LABORATORIUM BIOPROSES

SEMESTER GANJIL TAHUN AJARAN 2018/2019

PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
MODUL : Penentuan Kinetika Reaksi Enzimatis α Amilase dan
Glukoamilase terhadap substrat larutan pati
PEMBIMBING : Tri ReksaSaputra, S.Si, M.Si

Tanggal Praktikum: 19-26 Maret 2019

Tanggal Penyerahan: 2 April
Oleh2019
:
Oleh:
Kelompok : VI
Nama : 1. Sisi Marliani (171431027)
2. Siti Atika Mayapramesti (171431028)
3. Siti Fauziah (141424029)
4. Syahidah Ash-Shoffi (171431030)
5. Syifa Dhea Nisa (171431031)
Kelas : 2 Analis Kimia

PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA
POLITEKNIK NEGERI BANDUNG
2019
 BAB I

PENDAHULUAN

Tujuan Percobaan

1. Mengetahui nilai kecepatan reaksi maksimum dari α-amilase dan glukoamilase

dalam menghidrolisis pati jagung.
2. Mengetahui besarnya aktivitas enzim α-amilase dan glukoamilase terhadap substrat
pati jagung.

BAB II
LANDASAN TEORI

Enzim dan Kinetika Reaksi Enzim

Enzim atau bioatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan oleh sel. Enzim sangat
penting dalam kehidupan, karena semua reaksi metabolisme dikatalis oleh enzim. Jika tidak
ada enzim, atau aktivitas enzim terganggu maka reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga
pertumbuhan sel juga terganggu. Reaksi-reaksi enzimatis dibutuhkan agar bakteri dapat
memperoleh makanan/nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap kedalam sel,
memperoleh energi kimia yang digunanan untuk biosintesis, perkembangbiakan, pergerakan,
dan lain-lain. (Poedjiadi, 2006)

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah(Dwidjoseputro,

1992) suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, aktivator dan inhibito. Setiap enzim
dapat bekerja dengan efektifi pada suhu tertentu dan aktifitasnya akan berkurang jika berada
pada kondisi di bawah atau di atas titik tersebut. Kondisi yang menyebabkan kerja enzim
menjadi efektif ini disebut kondisi optimal. Sebagian besar enzim pada manusia mempunyai
suhu optimal yang mendekati suhu tubuh (35°C-45°C). Pada suhu tinggi (< 50°C), enzim dapat
rusak dan pada suhu rendah (0°C), enzim menjadi tidak aktif. Suhu yang tidak sesuai tersebut
akan menyebabkan terjadinya perubahan bentuk sisi aktif enzim. Sifat enzim yang tidaktahan
panas atau dapat berubah karena pengaruh suhu ini disebut termolabil. (Dwidjoseputro, 1992).

Selain suhu, faktor lingkungan yang mempengaruhi kerja enzim adalah derajat keasaman (pH).
Sebagaimana faktor suhu, enzim juga mempunyai pH tertentu agar dapat bekerja secara efektif.
Enzim dapat bekerja optimal pada pH netral (pH=7), pH basa, atau pH asam tergantung pada
jenis enzim masing-masing.
Enzim pencerna protein misalnya, mempunyai pH paling optimal 1-
2, sedangkan enzim pencernaan yang lain mempunyai pH optimal 8. Pada pH tertentu, enzim
dapat mengubah substrat menjadi hasil akhir. Kemudian, apabila pH tersebut diubah, enzim
dapat mengubah kembali hasil akhir menjadi substrat. (Dwidjoseputro, 1992).

Gambar 2. Pengaruh pH terhadap fungsi enzim

Kadar enzim yang tinggi akan mempengaruhi kecepatan reaksi secara linier (kecepatan
bertambah konstan). Dapat dikatakan bahwa hubungan antara konsentrasi enzim dengan
kecepatan reaksi enzimatis berbanding lurus. Kecepatan reaksi suatu enzim satu dengan
yang lain berbeda-beda meskipun mempunyai konsentrasi enzim yang sama. Konsentrasi
enzim yang sangat tinggi dalam suatu sistem yang kompleks akan berpengaruh terhadap
terhadap kecepatan reaksi.(Dwidjoseputro, 1992).

