Artikel Penelitian

Aktivitas antikanker dari Ekstrak Buah Limonia acidissima Linn (Rutaceae) pada Sel
Kanker Payudara Manusia.

Debasish Pradhan1 *, GitanjaliTripathy1 dan Santosh Patanaik 2

1University Department of Pharmaceutical Sciences, Utkal University, Orissa751004, 2All Institut Ilmu Kedokteran India, New Delhi-01,

India

Abstrak

Tujuan: Untuk mengevaluasi aktivitas anti-kanker Limonia acidissima Linn (Rutaceae) yang
telah lama digunakan secara tradisional untuk berbagai penyakit infeksi dan ganas.

Metode: Ekstrak buah Limonia acidissima Linn diperoleh dengan cara maserasi sebanyak 3
kali dengan metanol dan kemudian dipekatkan pada tekanan rendah. Bioassay dari ekstrak
dilakukan untuk menilai aktivitas antikanker. Garis sel kanker payudara, SKBR3 dan MDA
MB435, digunakan untuk proliferasi sel in-vitro, uji viabilitas sel, dan analisis siklus sel dari
ekstrak.

Hasil: Bioassay dari ekstrak Limonia acidissima Linn. menunjukkan bahwa fraksi (fraksi 3)
dari ekstrak etanol memiliki aktivitas antikanker terhadap SKBR3 dan MDA-MB435 sel
kanker payudara manusia. Dosis efektif (ED50) Limonia acidissima Linn. fraksi 3 adalah
56,1 dan 30,6 μg / ml untuk SKBR3 dan MDA-MB435, masing-masing. Setelah 48 jam
paparan, fraksi ini (100 μg / ml) secara signifikan mengurangi proliferasi sel di kedua jalur
sel kanker. Dalam MDA-MB435 sel, analisis siklus sel menunjukkan bahwa fraksi 3
menginduksi akumulasi sel dalam fase G2 / M, tetapi tidak ada perubahan signifikan dalam
siklus sel yang terdeteksi pada sel SKBR3.
Kesimpulan: Hasil menunjukkan bahwa fraksi ekstrak dapat menginduksi penangkapan
siklus sel. Namun, penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk menilai mekanisme molekuler
dari aktivitas antikanker tanaman ini.

Kata kunci: Antikanker antivitas, Sel kanker payudara, Limonia acidissima Linn. , G2 / M
penangkapan
PENGANTAR

