawah ini. Berputar di 12.000 g. Periksa pelet dan supernatan
untuk elektroforesis protein oleh SDS polyacrylamide dan pewarnaan.

Isolation Of Protein Antigens From Bacterial Overexpression Systems-Soluble Proteins

Protein larut biasanya akan dimurnikan pada gel SDS-poliakrilamida sebelum injeksi
1. Centrifuge bakteri pada 7000g selama 10 menit. Hapus dan buang supernatan. Resuspend pelet sel
dalam 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, SO mM Tris, (pH 8.0) sampai kira-kira 5% (vollvol). Centrifuge
lagi dan buang supernatan.

2. Resuspend pelet sel dalam buffer sampel (untuk Tris / glycine SDSpolyacrylamide gel
elektroforesis, buffer sampel 1 x adalah 2% SDS, 100 mM dithiothreitol, 60 mM Tris, pH 6,8, 0,001%
bromfenol biru) sampai konsentrasi akhir sekitar 10% (vollvol). Campuran dengan penuh semangat.

3. Sebagian besar sampel harus direbus selama 5 menit. Beberapa antigen akan datang keluar dari
solusi di bawah kondisi ini; Jika tidak ada sinyal yang terlihat, periksa suhu yang berbeda

4. Geser DNA kromosom dengan mensimulasikan sampel. Sonicator dengan salah satu tip immersible
atau cuphorn keduanya cocok; beberapa Semburan sekitar 15-30 detik dengan kekuatan penuh cukup
untuk geser DNA

S. Putar sampel di 10.000 g selama 10 menit. Pulihkan supernatan dan buang pelet apapun setelah
putaran terakhir, sampel bisa dibekukan pada - 20 ° C. Sampel sekarang siap untuk elektroforesis

Isolation Of Protein Antigens From Bacterial Overexpression Systems-Inclusion Bodies

1. Centrifuge bakteri pada 7000g untuk 5 menit.

2. Resuspend pelet sel dalam 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, SO mM Tris (pH 8.0) sampai konsentrasi
akhir 10% (vol! vol). Tambahkan lysozyme ke 1 mg / ml.

3. Inkubasi pada suhu kamar selama 20 menit.

4. Putar di 5OOO g selama 10 menit. Angkat dan buang supernatan. Mentransfer pelet ke es. Pelet
dapat disimpan pada tahap ini oleh Cepat membekukan tabung sentrifus di bak mandi es krim kering
dan menyimpan di - 70 ° C.

S. Resuspend spheroplast di es dingin 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% natrium deoksikolat, 5O mM

Tris (pH 8.0).

6. Inkubasi es dengan sesekali pencampuran selama 10 menit.

7. Tambahkan MgC12 ke konsentrasi akhir 8 mM dan DNase I ke final konsentrasi 10 JLg / ml.
Inkubasi pada suhu 4 ° C dengan pencampuran sesekali sampai viskositas menghilang. Tambahkan
DNase I segar jika perlu.

8. Lepaskan badan inklusi dari suspensi dengan sentrifugasi.

Untuk sebagian besar, 10.000 g selama 10 menit akan memuaskan. Kecepatan lebih lambat mungkin
cocok untuk beberapa sampel, dan kecepatan yang lebih lambat mungkin berguna dalam menurunkan
latar belakang diadaptasi

9. Cuci pelet sekali dengan resuspending dalam 1% NP-40, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, SO mM Tris
(pH 8.0), dan sentrifugasi. Banyak pellet dapat dicuci dalam 1 M urea, SO mM Tris (pH 8.0), tanpa
larut.

10. Cuci pelet dengan 100 mM NaCl, EDM 1 mM, SO mM Tris (pH 8.0).

Antigen sekarang siap disuntikkan atau dimurnikan lebih lanjut oleh Elektroforesis elektroforesis SDS-
poliakril.

J. Memilih Hewan Untuk Imunisasi

Spesies dan Strain mana?

Berbagai jenis spesies vertebrata dapat digunakan untuk produksi antisera. Kelima hewan laboratorium
yang paling umum digunakan adalah kelinci, tikus, tikus, hamster, dan guinea pigs. Biasanya, single
Sampel dari hewan ini akan menghasilkan 25 ml serum dari a kelinci, 100-200 µl dari tikus, dan 1-2
ml dari tikus, hamster, atau marmot. Hanya bila volume sera yang besar dibutuhkan lebih besar hewan
dibutuhkan Babi, kuda, domba dan keledai semuanya digunakan secara komersial dan bisa digunakan
jika serum dalam jumlah besar dibutuhkan.

