TDP-L-dihydrostreptose: streptidine-6-phosphate dihydrostreptosyltransferase, suatu enzim

dimasukkan dalam biosintesis streptomisin, telah dimurnikan dari Streptomyces griseus ke dekat

homogenitas dengan prosedur enam langkah yang melibatkan kromatografi pada streptidin-6-fosfat -

Sepharose. Dengan penyaringan gel M yang tampak, dari enzim ditemukan sekitar 63000

subunit M, ditemukan pada gel natrium dodecylsulfate sekitar 35000. Transferase tergantung pada

Ion Mn2 + atau Mg2 +. Co2 + sama efektifnya dengan Mg2 +. Dari substrat yang diuji hanya streptidine

6-fosfat adalah akseptor untuk dihydrostreptose dalam sintesis 0-a-L-dihydrostreptose (1 + 4) -

streptidin 6-fosfat. Tidak ada aktivitas yang ditemukan dengan streptidine, 2-deoxystreptamine dan 4-
deoxy-

streptamin.

Aktivitas transferase dalam proses fermentasi berjalan paralel dengan aktivitas

dTDP-dihydrostreptose synthase dan mencapai maksimum setelah sekitar 50 jam fermentasi, baru saja

sebelum penampilan streptomisin dalam medium.

Menurut bukti eksperimental yang tersedia

perakitan molekul streptomisin dapat ditingkatkan

diperlihatkan untuk memasukkan langkah-langkah berikut [l]: (a) transfer

dari dihydrostreptose menjadi streptidine 6-phosphate terbentuk

0-a-L-dihydrostreptose (1 - + 4) streptidine 6-fosfat

(Gbr. 1) [2]; (B) transfer N-metil-L-glukosamin ke

pseudodisaccharide dengan pembentukan dihydro-

streptomisin 6-fosfat; (c) oksidasi dihydro-

streptomisin 6-fosfat menjadi streptomisin 6-fosfat

phate [3]; (D) hidrolisis streptomisin 6-fosfat

untuk streptomisin.

Sehubungan dengan reaksi [a] kami baru-baru ini melaporkan

pada transfer enzimatik dihydrostreptose

bagian dari dTDP-dihydrostreptose menjadi streptidine

6-fosfat [2]. Produk transferase ini adalah

aksi diidentifikasi sebagai 0-a-L-dihydrostreptose (1 -

streptidine 6-fosfat (Gbr. 1). Kami sekarang ingin

melaporkan pemurnian dihydrostreptosyl

transferase dari Streptomyces griseus dan beberapa

sifat-sifat enzim ini.

MATERIAL DAN METODE

Material

Glukosa dTDP- [U-14C] (227 Ci / mol) dibeli

dari ICN (Irvine, California). [Y- ~~ PIATP (2.34 Ci /

mmol) diperoleh dari Pusat Radiokimia,

Amersham. Streptomycin dibeli dari Sigma

(Munchen) dan kanamisin dari Serva (Heidelberg).

Streptidine sulfat diperoleh dari streptomisin

oleh hidrolisis [4] dan direkristalisasi dari diasamkan

air. Streptamine sulfate diperoleh secara alkali

hidrolisis streptidin sulfat [6]. 2-Deoxystrepta-

tambang saya diperoleh dari kanamisin dengan hidrolisis [5a].

4-Deoxystreptamine [7] adalah hadiah dari H. Prinzbach

(Institut Kimia, Freiburg).

Streptomycin 6-kinase dan streptomycin-6-phos-

fosfatase phate sebagian dimurnikan menurut

to Walker [8,9] dengan modifikasi berikut:

(a) Sel Streptomyces griseus digunakan; (b) MnClz

presipitasi digantikan oleh presipitasi dengan poli-

(etilenaimin) seperti yang dijelaskan dalam prosedur pemurnian

masa transferase; poli akhir (ethy1eneimine)

konsentrasi adalah 0,2% (b / v).

Streptidine-6-fosfat - Sepharose disiapkan

dengan cara berikut: 10 ml streptidin 10 mM. HC1

dalam 0,1 M buffer natrium borat (pH 11,5) diguncang

pada 40 "C selama 16 jam dengan 5 ml Sepharose yang diaktifkan epoksi

(Pharmacia, Freiburg) dan konjugat dicuci ac-

sesuai dengan manual pabrik (Pharmacia

1974). Untuk fosforilasi, suspensi strepti

makan - Sepharose diaduk selama 5 jam pada 22 "C dalam 50 ml

gelas dengan 3 ml streptomisin 6-kinase, 10 ml 0,1 M

ATP, dan 10 ml 0,2 M MgCl2 dalam 0,5 M Tris-HC1

(pH 8,5). Suspensi kemudian dicuci dengan air.