Pada konsentrasi substrat yang rendah, kenaikan substrat akan meningkatkan kecepatan reaksi
enzimatis hampir secara linier. Jika konsentrasi substrat tinggi, maka peningkatan kecepatan
reaksi enzimatis akan semakin menurun sejalan dengan peningkatan jumlah substratnya.
Kecepatan maksimum (v maks) reaksi enzimatis ditunjukan dengan garis mendatar yang
menggambarkan peningkatan kecepatan yang rendah seiring penambahan substrat.
(Dwidjoseputro, 1992).
Zat-zat kimia tertentu dapat memacu atau mengaktifkan kegiatan enzim. Contoh : garam-garam
dari logam alkali dan logam alkali tanah dengan konsentrasiencer,
ion kobalt (Co), mangan (Mn), nikel (Ni), magnesium (Mg), dan klor (Cl). Sedangkan inhibisi
aktifitas enzim adalah penurunan kecepatan suatu reaksi enzimatik yang dalam makhluk hidup
penting pada proses metabolisme. Pada keadaan tertentu suatu reaksi enzimatik dapat ditujukan
hanya pada suatu produk, sedangkan pembentukan produk
yang lain tidak dipengaruhi atau malah di tingkatkan. Inhibitor adalah zat yang dapat
meghambat kerja enzim. Berdasarkan tempat kerjanya, inhibitor terbagi atas, reaksi inhibitor
dengan apoenzim, reaksi inhibitor dengan koenzim, reaksi inhibitor dengan kofaktor, reaksi
inhibitor dengan bentuk kompleks enzim.

Mekanisme

Enzim dapat bekerja dengan beberapa cara, yang kesemuaannya menurunkan ΔG :

 Menurunkanenergi aktivasi dengan menciptakan suatu lingkungan yang mana keadaan

transisi terstabilisasi (contohnya mengubah bentuk substrat menjadi konformasi keadaan
transisi ketika ia terikat dengan enzim.)
 Menurunkan energi keadaan transisi tanpa mengubah bentuk substrat dengan menciptakan
lingkungan yang memiliki distribusi muatan yang berlawanan dengan keadaan transisi.
 Menyediakan lintasan reaksi alternatif. Contohnya bereaksi dengan substrat sementara
waktu untuk membentuk kompleks enzim-Substrat antara.
 Menurunkan perubahan entropi reaksi dengan menggiring substrat
bersama pada orientasi yang tepat untuk bereaksi. Menariknya, efek entropi inimelibatkan d
estabilisasi keadaan dasar, dan kontribusinya terhadap katalis relatif kecil. (Anonim1, 2015)

Tanpa bantuan enzim, semua bahan makanan yang masuk ke dalam tubuh hanya sekedar
numpang lewat. Enzim merupakan komponen penting yang diperlukan untuk proses
pencernaan dan penyerapan makanan. Kini pemahaman masyarakat mengenai enzim
pencernaan dan fungsinya masih sangat rendah. Umumnya masyarakat hanya mengaitkan
masalah pencernaan dengan penyakit maag. Enzim bertanggung jawab menjaga kesehatan dan
proses metabolisme di dalam tubuh.Kekurangan enzim dapat menyebabkan tubuh mengalami
gangguan pencernaan yang selanjutnya
menyebabkan gangguan penyerapan (malabsorpsi). Gejala malabsorpsi adalah kembung pada
perut, nafsu makan menurun, diare dan perut tidak nyaman. Salah satu solusi untuk mengatasi
masalah malabsosrpsi akibat kecurangan enzim adalah
denganmengkonsumsi suplemen enzim. Kecurangan enzim akan menyebabkan tubuh
mengalami gangguan pencernaan atau dalam istilah kedokteran disebut maldigesti, yang
selanjutnya dapat menyebabkan gangguan pencernaan atau malabsorbsi. Di sisilain, kecurangan
enzim juga akan mengakibatkan timbulnya gas yang berlebih didalam sistem
pencernaan, baik di lambung maupun usus halus dan usus besar (Almatsier, 2003).