Untuk alasan praktis, kelinci merupakan pilihan tepat untuk rutinitas produksi sera poliklonal. Mereka
mudah dipelihara dan ditangani, bisa aman dan berulang kali berdarah, dan antibodi yang mereka
hasilkan sangat baik dicirikan dan mudah dimurnikan. Dengan manajemen yang cermat setidaknya 500
ml serum dapat diperoleh dari satu kelinci selama perjalanan sebuah rezim imunisasi. Sebagian besar
kelinci laboratorium dikhususkan dan sedikitnya yang diketahui genetika dari respon imun dalam hal
ini spesies, tapi karena mereka dikawinkan, mereka akan memiliki jangkauan yang lebih luas protein
kelas II atau protein respon imun lainnya dibandingkan dengan inbrida hewan.

Untuk sebagian besar tujuan, hewan yang lebih kecil seperti tikus, tikus, hamster, dan kelinci
percobaan biasanya bukan hewan pilihan untuk poliklonal produksi antibodi, karena hanya volume
serum kecil yang bisa diperoleh. Masalah ini bisa dikurangi dengan mendorong terbentuknya asites
pada tikus; Prosedur ini memungkinkan hingga 10 ml cairan asites ke diperoleh dari satu hewan. Titer
antibodi pada cairan asites hampir setinggi titer serum. Tikus kecil dapat digunakan untuk produksi
antibodi poliklonal bila hanya sejumlah kecil antibody diperlukan atau bila hanya sejumlah kecil
antigen yang tersedia, karena tikus kecil umumnya bereaksi lebih baik terhadap dosis rendah daripada
hewan yang lebih besar. Untuk produksi antibodi monoklonal, tikus dan tikus bisa digunakan.

Gen yang berpengaruh baik kualitas maupun kuantitas bagi respon antibodi terjadi pada banyak lokus
yang berbeda, namun berhubungan dengan protein kompleks kelas II histokompatibilitas utama sering
terjadi. Fungsi protein ini dibahas di dalamnya

Latar belakang genetik adalah untuk mengimunisasi salah satu strain standar yang disimpan fasilitas
binatang Anda, dan jika tidak ada atau hanya respons yang lemah, lihatlah pertimbangkan strain
alternatif Khususnya, tikus hibrida F1 dan / atau laboratorium "strain outbred" seperti tikus Swiss harus
diadili.

Semua sistem kekebalan menampilkan sifat toleransi diri. Status Ini yang diperoleh secara aktif
melindungi hewan dari kerusakan autoimun dan dapat memiliki peran dominan dalam menentukan
imunogenisitas. Jadi, pada albumin serum tikus yang paling sederhana, tidak imunogenik pada tikus
tapi ada pada kelinci.

Untuk imunogenik lemah, protein yang sangat lestari yang diisolasi dari sumber mamalia, ayam atau
unggas lainnya memberikan alternatif yang berharga, karena toleransi diri mereka sendiri profil
molekul tersebut sangat berbeda dengan mamalia.

Jika tikus perlu digunakan untuk imunisasi dengan konservatif antigen, tikus NZB sering merupakan
pilihan yang baik, karena cenderung membuat autoantibodi lebih mudah daripada strain lainnya.
Hewan dari berbagai spesies mencapai pematangan kekebalan secara berbeda kali pasca kelahiran
Tikus umumnya dianggap matang pada usia 6 tahun minggu, tikus di 6- 8 minggu, dan kelinci 12
minggu pasca kelahiran.

K. ADJUVANT

Stimulator nonspesifik dari respon imun dikenal sebagai adjuvant. Penggunaan bijaksana dari bahan
ajuvan sangat penting untuk mendorong yang kuat Respon antibodi terhadap antigen terlarut, meski
tidak selalu terjadi diperlukan untuk antigen partikulat atau seluruh sel. Tindakan adjuvant tidak
sepenuhnya dipahami, tapi kebanyakan adjuvant menggabungkan dua komponen. Salah satunya adalah
zat yang dirancang untuk membentuk deposit yang melindungi antigen dari katabolisme cepat. Dua
metode pembentukan tradisional deposit menggunakan minyak mineral atau presipitat aluminium
hidroksida. Dengan minyak mineral, seperti yang digunakan di Freund's adjuvant, imunogen disiapkan
dalam emulsi air dalam minyak. Untuk aluminium hidroksida, imunogen teradsorpsi dengan preformed
presipitator atau terjebak saat curah hujan. Alternatif untuk Sistem pengiriman meliputi liposom atau
surfaktan sintetis. Liposom hanya efektif bila imunogen dimasukkan ke dalam lapisan lipid luar;
molekul yang terperangkap tidak terlihat oleh sistem kekebalan tubuh. Yang paling efektif dari sintetis
surfaktan adalah poliol pluronik.

