LABORATORIUM ANALITIK DASAR

SEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2018 /2019

PRAKTIKUM KIMIA KROMATOGRAFI

Modul : High Performance Liquid
Cromathography (HPLC)

Pembimbing :

Praktikum : 8 Mei 2019

PenyerahanLaporan : 15 Mei 2019

Oleh :

Kelompok : I (Satu)

Nama : 1. Jihaan Amadea (1714310)

2. Ramia Mira (1714310)

3. Sisi Marliani (171431027)

4. Siti Atika Mayapramesti ( 171431028)

2A – Analis Kimia

PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA
POLITEKNIK NEGERI BANDUNG
TAHUN 2019
Tujuan Praktikum :

1. Mengetahui teori–teori tentang HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)

2. Mengetahui prinsip dasar kerja HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)
3. Mengetahui cara mengoperasikan HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)
Dasar Teori
1. Pengertian HPLC
Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan
tekanan tinggi.

2. Jenis-jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih
polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non
polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain
klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
b. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi
kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase
diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda,
karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.
c. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika
adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
 oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
d. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau
kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
e. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
f. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
 medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran
ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
g. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang
sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik
tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.

1. Komponen dasar dan bagian-bagian HPLC

Terdapat 5 komponen dasar HPLC yaitu:
a. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan
resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase
gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan
 dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara
bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel
mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan
untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan
metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase
normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut
jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan
fase terbalik
b. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon,
dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3
mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan
pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan
tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
c. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.
d. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
 lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril)
lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan.
e. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

 Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

 Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil.
 Stabil dalam pengopersiannya.
 Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita.
 Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier).
 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik
detektor seperti berikut :
 Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik
(g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling sering
-10 5
Spektrofotometer 5 x 10 10 digunakan, selektif terhadap
spektrometerphoto- > 2 x 10-10 105 gugus-gugus dan struktur-
diode array struktur yang tidak jenuh.
-12 4
Fluoresensi 10 10 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka terhadap
perubahan suhu dan kecepatan
alir fase gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan
tetapi sensitivitasnya sedang.
Sangat sensitif terhadap suhu,
dan tidak dapat digunakan pada
elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan suhu
-12 5
Amperometri 10 10 dan kecepatan alir fase gerak,
tidak dapat digunakan pada
elusi bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut ionik.
Sensitifitas sangat bagus,
selektif tetapi timbul masalah
dengan adanya kontaminasi
elektroda.

2. Derivatisasi pada HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk
mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC
adalah untuk:

a. Meningkatkan deteksi.
b. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak
kromatografi yang lebih baik.
c. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik.
 d. Menstabilkan analit yang sensitif.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga
banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang
akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan
suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga
dapat dideteksi dengan fluorometri.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang
dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat
membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses
derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil
derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk
derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.
Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat

dengan UV-Vis dideteksi dengan
Fluoresen
Asam-asam p-nitrobenzil-N,N’- 4-bromometil-7-
kaboksilat; asam- diisopropilisourea (PNBDI); 3,5- asetoksikumarin;
asam lemak;asam- dinitrobenzil-N,N’- 4-bromometil-7-
asam fosfat diisopropilisourea (DNBDI); p- metoksikumarin;
bromofenasil bromida (PBPB)
Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC); 4-
dimetilaminiazobenzen-4-
sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-
naftilisosianat (NIC-1).
Aldehid; keton p-nitrobenziloksiamin Dansil hidrazin
hidroklorida (PNBA); 3,5-
dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin primer Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
 Amin primer (1o) 3,5-dinitrobenzil klorida 7-kloro-4-nitrobenzo-2-
o
dan sekunder (2 ) (DNBC);N-suksinimidil-p- oksa-1,3-diazol (NBD-
nitrofenilasetat (SNPA);N- Cl); 7-fluoro-4-
suksinimidil-3,5- nitrobenzo-2-oksa-1,3-
dinitrofenilasetat (SDNPA); 4- diazol (NBD-F); Dansil
dimetilaminiazobenzen-4- klorida
sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-
naftilisosianat (NIC-1).
Asam-asam amino 4-dimetilaminiazobenzen-4- Fluoresamin
(peptida) sulfinil (Dabsil-Cl) o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-2-
oksa-1,3-diazol (NBD-
Cl); 7-fluoro-4-
nitrobenzo-2-oksa-1,3-
diazol (NBD-F);

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column

derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).