Untuk fosforilasi enzimatik streptidine menjadi

streptidine 6-fosfat campuran berikut ini

diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 8 jam: 40 ml streptomisin 6-kinase,

0,25 mmol streptidine. 2 HC1, 0,5 mmol ATP, 1 mmol

MgC12 dan 0,5 M glisin / NaOH (pH 8,8) secara total

volume 110 ml. Setelah 8 jam endapan 44,1 mg

(0,12 mmol) kristal streptidine 6-fosfat

dikumpulkan dengan filtrasi. Selain filtrat

0,25 mmol streptidine. 2 HC1 dan 0,5 mmol ATP dipimpin

setelah inkubasi 8 jam ke 62 mg (0,17 mmol) lainnya

streptidin 6-fosfat.

S. griseus strain N 2-3-1 1 dari Kaken Chem. Bersama,

(Tokyo) ditanam seperti yang dijelaskan sebelumnya dalam 12 1

fermentor [lo] selama 45 jam. Sel-sel pertama kali dicuci

dua kali dengan 1 M KCl untuk menghapus protease [3] lalu

dua kali dengan isotonik NaCl. Sel-sel kemudian dibekukan

- 20

Preincuhasi untuk Pembentukan dTDP-4-keto- ~ -

rhamnose. 3,53 nmol dTDP- ~ - [U- '~ C] glukosa (1 pCi)

dan ekstrak 150 p1 S. aureofaciens [11] dalam volume total

400 pl 50 mM buffer natrium fosfat, pH 7,5,

mengandung 30% (vol.) gliserol, 5 mM merkapto-

etanol dan 1 mM EDTA, diinkubasi selama 1 jam

pada 30 ° C. Solusinya kemudian ditambahkan segera

ke preinkubasi kedua.

Preinkubasi Kedua untuk Sintesis dTDP-L-

dihydrostreptose. 700 p1 ekstrak bebas sel dari S. griseus

[ll] dalam 50 mM Tris-HC1, pH 7,8, mengandung 10%

(berdasarkan volume) gliserol, 5 mM mercaptoethanol dan 1 mM

EDTA, bersama dengan 1,2 pmol NADPH diinkubasi

tertahan dalam volume total 800 pl selama 30 menit pada 30 "C.

Untuk menghilangkan protein, campuran inkubasi adalah

kemudian dipindahkan ke kerucut membran Centriflo (Amicon

Corp, Lexington, A.S.) dan disentrifugasi selama 30 menit

pada 1000 x g. Filtrat bebas protein dianalisis untuk

isi dihydrostreptose [11] dan disimpan pada - 20 "C.

Aliquots (50 pl) dari solusi ini digunakan untuk

uji transferase.

Transferase Assay. Campuran campuran inkubasi

tained: 50 p1 (0,055 nmol, 25 000 hitungan / mnt) dTDP-

[U-14C] - ~ -dihydrostreptose, 25 p1 (8,34 nmol) strep-

tidine 6-fosfat dalam 20 mM Tris-HC1 (pH 8.0),

10,5 mM EDTA, 62,5 mM MgC12, dan enzim dalam a

total volume 125 pl. Setelah inkubasi 5 - 10 menit di

0 "C reaksi dihentikan dengan penambahan 40 p1

asam asetat dan protein terdenaturasi dihilangkan oleh

sentrifugasi. 100 pl supernatan saat itu

diterapkan pada cakram fosfoselulosa (Serva, Heidel-

berg). Setelah 3 menit disc dicuci tiga kali

dengan 20 ml air di bawah hisap dan kemudian dipindahkan

ke gelas dengan air 50ml, di mana itu dicuci

10 menit lagi. Disk kemudian dirawat selama 5 menit

dengan 10 ml aseton dan dikeringkan pada suhu 90 ° C selama 10 menit.

Disk dihitung dalam cairan sintilasi toluena.

Sistem Penyangga

Buffer berikut digunakan dalam enzim

pemurnian: (A) 50 mM Tris-HC1 (pH 7,8 pada 0 "C)

mengandung 5 mM mercaptoethanol, 1 mM EDTA,

2,5 mM streptidine. 2 HC1 dan 10% (v / v) gliserol.

(B) Buffer A tetapi hanya mengandung 0,05 mM EDTA.

(C) 20 mM Tris-HC1 (pH 7,8 pada 0 "C) mengandung 5 mM

mercaptoethanol, 1 mM EDTA dan 10% (v / v) gliserol.

(D) 50 mM Tris-HC1 (pH 7,8 pada 0 "C) mengandung 5 mM

mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 5 mM streptidine

. 2 HCl, 120 mM KCl dan 10% (v / v) gliserol.

Pemurnian Dihydrostreptosyltransferase

180 g sel beku S. griseus ditangguhkan di

150 ml buffer A dan 6 ml 50 mM phenylmethane-

sulfonil fluorida dalam isopropanol ditambahkan di bawah