Kinetika reaksi enzimatis dapat digunakan untuk menentukan kadar enzim kinetika reaksi
enzimatis dapat diukur dengan mengukur jumlah substrat yang diubah atau produk yang
dihasilkan per satuan waktu, dan pada suatu waktu yang sangat pendek, atau pada satu titik
tertentu pada grafik disebut kecepatan sesaat (instantaneus velocity). Kecepatan sesaat
merupakan tangens dari garis singgung terhadap grafik pada suatu titik tertentu. Kecepatan
sesaat pada waktu mendekati nol, yaitu saat grafik masih berupa garis lurus disebut kecepatan
awal (Vo). Pada reaksienzimatis, jika disebut kecepatan, umumnya yang dimaksud adalah
kecepatan awal. Hal ini disebabkan karena pada keadaan awal reaksi, kita dapat mengetahui
kondisi/keadaan dengan lebih tepat. Disamping kecepatan sesaat dan Vo, juga dikenal istilah
kecepatan rata-rata, yaitu perbandingan antara perubahan jumlah substrat terhadap waktu
(Poedjiadi, 1994).

Reaksi enzimatis berlangsung melalui pembentukan kompleks enzim substrat (ES), bila semua
enzim dalam keadaan ES (sistem jenuh oleh substrat) maka laju reaksi akan mencapai nilai
maksimum (Vmaks). Kinetika enzim menginvestigasi bagaimana enzim mengikat substrat
dengan mengubahnya menjadi produk. Data laju yang digunakan dalam analisa kinetika
didapatkan dari asai enzim. Aktivitas enzim akan meningkat bersamaan dengan peningkatan
suhu, lalu berbagai proses metabolisme akan naik sampai batasan suhu maksimal. Prinsip
biologis utama adalah homeostatis, yaitu keadaan dalam tubuh yang selalu mempertahankan
keadaan normalnya. Perubahan relatif kecil saja dapat mempengaruhi aktifitas banyak enzim.
Adanya inhibitor non kompetitif irreversibel dan antiseptik dapat menurunkan aktifitas enzim.
Kecepatan reaksi mula-mula meningkat dengan menaiknya suhu, hal ini disebabkan oleh
peningkatan energi kinetik pada molekul-molekul yang bereaksi. Akan tetapi pada akhirnya
energi kinetik enzim melampaui rintangan energi untuk memutuskan ikatan hidrogen dan
hidrofobik yang lemah, yang mempertahankanstruktur sekunder-tersiernya. Pada suhu ini
terjadi denaturasi enzim menunjukkan suhu optimal. Sebagian besar enzim suhu optimalnya
berada diatas suhu dimanaenzim itu berada. Ada dua metode analisis kuantitatif kinetika reaksi
enzim, yaitu asas keseimbangan Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak (steady state
theory)Briggs-Haldone. Persamaan Michaelis-Menten merupakan persamaan kecepatan reaksi
enzimatis substrat tunggal yang menyatakan hubungan kuantitatif kecepatan reaksi awal (Vo),
kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) konsentrasi substrat [S], dan konstanta Michaelis-Menten
[Kw] (Murray, 2003).

Pada praktikum kali ini digunakan enzim amilase. Amilase diklasifikasikan sebagai
saccharidase (enzim yang memotong polisakarida). Amilase merupakan enzim pencernaan,
terutama dilakukan oleh pankreas dan kelenjar ludah. Fungsi utama dari enzim amilase adalah
untuk memecah pati dalam makanan sehingga mereka dapat digunakan oleh tubuh. Amilase
juga disintesis dalam buah tanaman selama pematangan, menyebabkan buah menjadi lebih
manis. Enzim amilase banyak digunakan dalam industri. Hal ini digunakan dalamindustri
pembuatan dan fermentasi bir untuk konversi patimenjadi gula terfermentasi. Pada industri
tekstil, amilase digunakan untuk merancang tekstil, kemudian pada industri deterjen, amilase
tercampur dengan enzim protease dan lipase sebagai pencuci noda pakaian dan dalam industri
makanan digunakan untuk pembuatan sirup manis, untuk meningkatkan konten diastase tepung,
untuk modifikasi makanan bayi, dan menghilangkan pati dalam produksi jelly. Amilase adalah
enzim yang mengkatalisis hidrolisis dari alpha-1,4- glikosidik polisakarida untuk menghasilkan
dekstrin, oligosakarida, maltosa, dan D-glukosa. Amilase bisa berasal dari hewan, jamur, dan
sumber tanaman. Pancreatin dan pancrelipase mengandung amilase yang berasal dari pankreas
hewan, pankreas biasanya babi. Amilase juga berasal dari malt barley dan jamur Aspergillus
oryzae (Wang, 2009).