3. Prinsip dasar HPLC

Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun
prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam
kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa
kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan
dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang
gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder
yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal computer
(PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

4. Prinsip kerja HPLC

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala
polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan
eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.
a. Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa
mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini
meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
b. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom
menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda
pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada:
 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut).
 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga
pada ukuran partikel).
 Komposisi yang tepat dari pelarut.
 Temperatur pada kolom
c. Detector
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan
serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV
dari beberapa panjang gelombang.
 Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa
tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu
d. Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-
masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui
detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi
kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh

.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang
melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar
komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar
(sangat sederhana).
5. Kegunaan dari HPLC
Kegunaan HPLC antara lain:
a. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
b. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
c. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
d. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
e. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
f. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
g. Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

6. Kelebiha dan Kekurangan

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi.
a. Kelebihan dari alat HPLC antara lain:
 Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah
yang tinggi.
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
 Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
 Kolom dapat digunakan kembali.
 Waktu analisa cukup singkat.
 HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.
 Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
 Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

b. Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

 Harga sebuah alat HPLC cukup mahal
 Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
Alat dan Bahan
Alat Bahan
HPLC Larutan Benzol p.a
Larutan
Larutan

Langkah Kerja
Standar Operating Procedures (SOP) HPLC 1200
1. MENGAKTIFKAN HPLC
1. Nyalakan UPS
2. Nyalakan komputer dan monitor
3. Nyalakan HPLC tekan tombol power pad kiri bawah masing-masing module, mulai dari
Degasser, Pompa, Detector
4. Pada desktop klik dua kali pada Instrument 1 Online atau Start – Program – Agilent
ChemStations – Instrument 1 Online
5. Klik tombol On pada sudut kanan bawah, tunggu sampai ready atau Menu Instrument, pilih
System On
2. CONDITIONING HPLC
1. Ubah flow secara bertahap sampai diperoleh flow yang diinginkan. Klik View – Method &
Run Control – Instrumen – Set Up Pump - Control – Flow
(0,00;0,10;0,25;0,50;0,75;1,00;1,25;1,50;1,75;2,00ml/min)
2. Buka Purge Valve dengan memutar kekiri (Tekanan akan turun, karena terbuang ke Waste (±10
menit, flow 1 mL/menit)
3. Turunkan Flow rate sampai 0,2 kemudian tutup kembali Purge Valve (Tekanan akan naik, karea
solvent masuk ke sistem)
4. Naikkan Flow secara bertahap hingga tercapai flow sesuai dengan metode.
5. Apabila akan menambah atau mengganti mobile phase, turunkan flow secara bertahap
6. Ubah tampilan isi botol
7. Biarkan sistem sampai stabil, hingga baseline rata
8. Klik kiri Pump – Set Up Pump :
Atur parameter : - Flow dengan menaikkannya secara bertahap
- % Komposisi Solvent
- Stop time, Post time
- Pressure Limit, Minimum dan Maximum
- Time Table untuk metode gradient
9. Atur hasil report dengan cara : Report – Specify Rreport – OK
10. File – Print Preiew – Report untuk melihat hasil reportnya
11. Save method dengan cara : File – Save – Methode – Isikan Comment Kalau Perlu – OK
3. MEMATIKAN HPLC
1. Setelah analisa sample, sebelum dumatikan sebaiknya HPLC diflushing dengan mobile phase
selama ± 30 menit
2. Turunkan flow secara bertahap sampai diperoleh flow 0 ml/min: Klik Set Up Pump atau View –
Method & Run Control – Instrumen – Set Up Pump - Control – Flow
(0,00;0,10;0,25;0,50;0,75;1,00;1,25;1,50;1,75;2,00ml/min)
3. Load method : File - Load – Method – DEF_LC.M
4. Klik tombol off pada sudut kanan bawah
5. Close program Instrument 1 Online
DAFTAR PUSTAKA
https://news.labsatu.com/mengenal-hplc-dan-prinsip-kerjanya/
https://www.academia.edu/10200264/MAKALAH_HPLC_High_Performance_Liquid_Cromathography_