Kanker payudara adalah salah satu keganasan yang paling umum pada wanita di
seluruh dunia. Di India, kanker payudara adalah yang kedua untuk kanker serviks dalam
frekuensi, dengan perkiraan tingkat kejadian 17,2 per 100.000, dan telah meningkat di semua
bagian negara selama dekade terakhir [1]. Meskipun terapi kanker payudara biasanya
multimodal, obat sitotoksik masih memainkan peran penting dalam meningkatkan tingkat
kelangsungan hidup dan kualitas hidup [2]. Oleh karena itu, pengembangan dan pencarian
agen antikanker yang baru dan efektif menjadi sangat penting [3]. Sampai saat ini, banyak
agen sitotoksik termasuk produk alami yang diisolasi dari sumber tanaman telah diteliti untuk
penemuan obat antikanker baru yang potensial [4]. Tanaman yang lebih tinggi telah lama
terbukti menjadi sumber yang baik dan dapat diandalkan untuk pengembangan obat
antikanker baru. Di India, banyak tanaman telah digunakan dalam pengobatan tradisional
berbagai keganasan selama berabad-abad. Limonia acidissima Linn, syn. Feronia limonia
(Rutaceae) adalah pohon sulung berukuran sedang yang tumbuh di seluruh India. Buah-
buahan berkayu, kasar dan digunakan sebagai pengganti bael di diarrheoa dan disentri [6,7].
Kulit dan daun tanaman digunakan untuk kondisi vata dan pita yang terganggu, sedangkan
buah digunakan untuk mengobati tumor, asma, luka, debilitas jantung dan hepatitis. Buah
mengandung flavonoid, glikosida, saponin dan tanin [5]. Beberapa coumarin [4,5] dan
turunan tyramine [6] juga telah diisolasi dari buah limonia. Daun dilaporkan memiliki
aktivitas hepatoprotektif [8] sementara kulit buah mengandung senyawa antifungal, yaitu,
psoralene, xanthotoxin, 2, 6-dimethoxybenzoquinone dan osthenol [9]. Namun, properti
antikanker tanaman ini belum diselidiki. Oleh karena itu, ini mendorong kami untuk
menyelidiki efek penghambatan ekstrak buah tanaman ini pada pertumbuhan dua sel kanker
payudara yang berbeda, SKBR3 dan MDA-MB435.
EKSPERIMENTAL
Bahan Tanaman Dan Prosedur Ekstraksi.
Buah matang dari Limonia acidissima Linn. dikumpulkan dari hutan bukit
Bhubaneswar yang terletak di bagian timur India pada bulan Mei dan diidentifikasi oleh Dr
SK Sahu, seorang ahli taksonomi di Utkal University, Vanivihar, Orissa, India. Spesimen
voucher (no. 161) disimpan di herbarium Departemen Botani, Universitas Utkal. Buah-
buahan dipotong kecil-kecil dan ampasnya dipisahkan. Bubur itu kering teduh, digiling dan
serbuk (1,5 kg) dimaserasi tiga kali (selama 7 hari masing-masing) dengan 15 L dari 95 %%
etanol pada suhu kamar [6]. Ekstrak dipekatkan pada tekanan rendah, pada 60 0C
menghasilkan hasil gabungan 80,5 g. Ekstrak (35 g) dilarutkan dalam air suling (100 ml) dan
15 ml kolom larutan dikromatografi, dikeringkan kering menggunakan kolom gelas (diameter
dalam 4 cm, panjang 60 cm), disetimbangkan dengan air (100 ml) dan disonikasi. selama 15
menit dalam mandi ultrasonik. Proses aliran rinci diilustrasikan pada Gambar 1. Suspensi
disentrifugasi pada 20.000 rpm (sekitar 42.000 g) selama 30 menit dan kemudian diterapkan
ke kolom Diaion® HP-20; eluen dikumpulkan untuk mendapatkan fraksi yang larut dalam air
(fraksi 1). Endapan dilarutkan dalam metanol-air (1: 1, 100ml) dan 90% metanol (150 ml)
untuk mendapatkan fraksi 2 dan 3, masing-masing. Setiap supernatan berulang kali
diperlakukan seperti yang dijelaskan di atas. Endapan dilarutkan dalam etil asetat untuk
mendapatkan fraksi 4. Komposisi kimia dari setiap fraksi dipantau pada TLC menggunakan
silika gel GF254 Alufolien (Merck) dan dikembangkan dengan kloroform / etanol (90:10, v /
v). Phytosteryl glucoside digunakan sebagai referensi. Setelah mengembangkan mereka, TLC
disemprotkan dengan asam anisaldehida-sulfur dan dipanaskan dalam oven pada 100 ° C
selama 1 - 2 menit.
Gambar 1: Fraksinasi dipandu bioaktif dari ekstrak buah Limonia acidissima dengan
kromatografi kolom.

Persiapan ekstrak untuk percobaan antikanker

Ekstrak buah dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, Sigma, St. Louis, USA)
kecuali fraksi air (fraksi 1) yang dilarutkan dalam air. Untuk semua percobaan, konsentrasi
akhir dari senyawa yang diuji disiapkan dengan menipiskan stok dengan medium kultur.

Garis sel dan budaya

Garis sel kanker payudara, SKBR-3 (ATCC No. HTB-30) dan MDA-MB435
(ATCC No. HTB-129), diperoleh dari New Scientific Agencies, Bangalore, India. SKBR-3
adalah sel kanker payudara manusia dengan ekspresi berlebihan reseptor HER2 / neu dan
tanpa reseptor ER sementara garis sel kanker payudara MDA-MB435 tidak memiliki reseptor
ER dan ekspresi HER2 / neu [7]. Sel-sel dikultur dalam DMEM (Promo Cell, Jerman)
dilengkapi dengan 10% serum fetal janin yang tidak aktif (Promo Cell, Jerman) dan 1%
penicillin-streptomycin (Promo Cell, Jerman). Sel-sel diinkubasi pada 37 ° C dalam atmosfir
yang dilembabkan dengan 5% CO2.