Komponen kedua yang dibutuhkan untuk bahan pembantu yang efektif adalah zat yang akan
merangsang respon imun secara nonspesifik. Ini zat bertindak dengan menaikkan tingkat satu set besar
peptida terlarut Faktor pertumbuhan dikenal sebagai limfokin. Limfokin merangsang Aktivitas sel
pengolah antigen secara langsung dan menyebabkan peradangan local Reaksi di tempat suntikan.
Pekerjaan awal sangat bergantung sepenuhnya bakteri yang terbunuh panas atau lipopolisakarida
(LPS). LPS cukup beracun, dan, melalui analisisnya komponen struktural, sebagian besar propertinya
sebagai bahan ajuvan telah ada terbukti terbaring dalam porsi yang dikenal sebagai lipid A. Lipid A
tersedia dalam a jumlah bentuk sintetis dan alami yang jauh lebih tidak beracun dibanding LPS, namun
tetap mempertahankan sebagian besar sifat ajuvan yang lebih baik molekul LPS orang tua Senyawa
lipida sering disampaikan dengan menggunakan liposom. Dua bakteri yang biasa digunakan pada
bahan ajuvan tersebut adalah Bordetalla pertussis dan Mycobacterium tuberculosis. Bila digunakan
sebagai, mereka harus terbunuh panas sebelum digunakan. Imunomodulator mediator B. pertussis
termasuk komponen LPS dan Toksin pertusis telah dimurnikan dan tersedia komersial. M. tuberkulosis
paling banyak ditemukan secara lengkap Adjuvant Freund Komponen paling aktif dari M. tuberculosis

telah dilokalisasi ke muramyl dipeptide (MDP). MDP tersedia dalam sejumlah bentuk.

Freund's Adjuvan

Adjuvan yang paling umum digunakan untuk pekerjaan penelitian adalah Freund'sadjuvan. Adjuvant
Freund adalah emulsi air dalam minyak yang disiapkan bersama minyak tak metabolizable. Jika
campuran mengandung M. tuberkulosis mati, itu disebut sebagai adjuvant Freund lengkap (CFA).
Tanpa Bakteri ini dikenal sebagai adjuvant Freund yang tidak lengkap (IF A). Freund's adalah salah
satu adjuvant terbaik untuk merangsang respons yang kuat dan berkepanjangan. Kelemahan utama
adjuvant Freund adalah bahwa hal itu dapat terjadi granuloma yang sangat agresif. Ini tidak digunakan
untuk suntikan manusia untuk alasan ini, dan kemungkinan efek sampingnya harus dipantau secara
hati-hati selama produksi antibodi pada hewan.

Untuk menghindari sebagian besar efek samping, sebaiknya suntikan primer diberikan di CF A,
sementara semua dorongan harus dilakukan di IF A.
Alumunium Hydroxide Adjuvant

Alternatif yang umum untuk penggunaan adjuvant Freund adalah mengadsorpsi imunogen ke garam
aluminium. Aluminium hidroksida adalah yang paling umum digunakan, tapi semua tipe menghindari
banyak hal efek samping berbahaya dari adjuvant Freund. Imunogen juga diizinkan untuk menyerap
garam aluminium yang sudah terbentuk atau bisa terjebak garam selama curah hujan. Saat disuntikkan,
presipitatnya diberikan efek depot Jika diinginkan, rangsangan nonspesifik dapat diberikan oleh
menambahkan bakteri membunuh ke persiapan; paling sering, panas terbunuh B. pertusis digunakan
Namun, penambahan B. pertussis kembali diperkenalkan beberapa efek samping potensial terlihat
dengan adjuvant Freund lengkap.

Aluminium hidroksida adjuvan, bila digunakan tanpa B.pertusis stimulan, bisa disuntikkan ke semua
situs. Bila B. pertussis atau lainnya Agen digunakan, semua situs memuaskan kecuali intravena.