Ada beberapa tipe amilase yang berbeda Enzim ini diklasifikasikan sesuai dengan cara
memotong ikatan glysosidic. Alpha-amilase menghidrolisis alpha 1,4-glikosidik, secara acak
menghasilkan dekstrin, oligosakarida dan monosakarida. Alphaamilase adalah endo-amilase.
Exoamylases menghidrolisis alpha 1,4- glikosidik linkage hanya dari nonpereduksi ujung rantai
polisakarida luar. Exoamylases termasuk beta-amilase dan glucoamylases (gamma-amilase,
amyloglu-cosidases) (Aiyer, 2005). Mekanisme kerja enzim α-amilase terdiri dari dua tahap,
yaitu : tahap pertama degadasi amilosa menjadi maltosa dan maltotriosa yang terjadi secara
acak. Degadasi ini terjadi sangat cepat dan diikuti dengan menurunnya viskositas dengan cepat.
Tahap kedua terjadi pembentukan glukosa dan maltosa sebagai hasil akhir dan tidak acak.
Keduanya merupakan kerja enzim α-amilase pada molekul amilosa. Pada molekul amilopektin
kerja α-amilase akan menghasilkan glukosa, maltosa dan satu seri α-limit dekstrin, serta
oligosakarida yang terdiri dari empat atau lebih glukosa yang mengandung ikatan α-1,6-
glikosidik (Winarno, 2010).Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengukur kadar glukosa
yang terbentuk dari reaksi enzimatis alfa alpha amilase dan mengukur kadar pati sisanya.

BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
Alat
1. Labu erlenmeyer 100 mL 10. Spatula
2. Gelas Kimia 250,500,1000 mL 11. Waterbath
3. Batang Pengaduk 12. Vortex
4. Gelas Ukur 100 mL 13. Hotplate
5. Pipet ukur 1, 5, 10 mL 14. Spektrofotometer visible
6. Pipet tetes 15. Timbangan
7. Corong gelas 16. Botol semprot
8. Tabung reaksi 17. Labu takar 10, 25 mL
9. Rak tabung reaksi
Bahan
1. Enzim : α-amilase, amyloglukosidase
2. Pati jagung
3. Larutan HCl 0,1N
4. Aquadest
5. Buffer fosfat sitrat pH 7
6. Glukosa
7. Pereaksi DNS (garam Na-K tartat, NaOH, aquadest, Dinitro Salisat)
8. Enzim : α-amilase, amyloglukosidase
9. Pati jagung
10. Larutan HCl 0,1N
11. Aquadest
12. Buffer fosfat sitrat pH 7
13. Glukosa
14. Pereaksi DNS (garam Na-K tartat, NaOH, aquadest, Dinitro Salisat)
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Persiapan
 Persiapan Pereaksi
- Membuat pereaksi DNS dengan cara menambahkan dinitrosalisilat, NaOH, dan garam
Na-K tartarat
- Membuat larutan buffer fosfat sitrat pH 7 dengan cara mencapurkan KH2PO4 dengan
asam sitrat hingga tercappai pH 7
- Membuat larutan HCl 0,1 N dibuat dengan cara mengecerkan larutan asam klorida
36%
 Preparasi Substrat Pati Jagung
Yaitu membuat 10 mL larutan substrat pati jagung 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% dalam
buffer fosfat sitrat pH 7 50 mL pada tabung reaksi
3.2.2 Tahapan Pelaksanaan
A. Pembuatan Larutan Standar Glukosa

Membuat 100 mL larutan induk glukosa 2000 ppm

Membuat larutan standar glukosa 200,400, 600, 800, 1000 ppm dengan
cara mengencerkan larutan induk glukosa 2000 ppm
B. Penentuan λmax dan Pembuatan kurva Larutan Standar Glukosa

tambahkan 3 mL DNS kedalam masing-masing 1 mL larutan standar

glukosa

panaskan campuran dalam air mendidih selama 5 menit

mengukur absorbansi larutan standar glukosa 600ppm

menggunakan spektrofotometer dengan variansi
panjang gelombang hingga didapatkan λmax

mengukur absorbansi larutan standar glukosa 200, 400, 600, 800, 1000 ppm
menggunakan spektrofotometer pada λmax yang telah didapatkan

membuat kurva larutan standar glukosa

C. Penentuan Vmax (kecepatan reaksi maksimum) dan KM (Konstanta Michaelis-

Menten) α-amilase
i. Tahap Reaksi Enzimatis

Memasukan 10 mL substrat pati jagung dengan konsentrasi yang telah ditentukan ke

dalam tabung reaksi

Menambahkan 0,2 mL α-amilase pada substrat

Menginkubasi campuran antara substrat dengan α-amilase pada

suhu 90-95°C dalam penangas air
ii. Penentuan Konsentrasi Glukosa Berdasarkan Metode Spektrofotometri