Pengujian Proliferasi Sel

Pengujian proliferasi sel dilakukan dengan menyemai total 1 × 104 sel per sumur
dalam piring 96-well. Setelah 36 jam inkubasi, berbagai konsentrasi ekstrak buah
ditambahkan ke dalam sumur untuk memperoleh konsentrasi akhir masing-masing 1, 10, 100
dan 500 μg / ml. Kelompok kontrol dicampur dengan DMSO untuk mendapatkan konsentrasi
akhir 1%. Doxorubicin digunakan sebagai kontrol positif. Sel-sel diinkubasi untuk tambahan
48 jam, 50 μl MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (1 mg /
ml, Sigma) dalam saline buffer fosfat ( PBS) ditambahkan ke masing-masing dengan baik,
dan diinkubasi selama 4 jam pada 37 ° C. Media telah dihapus dan formazan dilarutkan
dalam DMSO dan kepadatan optik diukur pada 590 mm menggunakan pembaca bioassay
(Biorad, USA) [9].

Uji Viabilitas Sel

Sel-sel itu tersuspensi di piring 96-baik pada konsentrasi yang sama seperti yang
digunakan untuk uji proliferasi sel dan kemudian diinkubasi selama 24 jam pada 37 ° C
dengan 5% CO2. Berbagai konsentrasi ekstrak buah, seperti yang ditunjukkan di atas,
ditambahkan ke setiap sumur, dengan DMSO sebagai kontrol. Setelah 48 jam inkubasi, sel-
sel yang trypsinized dan penghitungan sel layak dilakukan dengan enumerasi sel-sel yang
tidak termasuk pewarna biru triptan menggunakan haemocytometer.

Analisis Siklus Sel

Untuk menentukan siklus sel, 1 × 106 sel disuspensikan dalam setiap kultur
jaringan dan diperlakukan dengan ekstrak buah pada konsentrasi akhir 80 dan 160 μg / ml
untuk SKBR3. Untuk MDA-MB435, sel-sel diobati dengan ekstrak buah pada konsentrasi
akhir 60 dan 120 μg / ml. DMSO (1%) ditambahkan ke grup kontrol. Setelah perawatan
dengan ekstrak buah selama 48 jam, sel-sel dikumpulkan dan diinkubasi dengan reagen
seperti yang dijelaskan dalam protokol kit reagen DNA Cycle Test ™ Plus (Becton
Dickinson Immunocytometry System). Kandungan DNA sel diukur dengan flow cytometry
[10]. Semua sampel dianalisis dalam waktu 3 jam oleh FACS Carlibur menggunakan
perangkat lunak Cell Quest.
Analisis Statistik
Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Data untuk proliferasi sel dan uji
viabilitas dinyatakan sebagai rata-rata ± standar deviasi. Nilai ED50 dihitung dengan analisis
regresi. Nilai p <0,05 dianggap signifikan.

Hasil
Fraksi etanol mengungkapkan delapan band. Tiga pita berwarna kuning-oranye
dengan nilai Rf 0,12, 0,25 dan 0,30. Lima band berwarna biru-violet dengan nilai Rf 0,17,
0,38, 0,41, 0,56 dan 0,61. Senyawa referensi biru ungu muncul pada nilai Rf dari 0,17.
Penghambatan pertumbuhan oleh ekstrak buah pada sel kanker payudara manusia
ditunjukkan pada Gambar 2. Pada 48 jam, nilai-nilai ED50 dari fraksi 3 adalah 56,1 ± 3,8 dan
30,6 ± 1,5 μg / ml untuk SKBR3 dan MDA-MB435, masing-masing. Karena fraksi 3
ditemukan memiliki efek pertumbuhan penghambatan pada garis sel ini, fraksi ini digunakan
untuk menyelidiki lebih lanjut efek dari ekstrak buah pada sel-sel ini.

Pengaruh Ekstrak Pada Viabilitas Sel

Hasilnya menunjukkan bahwa pada konsentrasi 100 μg / ml, kedua garis sel
menunjukkan viabilitas rendah <50% dibandingkan dengan kelompok kontrol. Tidak ada
penghambatan sel yang diamati pada 10 μg / ml.