DOSIS ANTIGEN

Dua kriteria berbeda penting untuk dipertimbangkan dalam menentukan Dosis yang tepat: pertama,
dosis optimum untuk mencapai respon terkuat, dan, kedua, dosis minimum cenderung menginduksi
produksi Antiserum poliklonal yang berguna atau hewan donor untuk fusi hibridoma. Sebagian besar
bahan yang disuntikkan akan dikata kata dan dibersihkan sebelumnya mencapai sel target yang tepat
Efisiensi proses ini akan bervariasi dengan faktor host, rute injeksi, penggunaan adjuvant, dan sifat
intrinsik antigen. Dengan demikian, dosis efektif diberikan bagi sistem kekebalan tubuh mungkin
hanya sedikit berhubungan dengan yang diperkenalkan dosis, dan begitu deskripsi persyaratan dosis
pasti bersifat empiris.

Untuk kelinci, jika antigen protein murni yang larut digunakan dan melimpah, kemudian dosis 0,5 - 1
mg di ajuvan pada setiap imunisasi rekomendasi umum yang masuk akal; Bagi tikus angka ini bisa
dikurangi 10 kali lipat sampai 50 - 100 µg. Perbedaan 10 kali lipat antara kelinci dan Tikus adalah
aturan umum yang baik untuk menentukan jumlah antigen dibutuhkan untuk menghasilkan respon
yang kuat, saat membandingkan keduanya hewan.

Jumlah minimum antigen yang mampu menginduksi respons akan tergantung pada sifat antigen dan
pada host, namun pada beberapa sistem dimungkinkan untuk memperoleh respon yang baik terhadap
fraksi antigen mikrogram.

Rute injeksi
Rute injeksi dipandu oleh tiga keputusan praktis: (1) apa volume harus dikirim, (2) buffer dan
komponen lainnya disuntik dengan imunogen, dan (3) seberapa cepat seharusnya imunogen dilepaskan
ke dalam limfatik atau sirkulasi . Untuk kelinci, suntikan volume besar biasanya diberikan di beberapa
situs subkutan. Untuk tikus, volume besar hanya dimungkinkan dengan suntikan intraperitoneal. Jika
bahan ajuvan atau partikulat disertakan dalam injeksi, imunogen tidak boleh diberikan secara
intravena. Jika pelepasan lambat Inokulum diinginkan, suntikan harus dilakukan baik secara
intramuscular atau intradermally Untuk segera dilepaskan, gunakan suntikan intravena.

Subkutan

Suntikan subkutan (se) digunakan secara luas untuk imunisasi hewan laboratorium, terutama kelinci.
Suntikan bisa meliputi keduanya partikulat immunogens dan / atau adjuvant. Bahan yang disuntikkan
akan habis cepat ke sistem limfatik lokal dan akan menjadi terkonsentrasi di kelenjar getah bening
yang paling dekat dengan situs yang disuntikkan.

Intramuskular

Injeksi intramuskular (im) adalah salah satu rute inokulasi yang digunakan menghasilkan pelepasan
antigen yang lambat. Inokulum diendapkan langsung ke jaringan otot, dan antigen terlihat seperti
mengalir ke dalamnya ruang interstisial terdekat. Inokulum kemudian akan mengalir ke dalam kelenjar
getah bening lokal Karena sulitnya menyuntikkan ke dalam Jaringan otot tikus kecil, suntikan im tidak
dianjurkan untuk tikus Kelinci bisa disuntik dengan volume sampai 0,5 ml, dan keduanya inokulum
ajuvan dan partikulat dapat digunakan.

Intradermal

Injeksi intradermal (id) digunakan cukup umum untuk imunisasi hewan yang lebih besar Seperti injeksi
im, suntikan id digunakan untuk member tingkat pelepasan immunogen yang sangat lambat. Inokulum
disuntikkan antara lapisan kulit dan perlahan diserap ke dalam tubuh. Suntikan intradermal dapat
digunakan dengan partikulat dan adjuvant mengandung inokulum. Hanya volume injeksi kecil yang
bisa digunakan, jadi hanya injeksi saja cocok jika antigen tersedia dalam bentuk terkonsentrasi. Itu
normal praktek untuk mengirimkan suntikan ke beberapa situs. Prosedur membutuhkan lebih banyak
keterampilan daripada suntikan lainnya. Hal ini secara teknis sulit dilakukan dengan tikus kecil dan
jarang digunakan untuk tikus.