Melakukan sampling sebanyak 1 mL larutan enzim-substrat ke dalam labu

takar 10 mL setiap 10 menit

menandabataskan dengan aquadest

Mereaksikan 1 mL sampel dengan 3 mL pereaksi DNS dan

memanaskannya dalam air mendidih selama 5 menit

Mengukur absorbansi sampel pada λmax 540nm

menginterpolasikan nilai absorbansi ke dalam kurva larutan standar

glukosa hingga diperoleh nilai konsentrasi glukosa (ppm)

Melakukan hal yang sama untuk setiap konsentrasi

iii. Penentuan Vmax (kecepatan reaksi maksimum) dan KM (Konstanta

Michaelis-Menten)

Membuat kurva antara konsentrasi glukosa (ppm) terhadap waktu (menit)

menentukan nilai kecepatan reaksi (v) dari persamaan linear y= bx + a pada

masing-masing konsentrasi

membuat kurva antara 1/s terhadap 1/v

menghitung nilai Vmax dan KM dari persamaan linear kruva 1/s

terhadap 1/v
D. Penentuan Vmax (kecepatan reaksi maksimum) dan KM (Konstanta Michaelis-
Menten) Glukoamilase
i. Tahap Reaksi Enzimatis

Memasukan 10 mL substrat pati jagung dengan konsentrasi yang telah

ditentukan ke dalam tabung reaksi

Menambahkan 0,2 mL α-amilase pada substrat

Menginkubasi campuran antara substrat dengan α-amilase pada

suhu 90-95°C dalam penangas air selama 1 jam

Menurunkan suhu penangas hingga mencapai 60°C

Mengatur pH larutan hingga mencapai pH 4 dengan cara

menambahkan HCl 0,1N

Menambahkan 0,2 mL glukoamilase

Melakukan hal yang sama dengan penambahan

glukosa sebanyak 0,3 mL
ii. Penentuan konsentrasi Glukosa berdasarkan Metoda Spektrofotometri

Melakukan sampling sebanyak 1 mL larutan enzim-substrat ke dalam labu takar yang

telah ditentukan setiap 20menit untuk penambahan glukoamilase 02 mL serta 10 menit
untuk penambahan glukoamilase 0,3 mL

Menandabataskan dengan aquadest

Mereaksikan 1 mL sampel dengan 3 mL pereaksi DNS dan

memanaskannya dalam air mendidih selama 5 menit

Mengukur absorbansi sampel pada λmax 540nm

Menginterpolasikan nilai absorbansi ke dalam kurva larutan standar glukosa

hingga diperoleh nilai konsentrasi glukosa (ppm)

Melakukan hal yang sama untuk setiap konsentrasi

 iii. Penentuan Vmax (kecepatan reaksi maksimum) dan KM (Konstanta
Michaelis-Menten)

Membuat kurva antara konsentrasi glukosa (ppm) terhadap waktu (menit)

Menentukan nilai kecepatan reaksi (v) dari persamaan linear y= bx + a pada

masing-masing konsentrasi

Membuat kurva antara 1/s terhadap 1/v

Menghitung nilai Vmax dan KM dari persamaan linear kruva 1/s

terhadap 1/v

3.3 Keselamatan Kerja

Mengingat bahaya serta sifat bahan biologis yang digunakan, maka untuk keselamatan
kerja perlu diperhatikan hal-hal tersebut dibawah ini :
1. Praktikan wajib mengenakan alat keselamatan kerja a.l; lab-jas, masker, penutup
kepala, sarung tangan. Hal ini dilakukan agar mikroba yang akan dibiakkan tidak
terhirup.
2. Memperlakukan kultur mikroba harus hati-hati. Teknik aseptik harus dilakukan
dengan benar sehingga tidak terjadi kontaminasi khususnya bila mikroba yang
digunakan bersifat pathogen.
3. Menggunakan alat pembakar spirtus harus hati-hati untuk menghindari terjadinya
kebakaran.
4. Sebelum praktikum dimulai praktikan sangat disarankan sarapan dan minum susu.