Intravena
Bagi kebanyakan hewan laboratorium suntikan intravena (iv) adalah obat yang praktis metode
penyampaian dorongan sekunder atau nanti. Jarang digunakan seperti untuk suntikan primer. Antigen
dikirim langsung ke dalam darah arus akan diproses dengan cepat oleh sistem retikuloendotelial,
terutama di hati, paru-paru, dan limpa. Injeksi direct iv membawa Risiko serius pada hewan inang,
karena dapat dengan mudah menginduksi pulmoner embolisme atau kejutan anafilaksis mematikan
pada hewan peka. Apa saja Bahan toksik hadir dalam inokulum, seperti endotoksin bakteri sangat
berbahaya saat menggunakan iv. Tidak aman atau pantas untuk menggunakan adjuvant Freund dengan
suntikan iv. Penyangga fisiologis dan Kondisi garam harus digunakan jika memungkinkan. Konsentrasi
deterjen seharusnya tidak boleh melebihi 0,1% untuk deterjen ionik atau 0,2% untuk nonionik.

intraperitoneal

Injeksi langsung ke dalam rongga peritonal (ip) sangat mudah dan sesuai dengan hewan pengerat kecil.
Antigen disuntikkan ke dalam peritoneum akan mengalir ke dalam limfatik toraks dan kemudian ke
vena cava. Partikulat antigen atau antigen pada adjuvant dapat diberikan dengan aman dengan rute ini
Berulang kali injeksi adjuvant Freund lengkap dengan ini rute akan menginduksi granuloma dan adhesi
berserat di dalam Rongga peritoneal yang bisa membuat gangguan limpa Sulit untuk produksi
hibridoma. Ini juga bisa menyebabkan produksi asites cairan dan bahkan plasmacytomas pada
beberapa hewan. cairan Asites induksi bisa menjadi manuver yang sangat berguna untuk mendapatkan
jumlah yang besar antisera tikus poliklonal. Hal itu bisa ditingkatkan dengan hati-hati sel injeksi sel
plasmacytoma .

Suntikan intraperitoneal tidak sering digunakan untuk menginokulasi kelinci. Karena ukurannya yang
lebih besar, rute lain seperti subkutan atau intramuskular biasanya digunakan.

BOOST

Peningkatan sel B yang membawa antibodi permukaan yang spesifik untuk Inokulasi antigen pertama
kali terdeteksi 5-6 hari setelah injeksi primer dari antigen Antibodi biasanya terdeteksi dalam serum
dari sekitar 7 hari setelah suntikan dan bertahan pada tingkat rendah selama beberapa hari, biasanya
mencapai titer puncak sekitar hari ke 10. Respon primer sering sangat lemah, terutama untuk mudah
diantisipasi, antigen terlarut. Dalam banyak kasus, priming yang efisien dapat terjadi tanpa adanya
produksi antibodi yang terdeteksi, jadi untuk tujuan praktis, tidak akan terjadi dari banyak nilai untuk
memantau respon ini.

Penundaan diperlukan sebelum memperkenalkan kembali antigen menjadi prima hewan. Minimal 2
atau 3 minggu dianjurkan, tapi tidak ada hukuman dalam meninggalkan interval jauh lebih besar. Tikus
dan kelinci akan tetap prima secara efektif setidaknya satu tahun setelah menerima injeksi yang
pertama. Respon terhadap suntikan kedua dari antigen yang sama secara dramatis berbeda. Jumlah sel
B yang memiliki sel permukaan antigen antibodi meningkat secara eksponensial setelah injeksi
sekunder, mencapai puncak antara hari ke 3 dan 4. Antibodi dalam serum juga terdeteksi pada saat ini
namun tingkat puncaknya biasanya tercapai sekitar hari 10-14. Biasanya, tingkat antibodi yang tinggi
tetap bertahan 2 - 4 minggu setelah injeksi kedua.

Respon terhadap suntikan ketiga dan injeksi selanjutnya secara luas itu dari injeksi sekunder. Titer
antibodi yang lebih tinggi tercapai, Tapi yang lebih penting lagi sifat dan kualitas antibodi yang ada
dalam serum berubah. Perubahan ini dikenal sebagai pematangan respon imun dan memiliki
kepentingan praktis yang cukup besar karena mereka menghasilkan sediaan antibodi afinitas tinggi.
Intervalnya antara suntikan sekunder, tersier, dan berikutnya mungkin juga terjadi bervariasi, tapi
biasanya perlu diperluas untuk memungkinkan tingkat sirkulasi antibodi sampai tetes cukup untuk
mencegah pembersihan yang cepat dari yang baru antigen yang disuntikkan